專利名稱：泌尿生殖道支原體分型檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因領(lǐng)域，具體是一種泌尿生殖道支原體分型檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
性傳播疾病是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。我國(guó)近20多年來(lái)，性傳播疾病病例逐年增高，其中以支原體感染率的增高尤為顯著。支原體是一類(lèi)大小介于細(xì)菌與病毒的能在體外培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖的最小的微生物，廣泛存在于動(dòng)物、植物和人類(lèi)。已確定的對(duì)人類(lèi)有致病性的支原體主要有7種,它們是肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mpn)、解脲支原體(Ureaplasma urealyticum, Uu)、人型支原體(Mycoplasma hominis, Mh)、生殖支原體(Mycoplasma genitalium, Mg)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans, Mf)、穿通支原體 (Mycoplasma penetrans, Mpe )和梨支原體(Mycoplasma pi rum, Mpi ),均可通過(guò)性傳播而導(dǎo)致男女泌尿生殖系統(tǒng)感染。支原體感染后可導(dǎo)致各種婦科炎癥及非淋菌性尿道(陰道)炎(Nongonococcalurethritis，NGU)、附件炎、子宮內(nèi)膜炎、絨毛膜羊膜炎及各種不良妊娠結(jié)局(自然流產(chǎn)、胎膜早破、早產(chǎn)、低體重新生兒)和男性不育、附睪炎、前列腺炎等，還可通過(guò)胎盤(pán)感染胎兒，使新生兒受累，發(fā)生新生兒肺炎、腦膜炎、敗血癥等。此外發(fā)現(xiàn)Mpe、Mf、Mpi能增強(qiáng)HIV的復(fù)制，促進(jìn)HIV的細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致HIV感染進(jìn)一步發(fā)展，也可引起全身感染、多器官功能衰竭及急性呼吸窘迫呼吸癥，因此被認(rèn)為是AIDS相關(guān)支原體。解脲支原體(Ureaplasma urealyticum, Uu)分為兩個(gè)生物群和14種血清型，即U. parvum (以前的 Biovarl/parvum 群，包括血清型 1、3、6、14)和 U. urealyticum (以前的Biovar2/T960群，包括血清型2、4、5、7 13)。有研究指出由于不同血清型的Uu毒力不同，其致病性亦不同，U. urealyticum或U. parvum多種血清型的混合感染更容易致病。臨床上檢出不同生物群Uu的治療與否、不同生物群Uu菌株體外抗菌藥物敏感性及臨床治療過(guò)程中抗菌藥物的合理選擇等一系列方面都可能存在差異，故有必要在臨床檢驗(yàn)中對(duì)Uu進(jìn)行生物分型。目前支原體檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)檢查法、培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。培養(yǎng)法是檢測(cè)支原體的金標(biāo)準(zhǔn)，但是培養(yǎng)的要求較高且培養(yǎng)的周期較長(zhǎng)，并且由于培養(yǎng)基易被雜菌污染，故在臨床普及較困難。生殖支原體的臨床分離培養(yǎng)更困難。免疫技術(shù)要有特異的抗血清，而且易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。PCR技術(shù)本身的優(yōu)越性是無(wú)可厚非的，但是使用不當(dāng)很容易引起交叉污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性；如果反應(yīng)條件控制不好也可能出現(xiàn)假陰性。以上的檢測(cè)方法除了自身固有的缺陷外，最大的問(wèn)題就是只能檢測(cè)一種特定的支原體，而引起泌尿生殖道感染的支原體多為混合感染。各種支原體的耐藥性不一樣，為臨床治療帶來(lái)困難。因此研制和開(kāi)發(fā)一種特異性強(qiáng)、敏感性高同時(shí)又快速、經(jīng)濟(jì)，能同時(shí)檢驗(yàn)多種支原體的支原體分型檢測(cè)方法顯得尤為重要，對(duì)性傳播疾病和艾滋病的診斷和治療起著重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確檢測(cè)7種致病支原體解脲支原體(Uu)、人型支原體(Mh)、生殖支原體(Mg)、肺炎支原體(Mpn)、穿通支原體(Mpe)、梨支原體(Mpi )、發(fā)酵支原體(Mf )，并能對(duì)解脲支原體進(jìn)行血清分型的泌尿生殖道支原體分型檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的一種泌尿生殖道支原體分型檢測(cè)試劑盒，包括
(1)一個(gè)基因芯片，其上帶有
(i )不同種的支原體的核苷酸探針，其中探針至少是一個(gè)選自SEQ ID N0S:1-11和與SEQ ID Nos: 1-11互補(bǔ)的序列，探針序列如下
名稱序列序列號(hào)
Mpe-P 5' -atagctcaaacttcaaccgtgt-31(SEQ ID No. I)
Mpi-P 5' -ggactgcaatgcgaacact-3!(SEQ ID No. 2)
Mpn-P 5' -actcagctaatatctggcatctc-3!(SEQ ID No. 3)
Mf-P 5f -attagactatgaatacatgaacg-3!(SEQ ID No. 4)
Mh-P 5! -acctgcatcatcgcatgcaa-3!(SEQ ID No. 5)
Mg-P 5' -gacgcattcgctcgctaca-3!(SEQ ID No. 6)
Uuu-P 5! -gtaatatctaaacatagatataacaact-3! (SEQ ID No. 7)
Uupl-P 5! -actatcataattaatatagataataaact-3! (SEQ ID No. 8)
Uup3-P 5r -gttaatagattagcttatcttactgaat-3! (SEQ ID No. 9)
Uup6_P 5! - tattgtaactattatttaatataataaatc-3! (SEQ ID No. 10)
Uupl4-P 5' -gtgatataatagttaagtaaaatatt-3!(SEQ ID No. 11)
(ii)標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列(Bio)，用于監(jiān)控雜交是否成功，序列為SEQIDNo. 12
Bio 5! -cgtccaaggggaaactgatct-3! (SEQ ID No. 12);
(iii)帶有編碼β-actin蛋白部分的DNA序列(1C)，作為內(nèi)控點(diǎn)，用于監(jiān)控PCR體系是否成功，序列為SEQ ID No. 13
IC5' -cacgagattcacaatgctca-3!(SEQ ID No. 13);
(2)各種引物，用于擴(kuò)增臨床樣本中的DNA序列，選自SEQID Nos:14-22,其序列分別如下
(i)用于擴(kuò)增Uuu、UupUUup3、Uup6、Uupl4的引物，針對(duì)支原體DNA的multiplebanded antigen gene 設(shè)計(jì)，其序列為 SEQ ID Nos: 14 -17
MBA-F 5' -gatatgcattctttatatattgtct-3! (SEQ ID No. 14)
MBA-R 5, -atttgttrttttcarctgagttac-3! (SEQ ID No. 15)
Uuu-R 5' -actaactgctcccactcc-3!(SEQ ID No. 16)
Uup-R 5! -gcactccaaccgaagtaccaat-3! (SEQ ID No. 17)
(ii)用于擴(kuò)增Mh的引物，針對(duì)支原體DNA的16SrRNA基因設(shè)計(jì)，其序列為SEQ IDNos:18-20
Myco-F 5' -gtacctgkgatgaacctg-3!(SEQ ID No. 18)
Mh_F2 5' -cctgtgcaatgagagatccga-3! (SEQ ID No. 19)Mh-R2 5' -agttgtaccactgcactgc-3'(SEQ ID No. 20)
(iii)用于擴(kuò)增Mg、Mpn、Mpe、Mpi的引物，針對(duì)支原體DNA的16SrRNA基因設(shè)計(jì)，其序列為 SEQ ID No. 18 和 SEQ ID No. 21
Myco-F 51 -gtacctgkgatgaacctg-31(SEQ ID No. 18)
MGP-680R 51 -tgtatgtctatytaacycagac-31 (SEQ ID No. 21)
(iv)用于擴(kuò)增Mf的引物，針對(duì)支原體DNA的16SrRNA基因設(shè)計(jì)，其序列為SEQ IDNo.18 和 SEQ ID No. 22
Myco-F 51 -gtacctgkgatgaacctg-31(SEQ ID No. 18)Mf- 700R 51 -gaagtccttcctgaaggttg-31 (SEQ ID No. 22)
其中r表示a或g, k表示g或t, y表示c或t。本發(fā)明針對(duì)每一種支原體設(shè)計(jì)的探針有著合理的堿基成分，探針的Tm值在42°C到48°C之間，相對(duì)比較均一，即11種探針和對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物雜交時(shí)最適宜的溫度條件基本一致，有利于在同一雜交溫度下的同步性，不會(huì)因?yàn)闇囟鹊膯?wèn)題而影響雜交的結(jié)果，使檢查的準(zhǔn)確性大大增加。本發(fā)明上述的試劑盒，所述基因芯片包括用于定位探針的位置標(biāo)記。本發(fā)明上述的試劑盒，所述基因芯片的探針是固定在尼龍膜上。本發(fā)明上述的試劑盒，所述引物SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20和SEQ ID No. 21的5'端標(biāo)記有生物素。本發(fā)明所述基因芯片的制備方法，包括如下步驟
(1)DNA探針的制備合成與支原體DNA互補(bǔ)的5'末端經(jīng)過(guò)胺基化的DNA片段
(2)固定探針將上述探針固定在活化處理好的尼龍膜上
先對(duì)尼龍膜進(jìn)行活化處理，然后將探針點(diǎn)到膜上，通過(guò)探針末端的胺基與活化膜上的羧基形成共價(jià)結(jié)合，牢固地將探針固定在膜上；
(3)制備基因芯片利用氫氧化鈉停止反應(yīng)，制得基因芯片。利用本發(fā)明所述的支原體分型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)支原體感染的方法包括以下步驟利用支原體分型檢測(cè)試劑盒中含特定序列的引物PCR擴(kuò)增臨床樣本中的DNA，對(duì)擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行雜交；檢測(cè)基因芯片表面上結(jié)合的DNA。具體步驟如下
第一步擴(kuò)增樣品
將臨床樣本中提取的DNA通過(guò)支原體分型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，所用的部分引物5'端標(biāo)記有生物素，擴(kuò)增得到的5'端帶有生物素標(biāo)記的DNA產(chǎn)物；
第二步:雜交
使用導(dǎo)流雜交技術(shù)，將上述擴(kuò)增得到的DNA與基因芯片上面分布的DNA探針、Bio和IC進(jìn)行反應(yīng)；
第三步顯色
在堿性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIP系統(tǒng)顯色，肉眼直接觀察結(jié)果。在基因檢測(cè)中，由于操作步驟繁瑣，操作失誤難以避免，本發(fā)明在試劑盒中使用了標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列和帶有編碼β -actin蛋白部分的DNA序列，分別用于監(jiān)控雜交和PCR體系是否成功，便于操作人員在檢測(cè)過(guò)程出錯(cuò)時(shí)，快速區(qū)分是在PCR時(shí)出錯(cuò)還是在雜交時(shí)出錯(cuò)，以便迅速找出發(fā)生錯(cuò)誤的原因，縮短檢測(cè)時(shí)間。另外，在現(xiàn)有技術(shù)中，由于探針載體多采用玻璃等，通透性差，一般只能使用傳統(tǒng)雜交方法進(jìn)行雜交，操作起來(lái)較為麻煩，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，一般至少都在6個(gè)小時(shí)以上，而且顯色結(jié)果的背景不干凈；本發(fā)明使用尼龍膜做為探針載體，由于尼龍膜較其它固體支持物(如玻璃等)具有良好的通透性，不但利于導(dǎo)流雜交技術(shù)的應(yīng)用，且具有很好的彈性，便于生產(chǎn)和操作，縮短了檢測(cè)時(shí)間，只需要I. 5小時(shí)左右，顯色結(jié)果的背景干凈。本發(fā)明所述泌尿生殖道支原體分型檢測(cè)試劑盒能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出泌尿生殖道致病支原體感染及感染的類(lèi)型，對(duì)于泌尿生殖道疾病的診斷和治療具有重要的意義。


以下是附圖的說(shuō)明，便于理解上述發(fā)明的目的和具體特征。圖I是表示基因芯片上探針和監(jiān)控點(diǎn)的類(lèi)型和具體的分布位置的圖片，“Bio”代表標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列；“IC”代表帶有編碼β -actin蛋白部分的DNA序列；Uuu表 示解脲支原體的 T960 群(包括血清型 2,4, 5，7,8,9, 10，11，12，13)；Uupl,Uup3,Uup6,Uupl4分別表示解脲支原體的血清型I，3，6和14 ;Mh表示人型支原體；Mg表示生殖支原體；Mf表示發(fā)酵支原體;Mpe表示穿通支原體;Mpn表示肺炎支原體;Mpi表示梨支原體,“ + ”代表位置標(biāo)記。圖2是表示陰性的結(jié)果的圖片。圖3a是表示解脲支原體(Uu) Uuu感染的圖片。圖3b是表示解脲支原體(Uu) Uupl感染的圖片。圖3c是表示解脲支原體(Uu) Uup3感染的圖片。圖3d是表示解脲支原體(Uu) Uup6感染的圖片。圖3e是表示解脲支原體(Uu) Uup 14感染的圖片。圖4a是表示人型支原體(Mh)感染的圖片。圖4b是表示生殖支原體(Mg)感染的圖片。圖4c是表示發(fā)酵支原體(Mf)感染的圖片。圖4d是表示穿通支原體(Mpe)感染的圖片。圖4e是表示肺炎支原體(Mpn)感染的圖片。圖4f是表示梨支原體(Mpi)感染的圖片。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例中，20%的EDAC溶液、O. 1%SDS、0. 25%脫脂奶粉、O. 05%硫柳汞、O. 05%疊氮鈉均是指質(zhì)量比，O. l%Tween20是指體積比。步驟I基因芯片的制備
根據(jù)人體泌尿生殖道感染致病支原體的情況，選擇了 7種致病支原體解脲支原體(Uu)、人型支原體(Mh)、生殖支原體(Mg)、肺炎支原體(Mpn)、穿通支原體(Mpe)、梨支原體(Mpi)、發(fā)酵支原體(Mf)，并對(duì)解脲支原體進(jìn)行了血清分型檢測(cè)。針對(duì)每一種支原體，設(shè)計(jì)與合成5'端帶有胺基的特異性基因探針，并制備IC和Bio，用于泌尿生殖道支原體的檢測(cè)。
DNA基因芯片的制作步驟如下將制備的探針、IC和Bio首先溶解在超純水中，制成濃度為200M的母液，然后溶解在PH=8. 4的O. 5M Na2CO3和O. 5M NaHCO3的溶液中，使其最終濃度為2M。對(duì)尼龍膜進(jìn)行處理，首先放入O. IM HCL溶液中浸泡30秒鐘，然后把已除去殘余溶液的膜放進(jìn)20%的EDAC溶液中浸泡15分鐘，最后放在洗膜盤(pán)中用200mL的純化水沖洗10秒鐘，此步驟重復(fù)3次，再放到吸水紙上除去多余的殘液。轉(zhuǎn)入溫度為20°C、濕度為45%的烘干箱內(nèi)烘干12小時(shí)。將已烘干的尼龍膜用Kimwipes紙隔開(kāi)，裝入封口薄膜袋中，放進(jìn)點(diǎn)膜間的冰箱中，貯藏在4°C的溫度下，備用。通過(guò)微量移液設(shè)備將上述制備好的探針、IC和Bio分別點(diǎn)在上述處理過(guò)的尼龍膜上，每滴0.4L。點(diǎn)膜完成后，將膜放置于室溫15分鐘，進(jìn)行反應(yīng)。然后將膜轉(zhuǎn)入O. IM NaOH溶液中浸泡10分鐘，停止反應(yīng)。將洗好的膜轉(zhuǎn)入溫度為20°C、濕度為45%的烘干箱內(nèi)放置12小時(shí)，即制得基因芯片。
步驟2樣品制備 步驟2-1陽(yáng)性對(duì)照組樣品的制備
利用引物Myco-F，Mh-F2和Mh_R2對(duì)插入到pMD_T vector中的Mh DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為 50L，包含 10Xbuffer，5. OL ;25mM MgC12,6. OL ；25mM dNTP，I. OL ;IOM 生物素標(biāo)記引物 MBA-F，O. 5L ; IOM 引物 MBA-R, O. 5L ;IOM 引物 Uuu-R, O. 5L ; IOM 引物 Uup-R,O. 5L ;IOM生物素標(biāo)記引物Myco-F，I. OL ;IOM引物Mh_F2，O. 5L ;10M生物素標(biāo)記引物Mh_R2，O. 5L ； IOM 生物素標(biāo)記引物 MGP-680R, O. 5L ; IOM 引物 Mf-700R, O. 5L ;內(nèi)對(duì)照 DNA1. OL ；ddH20, 29. 5L ；5U/ L TaqDNA 聚合酶，O. 5L ;模板 DNA, 2. OL ;共 50L。PCR 反應(yīng)程序?yàn)槭紫?5°C變性9分鐘，然后95 °C，20秒；55°C，30秒；72°C，50秒；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘。步驟2-2支原體標(biāo)準(zhǔn)品的制備
同步驟2-1相似步驟制備生物素結(jié)合的擴(kuò)增支原體DNA樣品，不同之處在于利用上述各種質(zhì)粒作為模板。步驟2-3臨床樣本中DNA樣品的制備
利用煮沸和異丙醇沉淀法制備和純化臨床樣本中的DNA，然后參照步驟2-1中的方法擴(kuò)增得到帶有生物素標(biāo)記的DNA。步驟3利用DNA基因芯片檢測(cè)支原體DNA
利用導(dǎo)流雜交技術(shù)，將步驟2中擴(kuò)增得到的DNA樣品用步驟I中制備的基因芯片進(jìn)行檢測(cè)，DNA樣品和基因芯片中尼龍膜上的探針、Bio和IC反應(yīng)，最后根據(jù)顯色情況進(jìn)行判斷，有顯色的探針點(diǎn)表示相應(yīng)的支原體類(lèi)型，IC點(diǎn)顯色表示擴(kuò)增成功，Bio點(diǎn)顯色表示雜交成功。進(jìn)行臨床樣本檢測(cè)的同時(shí)，做支原體Mh陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。將擴(kuò)增獲得的50L產(chǎn)物95°C下變性5 10分鐘，迅速轉(zhuǎn)移到冰水混合物中，放置3分鐘。然后加入到事先溫浴到45°C的0.8mL雜交液中(2XSSC/0. 1%SDS)，混勻后加入到雜交儀的反應(yīng)孔中，應(yīng)用于步驟I制得的基因芯片，45°C雜交20分鐘。然后用WBl(I X SSC/0. 1%SDS)，45°C溫浴，清洗3遍。加入O. 5mL封阻液(O. 25%脫脂奶粉，O. 05%硫柳汞)，25°C封閉5分鐘。抽干后加入O. 5mL的酶標(biāo)液(TBS中溶解的帶有鏈霉親和素標(biāo)記的AP酶)，酶標(biāo)5分鐘。用O. 8mL溶液A (TBS, O. l%Tween 20及O. 05%疊氮鈉)清洗4遍，然后加入O. 5mL的顯色液(NBT/BCIP)，避光顯色5 分鐘。最后用雜交液(2XSSC/0. 1%SDS)沖洗3遍,晾干,分析顯色情況,判讀結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種泌尿生殖道支原體分型檢測(cè)試劑盒，包括 (1)一個(gè)基因芯片，其上帶有 (i )不同種的支原體的核苷酸探針，其中探針至少是一個(gè)選自SEQ ID Nos: 1-11和與SEQ ID Nos:l-ll互補(bǔ)的序列； ( )標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列，序列為SEQ ID No. 12; (iii)帶有編碼β -actin蛋白部分的DNA序列，作為內(nèi)控點(diǎn)，序列為SEQ ID No. 13; (2)各種引物，用于擴(kuò)增臨床樣本中的DNA序列，選自SEQID Nos:14-22,其序列分別如下 (O用于擴(kuò)增Uuu、UupU Uup3、Uup6、Uupl4的引物,針對(duì)支原體DNA的multiplebanded antigen gene 設(shè)計(jì)，其序列為 SEQ ID Nos: 14 -17 ； (ii)用于擴(kuò)增Mh的引物，針對(duì)支原體DNA的16SrRNA基因設(shè)計(jì)，其序列為SEQ IDNos:18-20 ； (iii)用于擴(kuò)增Mg、Mpn,Mpe, Mpi的引物，針對(duì)支原體DNA的16S rRNA基因設(shè)計(jì)，其序列為 SEQ ID No. 18 和 SEQ ID No. 21 ； (iv)用于擴(kuò)增Mf的引物，針對(duì)支原體DNA的16SrRNA基因設(shè)計(jì)，其序列為SEQ IDNo.18 和 SEQ ID No. 22 ； 其中r表示a或g, k表示g或t, y表示c或t。
2.權(quán)利要求I所述試劑盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探針的位置標(biāo)記。
3.權(quán)利要求I所述試劑盒，其特征在于，所述基因芯片的探針是固定在尼龍膜上。
4.權(quán)利要求I所述試劑盒，其特征在于，所述引物SEQID No. 14、SEQ ID No. 18、SEQID No. 20和SEQ ID No. 21的5'端標(biāo)記有生物素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種泌尿生殖道支原體分型檢測(cè)試劑盒，包括(1)一個(gè)基因芯片，其上帶有(ⅰ)不同種的支原體的核苷酸探針，其中探針至少是一個(gè)選自SEQIDNos:1-11和與SEQIDNos:1-11互補(bǔ)的序列；(ⅱ)標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列，序列為SEQIDNo.12;(ⅲ)帶有編碼β-actin蛋白部分的DNA序列，作為內(nèi)控點(diǎn)，序列為SEQIDNo.13;(2)各種引物，用于擴(kuò)增臨床樣本中的DNA序列，選自SEQIDNos:14-22。本發(fā)明試劑盒能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出泌尿生殖道致病支原體感染及感染的類(lèi)型，對(duì)于泌尿生殖道疾病的診斷和治療具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102864231SQ20121036324
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者陳偉堅(jiān), 梁秋菊, 謝龍旭 申請(qǐng)人:廣東凱普生物科技股份有限公司