水稻的分子標記方法
【專利摘要】水稻是最主要的糧食作物之一，也是重要的單字葉模式植物。基于栽培稻兩個亞種秈稻-粳稻的起源方式、分化過程、形成機制、遺傳多樣性分析以及秈稻-粳稻滲入系的鑒定等方面的研究一直是國內(nèi)外學者關(guān)注的科學問題，對于水稻的遺傳育種中優(yōu)良組合的選配、秈稻-粳稻雜種優(yōu)勢的利用等實際問題也具有重要的利用價值和研究意義。開發(fā)基于秈稻-粳稻差異的分子標記是解決這些科學問題的有力工具之一。
【專利說明】水稻的分子標記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]水稻的分子標記方法屬于分子生物學領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上重要的糧食作物，世界半數(shù)以上的人口以此為生。我國是秈稻和雜交稻的種植大國，水稻與小麥、玉米等禾本科作物在基因排列上具有同線性，目前已成為遺傳學和基因組研究的模式植物，因此進行水稻分子標記方法的研究，對提升我國農(nóng)作物育種水平和培育新品種具有重要意義，并將幫助全球解決食物問題。
[0003]水稻不僅是最主要的糧食作物之一，而且還是重要的模式植物之一，其相關(guān)的遺傳、發(fā)育、進化及其育種等研究一直備受科學家重視，研究內(nèi)容涉及到水稻的基礎(chǔ)及其應(yīng)用研究的各個方面，基于DNA多態(tài)性的分子標記因其具有的獨特優(yōu)越性而成為解決這些科學問題的有力工具之一。
[0004] 其優(yōu)越性體現(xiàn)在:①表現(xiàn)穩(wěn)定，多態(tài)性直接以DNA形式表現(xiàn)，無組織器官、發(fā)育時期特異性，不受環(huán)境條件、基因互作影響數(shù)量多，理論上遍及整個基因組；③多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無需專門人為創(chuàng)造特殊遺傳材料，這為大量重要性狀基因緊密連鎖的標記篩選創(chuàng)造了條件對目標性狀表達無不良影響，與不良性狀無必然連鎖部分標記遺傳方式為共顯性，可鑒別純合體與雜合體成本低，一般實驗室均可進行。對于特定探針或引物可引進或根據(jù)發(fā)表的特定序列自行合成。基于這些特點，分子標記現(xiàn)已被廣泛用于水稻有關(guān)功能基因標記、基因克隆、遺傳圖譜和物理圖譜的繪制、農(nóng)藝性狀的分子標記輔助選擇、生物進化、遺傳多樣性研究等許多方面研究。
[0005]利用分子標記技術(shù)分析生物個體之間DNA序列差別并用于作圖的研究始于1980年。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，現(xiàn)在的DNA標記技術(shù)已有十多種，

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]水稻是最主要的糧食作物之一，也是重要的單字葉模式植物?；谠耘嗟緝蓚€亞種秈稻-粳稻的起源方式、分化過程、形成機制、遺傳多樣性分析以及秈稻-粳稻滲入系的鑒定等方面的研究一直是國內(nèi)外學者關(guān)注的科學問題，對于水稻的遺傳育種中優(yōu)良組合的選配、秈稻-粳稻雜種優(yōu)勢的利用等實際問題也具有重要的利用價值和研究意義。開發(fā)基于秈稻-粳稻差異的分子標記是解決這些科學問題的有力工具之一。
[0007]1、基于雜交的分子標記
典型代表是DNA限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment lengthpolymorphism, RFLP),該技術(shù)是基于Southern雜交的分子標記的方法,是第一代分子標記。其基本原理是將不同個體基因組DNA用限制性內(nèi)切酶酶切后，與用放射性同位素標記或非同位素標記的DNA分子探針(RFLP標記)進行分子雜交，通過放射性自顯影等技術(shù)來顯示酶切片段的大小，從而檢測不同遺傳位點的等位變異(多態(tài)性)。RFLP標記呈共顯性，標記準確，不影響表型，數(shù)目也較多。但其需要的DNA量較大，分析程序復雜，技術(shù)難度大，需要同位素標記探針費時，成本較高。
[0008]2、基于PCR的分子標記
常見的包括RAPD (Random amplified polymorphic DNA),AFLP (Amplified fragmentlength polymorphism), SSR (simple sequence repeats,又稱 microsatellite)、SCAR(sequence-characterized amplified region)、STS(sequence-tagged site)、CAPS(cleaved amplified polymorphiic sequence)等。具體表現(xiàn)為:
(I)隨機擴增片段長度多態(tài)性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA)
以隨機引物進行PCR擴增的分子標記。隨機擴增多態(tài)性DNA (Random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD),是由Williams和Welsh同時于1990年發(fā)展起來的一項技術(shù)。該技術(shù)用短的(通常為10堿基)隨機序列DNA作為引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增而產(chǎn)生多態(tài)性。與其它技術(shù)相比，RAPD技術(shù)具有一些突出優(yōu)點:①操作簡便，實驗周期短，能在較短時間內(nèi)篩選大量樣品不必事先了解目的基因和片段序列；③所需樣品量極少，一次擴增僅需20-100 ng的模板DNA ;④引物具普遍適用性,商品化引物可應(yīng)用于不同生物的研究；⑤適應(yīng)于自動化操作和分析。由于具有以上優(yōu)點，RAro標記已被廣泛用于目的基因標記與定位、研究近緣種屬間的遺傳進化關(guān)系、構(gòu)建遺傳圖譜等研究中。但是RAPD技術(shù)存在兩個缺點，一是多數(shù)位點的標記表現(xiàn)顯性，不能提供完整的信息，另一方面是穩(wěn)定性及重復性差。RAPD作為一種初步篩選的方法，一旦發(fā)現(xiàn)所需要的DNA擴增產(chǎn)物，再用特異序列擴增的方法將RAPD標記轉(zhuǎn)化為SCAR標記。
[0009](2)限制性酶切與PCR擴增相結(jié)合產(chǎn)生的分子標記。AFLP (amplified fragmentlength polymorphism)即擴增片段長度多態(tài)性,是一種選擇性地擴增限制性片段的方法，該法先設(shè)計針對某種限制性內(nèi)切酶的通用接頭以及可與接頭序列和限制性酶切位點的序列配對的專用引物，用上述內(nèi)切酶消化基因組DNA，將通用接頭與限制性片段兩端連接，再用專用引物擴增，最后電泳顯示結(jié)果。顯然這種技術(shù)兼具RFLP和RAH)兩種方法的優(yōu)點，其接頭和引物適用于不同的生物類型，而且AFLP能提供比RFLP和RATO更多的特定基因的多態(tài)性信息。AFLP標記的多態(tài)性強，利用放射性標記在變性的聚丙烯酞胺凝膠上可檢測到100-150個擴增產(chǎn)物，非常適合繪制品種的DNA指紋圖譜及進行分類研究。
[0010](3)特異引物PCR擴增的分子標記。微衛(wèi)星(microsatellites )或簡單序列重復(simple sequence repeats, SSRs)又稱微衛(wèi)星 DNA (Microsatellite DNA)、短串聯(lián)重復序列(Short seqence repeats, STR),是由少數(shù)核甘酸(一般1-6個bp)為重復單位簇集而成的串聯(lián)重復序列，總長度為幾十到幾百個bp，隨機分布在整個水稻基因組的不同位置上。SSR標記是以PCR為基礎(chǔ)的分子標記，具有操作簡單、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強、共顯性等特點。尤其是隨著國際水稻全基因組測序計劃的完成，該標記又獲得了快速的發(fā)展。2002年，McCouch等開發(fā)出2240對新的水稻SSR分子標記。2005年，國際水稻基因組測序計劃研究認為，水稻基因組總共含有18828個SSR位點。該標記被廣泛應(yīng)用在水稻的數(shù)量性狀位點(QTL )的定位、基因圖位克隆和比較基因組學及分子標記輔助選擇育種等方面的研究，是目前應(yīng)用在水稻上最多的一類標記之一。
[0011](4)特異引物PCR擴增與限制性酶切相結(jié)合產(chǎn)生的分子標記。CAPS( cleavedamplified polymorphic sequences, CAPS)標記，即酶切擴增多態(tài)性序列，是特異引物PCR與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種DNA標記。其基本原理是根據(jù)特定的DNA序列去設(shè)計特異性的PCR引物，然后應(yīng)用這些引物進行PCR擴增；接著用專一性的限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切，最后通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態(tài)性。dCAPS( derivedcleaved amplified polymorphic sequences, dCAPS)是Neff 等在CAPS 基礎(chǔ)上發(fā)展的，是在CAPS標記的基礎(chǔ)上通過在擴增引物中引入錯配堿基而引入新的限制性內(nèi)切酶作用位點，經(jīng)過酶切電泳后產(chǎn)生和CAPS標記類似的多態(tài)性。CAPS標記可以由SCAR、STS、EST、SNP等多種標記延伸而來，并可以應(yīng)用 Blast Digester、SNP2CAPS、dCAPS Finder 2.0 (http:1l helix, wustl.edu /dcaps /dcaps.html)等多種軟件進行開發(fā)。目前,CAPS標記已被應(yīng)用在水稻基因定位與克隆、功能標記的發(fā)展、分子標記輔助選擇等方面。該標記具共顯性遺傳，穩(wěn)定性高，特異性強等優(yōu)點，但是檢測技術(shù)相對復雜，即先對擴增產(chǎn)物進行酶切后再行多態(tài)性檢測。
[0012]3、基于DNA序列和芯片的分子標記
主要包括表達序列標記(expressed sequence tags, EST),多樣性序列芯片技術(shù)(Diversity A rrays Technology, DArT),單核苷酸多態(tài)序列(single nucleotidepolymorphism, SNP),插入缺失長度多態(tài)性(insertion deletion length polymorphism,InDel)等。
[0013](I)EST標記。EST是長約300_400bp的基因表達序列片段。EST技術(shù)是從來源于不同組織和器官的cDNA文庫中大規(guī)模隨機挑選cDNA克隆，對其5’或3’端進行測序，所獲長約300-400bp的基因表達序列。EST序列的長度足以包含其所代表基因的必要信息，因此可以用EST特異性的標記基因。該序列與基因數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比較，從而獲得對生物體生長、發(fā)育、代謝、繁殖、衰落死亡等一系列生理生化過程認識的技術(shù)，它是以對DNA序列進行測序為核心的新型分子標記的代表之一。在全基因組測序尚未完成時，EST在鑒定基因、發(fā)現(xiàn)新基因、基因圖譜的構(gòu)建、利用EST進行大規(guī)模分析基因表達水平等方面起著重要的作用。EST的數(shù)量截止到2010年12月13日，公共數(shù)據(jù)庫NCBI中釋放不同物種的EST數(shù)量已經(jīng)達到52，858，766條，其中水稻的EST數(shù)量有25，019，080條。
[0014]EST途徑的不足之處在于通過隨機測序有時難以獲得低豐度表達和那些在特殊環(huán)境條件脅迫下誘導表達的基因。要彌補這些不足，必須開展全基因組測序。通過分析基因組序列，獲得基因結(jié)構(gòu)的完整/[目息，如基因在染色體上的排列順序，基因間的間隔結(jié)構(gòu)，啟動子的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子的分布等。
[0015](2) DArT標記。DArT標記是于2001年發(fā)明的一種新型分子標記技術(shù)[17]，它是依賴與芯片雜交來辨別不同基因組之間多態(tài)性的方法。DArT標記的特點是具有高通量低成本，一個陣列可同時檢測分布在基因組中的幾百個多態(tài)性位點；多態(tài)性DArT標記的發(fā)現(xiàn)和檢測是平行進行，新的標記發(fā)現(xiàn)和標記評價是在同一芯片上進行，無需發(fā)展進一步的評價體系；在標記的發(fā)現(xiàn)和檢測中不需要預先知道DNA序列信息，這就使得該法可應(yīng)用于DNA序列信息有或無的所有的物種，對于親緣關(guān)系稀少的孤立種質(zhì)材料更具有適用性；基因組變異可包括特定區(qū)域的栽培品種，也可覆蓋該種內(nèi)包括野生親緣種的遺傳變異，由DArT所揭示的多樣性可不斷地在以往的基礎(chǔ)上進行擴展，因此使用者可根據(jù)要求來確定DArT遺傳分析的范圍；該技術(shù)重復性穩(wěn)定，實驗可靠，受染色體倍數(shù)性和基因組大小的影響很??；DArT標記具有顯性和共顯性的特點，可克隆進行序列分析而發(fā)展為新的標記等等。
[0016](3) SNP分子標記。SNP被稱為第三代DNA遺傳標記。它是指由基因組水平上單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入或缺失等引起的DNA序列多態(tài)性。其廣泛出現(xiàn)在單拷貝DNA序列中，在大多數(shù)基因組中存在較高的頻率，在DNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)都能找到SNP，并且一些SNP標記是表型變異的直接原因。SNP數(shù)量豐富，遺傳穩(wěn)定性好，尤其是建立在DNA芯片技術(shù)上的大規(guī)模自動化檢測，使其具有更加廣泛的應(yīng)用前景。2002年水稻秈、粳兩個亞種的基因組序列草圖繪制完成，這為SNP的研究提供了極大的便利。Shen等利用生物信息學方法，通過比較水稻品種日本晴和93-11的全基因組序列的差異，構(gòu)建了日本晴和93-11全基因組DNA序列多態(tài)性數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含1703176個SNP和479406個InDel片段，平均每286個堿基就有一個SNP，每953個堿基就有一個InDel。
[0017]總的來說，目前SNP的研究重點還在于SNPs的發(fā)現(xiàn)，雖然在秈粳稻基因組序列中存在大量的SNPs，但這些SNPs只是基于代表兩個亞種的兩個具體的基因型獲得的，缺乏廣泛的代表性，這樣的SNP頻率常常會被高估。Jin等在亞種內(nèi)品種間SNPs數(shù)量可能比數(shù)據(jù)庫中的SNPs更 加少得多，在實際遺傳育種中，我們可能只是針對個別目標性狀的改良，利用的材料常常是親緣關(guān)系很近的育種材料，SNP頻率就會更加的低，發(fā)現(xiàn)與目標性狀緊密連鎖的SNPs的可能性就更小。因此在實際應(yīng)用中要精確地評價水稻中SNP的頻率，就要增加實驗材料的基因型數(shù)量，以獲取更多的DNA序列的數(shù)據(jù)作綜合比較。
[0018]目前制約SNPs應(yīng)用的另一個因素是SNP檢測技術(shù)還有待完善，雖然已經(jīng)實現(xiàn)了檢測技術(shù)的高度自動化和高效率，但實驗成本高昂，大大限制了 SNP標記技術(shù)的廣泛應(yīng)用。盡管SNP標記可以轉(zhuǎn)化為PCR或CAPS標記，但其工作量比其他分子標記未能減少，不能完全發(fā)揮SNP標記技術(shù)的優(yōu)越性。因此我們還需要繼續(xù)提高SNP檢測技術(shù)的自動化程度和檢測效率，降低檢測成本，同時大量發(fā)掘與水稻重要經(jīng)濟性狀或生理性狀相關(guān)聯(lián)的SNPs，使SNPs在水稻遺傳育種中發(fā)揮巨大作用。
[0019](4) Indel標記。Indel標記即插入缺失長度多態(tài)性。插入/缺失,指的是兩種親本在全基因組中的差異，相對另一個親本而言，其中一個親本的基因組中有一定數(shù)量的核苷酸插入，根據(jù)基因組中插入/缺失位點，設(shè)計一些擴增這些插入/缺失位點的PCR引物，由此產(chǎn)生PCR產(chǎn)物長度大小的差異即是InDel標記。同SNP標記一樣，InDel標記也是一類基于水稻基因組序列基礎(chǔ)上的新型分子標記。隨著大規(guī)模測序技術(shù)的發(fā)展以及日本晴、93-11等水稻亞種與廣東矮4號等品種基因組序列的完成，大大地促進了水稻InDel標記的發(fā)展與應(yīng)用。
[0020]與SSR標記相比，InDel標記具有在基因組中分布密度高、擴增帶型少、分離效果好、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點；較SNP標記而言，InDel標記具有檢測技術(shù)簡單、穩(wěn)定性高、經(jīng)濟而實用等優(yōu)點。跟其他分子標記一樣，InDel標記可被用于水稻相關(guān)基因的精細定位與作圖、基因克隆、分子標記輔助選擇育種等方面外，作為從水稻兩個亞種基因組序列開發(fā)的標記還有以下幾個應(yīng)用優(yōu)勢:水稻秈稻-粳稻的鑒定與品種的合理布局；水稻秈-粳遺傳分化與雜種優(yōu)勢分子機制研究；育種群體結(jié)構(gòu)與秈稻-粳稻滲入系的鑒定分析。
【權(quán)利要求】
1.與SSR標記相比，InDel標記具有在基因組中分布密度高、擴增帶型少、分離效果好、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點；較SNP標記而言，InDel標記具有檢測技術(shù)簡單、穩(wěn)定性高、經(jīng)濟而實用等優(yōu)點，跟其他分子標記一樣，InDel標記可被用于水稻相關(guān)基因的精細定位與作圖、基因克隆、分子標記輔助選擇育種`等。
【文檔編號】C12Q1/68GK103725760SQ201210382958
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月11日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:李靜