一種用于鑒別谷子品種的ssr分子標記方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于鑒別谷子品種的SSR分子標記方法及應用，屬于植物品種鑒 別技術領域。
【背景技術】
[0002] 谷子屬禾木科狗尾草屬作物，具有生育期短、耐旱、耐瘠等生理特性，廣泛分布于 亞歐大陸的溫帶和熱帶，是中國黃河中上游地區(qū)主要栽培作物之一。同時，谷子營養(yǎng)價值極 高，含有豐富的氨基酸、蛋白質、維生素以及媽、銅、鐵、鋅、硒、碘、鎂等微量元素，營養(yǎng)保健 作用也非常顯著。多年來，品種鑒定是以形態(tài)學標記為依據(jù)的。這種方法雖然簡單經濟，但 周期長，花費大，受季節(jié)限制，而且很多性狀的表現(xiàn)受栽培措施及環(huán)境因子影響，從而制約 了鑒定的準確性。DNA分子標記技術則具有高效、準確、不受環(huán)境條件影響、實驗操作簡單等 優(yōu)點，已廣泛應用于植物品種真實性鑒定及純度檢測研究。SSR標記是近年來發(fā)展起來的建 立在PCR基礎上的第二代分子標記。由于SSR分子標記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳共顯 性、譜帶擴增穩(wěn)定、精度高、檢測時間短、技術成熟等特點，已應用于作物遺傳學研究。

【發(fā)明內容】

[0003] 為解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種用于鑒別谷子品種的SSR分子標記方 法，采用的技術方案如下：
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于鑒別谷子品種的SSR分子標記方法，該方法是提 取谷子DNA，利用谷子DNA和5對SSR核心引物進行PCR擴增反應，電泳檢測后根據(jù)電泳檢 測結果鑒別谷子；所述5對SSR核心引物的核苷酸序列如SEQID NO. 1-10所示。
[0005] 優(yōu)選地，所述方法步驟如下：
[0006] 1)提取谷子DNA ;
[0007] 2)利用步驟1)所得谷子DNA和5對SSR核心引物進行PCR擴增反應，然后進行 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色；所述SSR核心引物，每對包括一個正向引 物和一個反向引物，5對SSR核心引物的核苷酸序列如SEQID NO. 1-10所示；所述PCR擴增 反應，包括 10XPCR buffer，25mM MgCl2, IOmM dNTP，10mM 正向引物，IOmM 反向引物，5U/yL Taq 酶，50ng/ μ L 模板 DNA 和 ddH20 ;
[0008] 3)觀察步驟2)的電泳結果，統(tǒng)計穩(wěn)定且易于分辨的差異性條帶，譜帶按0、1系統(tǒng) 記錄，有差異性條帶時賦值為1，無差異性條帶時賦值為〇,根據(jù)記錄結果計算遺傳相似系 數(shù)，鑒別谷子品種。
[0009] 優(yōu)選地，步驟1)所述提取谷子DNA，是取谷子幼芽，液氮冷凍后于-80°c保存?zhèn)溆茫?然后利用植物基因組試劑盒提取谷子DNA。
[0010] 更優(yōu)選地，所述谷子幼芽，為谷子發(fā)芽后l〇d-15d的幼芽。
[0011] 優(yōu)選地，步驟1)所述谷子，品種為勾根紅、龍爪、小白谷、錢串、刀把齊、大粒黃、白 沙谷、氣死風、老來變、小金苗、大斗黃、老頭背、黃粘谷、大粒黃、水紅根、蓋州紅、鴨子嘴、大 頭黃、大白毛、糜子亮、友誼谷、黑粘谷、五爪黃粘谷、四玉紅、嘎嘎青、鉆頭白、紫根白、昌平 谷、雙橋富興莊、小旱谷、耬貍秀、小黃谷、大葉黃谷、紫梗刀把齊、錢串緊谷、四寸紅根、紅根 繩子頭、細皮白谷、母雞嘴、大滿谷、干尖糙、六十天還倉、韁繩頭、金苗黃、磨里谷。
[0012] 優(yōu)選地，步驟3)所述PCR擴增反應，包括 10XPCR buffer，25mM MgCl2，10mM dNTP， IOmM正向引物，IOmM反向引物，5U/ μ L Taq酶，50ng/ μ L模板DNA和ddH20。
[0013] 更優(yōu)選地，步驟3)所述PCR擴增反應，體系總體積為25yL，其中包括10XPCR buffer 2.5yL，25mM MgCl23yL，10mM dNTP 1.25 4 1^，1〇1111正向引物14 1^，1〇1111反向引物 1 μ L，5U/ μ L Taq 酶 0· 2 μ L，50ng/ μ L 模板 DNAl μ L，ddH20 16. 5 μ L。
[0014] 優(yōu)選地，步驟3)所述PCR擴增反應，程序為：94°C預變性3min ;94°C變性45s，50°C 退火30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。
[0015] 優(yōu)選地，所述方法具體步驟為：
[0016] 1)谷子DNA的提取：取發(fā)芽后10d-15d的谷子幼芽，液氮冷凍后于_80°C保存?zhèn)?用，利用植物基因組試劑盒提取谷子幼芽的DNA，獲得谷子DNA ;
[0017] 2)PCR擴增和電泳檢測：利用步驟1)所得谷子DNA和5對核苷酸序列如SEQID NO. 1-10所示的SSR核心引物進行PCR擴增反應；然后對PCR產物進行8%非變性聚丙烯酰 胺凝膠電泳檢測，銀染顯色；
[0018] 所述SSR核心引物，每對包括一個正向引物和一個反向引物；所述PCR擴增反 應，體系總體積為25 4 1^，其中包括10\?〇?131^€612.5 4 1^，2511111%(：123 4 1^，101111(1犯13 I. 25yL，10mM 正向引物 I yL，10mM 反向引物 I yL，5U/yL Taq 酶 0· 2 4 1^，50即/^14莫板 DNAl μ L，CldH2O 16. 5 μ L ;PCR 擴增反應程序為：94°C預變性 3min ;94°C變性 45s，50°C退火 30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)；72°C延伸lOmin，4°C保存；
[0019] 3)觀察步驟2)的電泳結果，統(tǒng)計穩(wěn)定且易于分辨的差異性條帶，譜帶按0、1系統(tǒng) 記錄，有差異性條帶時賦值為1，無差異性條帶時賦值為〇,根據(jù)記錄結果計算遺傳相似系 數(shù)，鑒別谷子品種。
[0020] 以上所述任一方法在鑒別谷子品種中的應用。本發(fā)明有益效果：
[0021] 1、本發(fā)明利用SSR分子標記對45個谷子品種進行鑒別，結果表明：5對谷子SSR 引物共擴增出33個等位基因，平均每對引物6. 6個等位基因；各引物的多態(tài)信息指數(shù)為 0. 665~0. 830,平均值為0. 761 ;通過NTsys-pc 2. 11進行各品種間遺傳相似系數(shù)的計算， 各品種間遺傳相似系數(shù)在〇. 5758~0. 9394之間，45個谷子品種的平均遺傳相似系數(shù)為 0. 7368 ;選用的5對谷子引物均有良好的多態(tài)性及鑒別能來，能有效將45個谷子品種區(qū)分， 為進一步鑒別大量谷子品種提供了重要途徑。
[0022] 2、本發(fā)明僅利用5對谷子引物就能夠將谷子品種有效鑒別開，鑒別準確率高達 100%，在進一步鑒別大量谷子品種方面具有很大潛力，與現(xiàn)有專利相比，效果更佳，更節(jié)約 時間、成本等。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0024] 以下實施例中谷子品種名稱及資源庫號均來自于中國作物種質信息網。
[0025] 實施例1 :方法的建立
[0026] 1、準備谷子材料：將狼尾巴、白流沙、押死車1、白沁州黃、老來變、紅粘谷、刀把 齊、勾根紅、錢串子、大青苗、黃粘谷、紅谷子、黃谷、鴨子嘴、大粒黃、紅苗谷這15種谷子材 料種植于溫室；取發(fā)芽后l〇d-15d左右的谷子幼芽，液氮冷凍后放入-80°C超低溫冰箱中保 存?zhèn)溆茫?5種谷子品種的信息如表1所示。
[0027] 表1 15種谷子品種信息
[0029] 2、谷子DNA的提取：用植物基因組試劑盒提取各種谷子材料的DNA，用1%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測DNA純度；將各材料的DNA濃度稀釋至50ng/ μ L后，置于-20°C冰箱中備 用；
[0030] 3、PCR擴增反應、電泳檢測：PCR反應總體積為25 μ L，包括10 X PCR buffer 2. 5 μ L, MgC12 (25mM) 3 μ L, dNTP (IOmM) I. 25 μ L,正向引物（IOmM) 1 μ L，反向引物 (IOmM) 1 μ L，Taq 酶（5U/μ L) 0· 2 μ L，模板 DNA (50ng/μ L) 1 μ L，ddH20 16. 5 μ L ;PCR 的反應 程序為：94°C預變性3min ;94°C變性45s，50°C退火30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)；72°C 延伸10min，4°C保存；PCR擴增產物中加入6倍的Loading buffer 4 yL，取1.5 yL上樣， 用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。
[0031] 4、選用4個來源于不同基因組谷子的參比種質（CS01~CS04)，對本實驗中合成 的130對SSR引物進行初篩，根據(jù)擴增產物多態(tài)性，選出45對在不同基因組谷子之間都有 差異的引物；然后再用11個參比種質材料（FS01~FSll)對這些多態(tài)性引物進行復篩，谷 子SSR復篩引物多態(tài)性信息見表2 ;最后選出了條帶清晰、便于統(tǒng)計，且在不同谷子質間有 良好多態(tài)性的5對引物作為SSR核心引物。谷子SSR核心引物擴增的結果參見表3。非核 心引物信息見表4。
[0032] 表2谷子SSR復篩引物擴增結果

[0034] 表3谷子SSR核心引物擴增結果
[0035]
[0037] 表4非核心引物信息
[0038]

[0040] 5、統(tǒng)計分析：觀察PCR產物電泳結果，Gel-Pro analyzer軟件統(tǒng)計穩(wěn)定且易于分 辨的差異性條帶，譜帶按〇、1系統(tǒng)記錄，有此帶時賦值為" 1"，無此帶時賦值為"〇"，構建各 品種相應〇、1字符；記錄結果利用NTsys-pc 2. 11計算遺傳相似系數(shù)。
[0041] 6、結果與分析：
[0042] 6A、采用試劑盒提取的谷子DNA條帶清晰明亮，無降解現(xiàn)象，DNA完整性好，分光光 度計檢測發(fā)現(xiàn)A 26iv2s。比值在1. 8~2. 0之內，均能滿足PCR的要求。
[0043] 6B、在所用的130對引物中有效擴增引物有104對，占總擴增引物的77. 0% ;在 不同基因組谷子間具有多態(tài)性的引物為45對，占有效擴增引物的43. 3%。根據(jù)11個谷子 品種擴增結果（表2)，SiGOl~SiG05的等位基因數(shù)較高、多態(tài)性良好、PIC值均大于0. 6 ; SiG06~SiG45的多態(tài)信息含