專利名稱：一種轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，還涉及此多肽和多核苷酸重組質(zhì)粒的制備和應(yīng)用以及該多肽物質(zhì)對Metastasis suppressor I ニ聚化抑制作用生物活性。
背景技術(shù)：
Inverse BAR (I-BAR)家族基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白能結(jié)合細(xì)胞膜，并能在細(xì)胞外刺激作用下對細(xì)胞膜的形態(tài)變化和細(xì)胞狀況做出調(diào)節(jié)[Frost, A.et al. (2009) Cell137(2) :191-196. ] οMetastasis suppressor I (以下簡稱 Mtssl) [Lee, Y. G. et al. (2002) Neoplasia4(4):291-294.]基因是I-BAR家族的重要成員，由于其在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中表達(dá)異常，且對 膜運動、細(xì)胞極性、胞內(nèi)交織以及細(xì)胞移動具有調(diào)控功能[Mattila，P.K. et al. (2003)Journal of Biological Chemistry 278 (10):8452-8459.]。近期對人類惡性腫瘤樣本的研究顯示，在多種晚期膀胱癌和轉(zhuǎn)移性胃癌中發(fā)現(xiàn)Mtssl基因表達(dá)的缺失；由于和預(yù)后不良情況成反比，Mtssl基因表達(dá)的程度可做為某些癌癥患者無病生存率的診斷依據(jù)[Liu, K. et al. (2010)BMC Cancer 10:428.]。同時也有報道某些Mtssl基因過度表達(dá)以及染色體8q24. I上Mtssl基因位點擴(kuò)增的腫瘤[Glassmann，A.et al. (2007)BMC Dev Biol 7:111·]。另タ卜，Mtssl 還是 Sonic hedgehog (Shh)響應(yīng)基因之一 [Callahan, C. A. et al. (2004)Genes & Development 18 (22) : 2724-2729.],而Shh信號通路往往會促進(jìn)作用腫瘤的發(fā)生[Bailey，J. M. et al. (2007) J Cell Biochem102(4) :829-839.]。盡管當(dāng)前的數(shù)據(jù)暗示Mtssl基因異常表達(dá)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，但Mtssl的生理功能及其信號通路對腫瘤進(jìn)展的影響尚沒有得到充分闡明。Mtssl基因早先被認(rèn)為與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，在某些惡性腫瘤中表達(dá)降低[Lee，Y. G. et al. (2002)Neoplasia4 (4) : 291-294.]。該基因編碼全長759個氨基酸的蛋白，其N端帶有250個氨基酸組成的inverse Bin-Amphiphysin-Rvs (I-BAR)同源區(qū)，能形成扭曲的橢球形狀的ニ聚體結(jié)構(gòu)，利用該結(jié)構(gòu)形成的凸面結(jié)合細(xì)胞膜[Yamagishi, A. et al. (2004)Journal of Biological Chemistry279 (15) : 14929-14936. ]。I-BAR 家族蛋白在 N 端往往高度的保守，并且與細(xì)胞膜運動密切相關(guān)。研究表明Mtssl蛋白I-BAR區(qū)能結(jié)合PI (4，5)P2_富集的人工膜并引發(fā)絲狀偽足樣的膜突起[Saarikangas, J. et al. (2009)Curr Biol 19(2) :95-107. ] 此外，Mtssl I-BAR 能夠與小 GTP 酶 Rac 相互作用，結(jié)合細(xì)胞膜并交叉連接肌動蛋白細(xì)胞骨架[Bompard, G. et al. (2005) Journal of CellScience 118 (22) : 5393-5403. ]。Mtssl的C端還包括一個絲氨酸富集區(qū)(SRD)、ー個脯氨酸富集區(qū)(PRD)和ー個WASP同源2區(qū)(WH2)結(jié)構(gòu)，這些位點能夠結(jié)合肌動蛋白單體[MattiIa, P. K. et al. (2003) J Biol Chem 278 (10) :8452-8459.]、皮層肌動蛋白[Lin, J. etal. (2005)Oncogene 24(12):2059-2066.]和 Daaml 等[Liu, ff. et al. (2011)Development138(10) :2035-2047.]細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白。許多證據(jù)表明Mtssl的I-BARニ聚體在其構(gòu)象形成和功能發(fā)揮發(fā)面具有重要作用；針對這一位點對進(jìn)行阻斷，將有理由于了解Mtssl蛋白N端特殊的作用。在結(jié)構(gòu)上，兩個Mtssl蛋白分子能夠借助其N端的I-BAR區(qū)域結(jié)合成ニ聚體的結(jié)構(gòu)，這ー結(jié)構(gòu)能結(jié)合細(xì)胞膜并促使膜形成偽足狀突起[Woodings, J. A. et al. (2003)Biochemical Journal 371:463-471.]。Mtssl蛋白ニ聚體發(fā)揮生物活性的機制尚未闡明，這就需要發(fā)現(xiàn)有針對性的相關(guān)抑制劑，用以研究ニ聚化作用能否影響Mtssl介導(dǎo)的細(xì)胞膜變化和內(nèi)吞作用，以及ニ聚化作用與Mtssl蛋白對肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)之間的聯(lián)系。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供ー種能夠有效抑制Mtssl蛋白ニ聚化作用的多肽，編碼這些多肽物質(zhì)的多核苷酸以及該多核苷酸重組載體。
技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，包含SEQ ID No 2所示的氨基酸序列。作為改進(jìn)，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，還包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的片段或類似物。作為進(jìn)ー步改進(jìn)，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，還包含SEQ IDNo 2所示的氨基酸序列的多肽的片段，或與SEQ ID No 2所示的氨基酸序列具有80%以上同源性的多肽。本發(fā)明還提供了ー種多核苷酸，它編碼包含SEQ ID No 2所示的氨基酸序列的堿基序列。作為改進(jìn)，該多核苷酸編碼包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的多肽或其片段、類似物的堿基序列。該多核苷酸包含SEQ ID No :I所示的堿基序列。作為改進(jìn)，該多核苷酸包括SEQ ID No :I的堿基序列或與SEQ ID No :I的堿基序列有80%以上的同源性。本發(fā)明還提供了 ー種重組質(zhì)粒表達(dá)載體，它包含SEQ ID No 1所示的堿基序列；該重組質(zhì)粒表達(dá)載體由上述的多核苷酸與外源表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建而成。本發(fā)明還提供了上述轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽通過與Mtssl蛋白I-BAR區(qū)結(jié)合,抑制Mtssl蛋白的ニ聚化作用，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)攝，干擾細(xì)胞膜形態(tài)變化以及干擾腫瘤相關(guān)信號傳導(dǎo)的效果。其中，多肽-蛋白的體外結(jié)合解離常數(shù)和抑制活性均在納摩爾級。有益效果本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽通過抑制Mtssl蛋白ニ聚化作用，抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)攝，干擾細(xì)胞膜形態(tài)變化以及干擾腫瘤相關(guān)信號傳導(dǎo)，削弱由表皮生長因子EGF、血小板衍生因子TOGF或刺猬因子shh等腫瘤刺激因素引發(fā)的細(xì)胞增殖和生長，其中多肽-蛋白的體外結(jié)合解離常數(shù)和抑制活性均在納摩爾級。


圖I為轉(zhuǎn)染GFP標(biāo)記的序列號2代表的多肽，在293T細(xì)胞中表達(dá)情況，用WesternBlot檢測的結(jié)果；其中目標(biāo)蛋白分子量約38KD。圖2為純化的GST標(biāo)記的序列號2代表的多肽，使用Commassie Blue染色的結(jié)果；其中目標(biāo)蛋白分子量約35KD。圖3為GST柱結(jié)合的序列號2代表的抑制劑多肽與Mtssl蛋白結(jié)合能力的檢測結(jié)果；計算二者的解離常數(shù)在納摩爾級。圖4為GST標(biāo)記的序列號2代表的抑制劑多肽抑制Mtssl ニ聚化能力的檢測結(jié)果；計算多肽的抑制活性在納摩爾級。
具體實施例方式
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根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、エ藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。試劑及儀器聚介: : PfuUltra II fusion HS DNA polymeraseStratagene 公司
單核苷酸混合物dNTPPromega公司
BamH I限制性內(nèi)切酶NEB公司
SalI限制性內(nèi)切酶NEB公司
3號酶切緩沖液NEB公司
T4 DNA連接酶和配套濃縮緩沖液Invitrogen公司
氨芐青霉素SIGMA公司
LB固體培養(yǎng)基GIBCO BRL公司 小牛血清BCSHyclone公司
DMEM高糖培養(yǎng)液Lonza公司
青霉素GffiCO公司
鏈霉素GIBCO公司
細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑SuperFectQiagen公司
S.O.C.培養(yǎng)基SIGMA公司
LB液體培_基Invitxogen公司
異丙基-beta-D-硫代半乳糖苷IPTGSIGMA公司
谷胱甘肽瓊脂糖凝膠 Glutathione Sepharose 4BAmerican Biosciences 公H]
化學(xué)發(fā)光底物Thermo公司
考馬斯亮藍(lán)BIO-RAD公司
鼠抗 anti-Myc 抗體(9E10)BD Biosciences 公'-同
鼠抗anti-Flag抗體SIGMA公司
Ilr \ i 凝膠 Protein A SepharoseGE Healthcare 公 ι
Mastercycler型DNA梯度熱循環(huán)儀eppendorf公司
細(xì)胞培養(yǎng)皿BD Falcon公司
Centricon YM-30 超濾管Millipore 公司
ImageStation 2000丨冬丨像糸統(tǒng)Kodak公'丨丨'j正常培養(yǎng)液為含10%小牛血清BCS的DMEM高糖培養(yǎng)液。實施例IGST標(biāo)記的多肽編碼DNA質(zhì)粒的構(gòu)建。以鼠源重組DNA質(zhì)粒P Mtssl-Myc-His 為模板，5’_CAGTTAGGATCCACCATCATCAGCGAC-3’和5’ -CAGTTAGTCGACCTAGATGCTCCGGTG-3’序列的多核苷酸為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件為50 μ I反應(yīng)體系，使用PfuUltra II fusion HS DNA polymerase及其配套IOx 緩沖液，dNTP 各 250 μ M，模板 DNA 20ng/μ 1，引物各 O. 5 μ Μ。在 Mastercycler 型 DNA梯度熱循環(huán)儀上按下列條件反應(yīng)30個循環(huán)95°C，20s ；67.4°C,20s ;72°C，15s。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外成像確認(rèn)分子量約250bp，使用苯酚、氯仿和異戊醇的混合液(25:24:1)抽提，水層加入終濃度約O. 3mol/L的NaAc和2倍量的無水こ醇混勻，高轉(zhuǎn)速離心5分鐘，得到的沉淀使用70%こ醇洗滌，室溫晾干后使用純水溶解。之后將上述PCR產(chǎn)物同時還有5 μ g載體質(zhì)粒分別在37 °C下使用BamHl和Sal I限制性內(nèi)切酶于3號酶切緩沖液中孵育消化60分鐘，目的是將PCR產(chǎn)物(即插入序列)以及載體的5’和3’兩端完全修飾以便進(jìn)行粘性末端連接。酶切反應(yīng)結(jié)束后分別使用瓊脂糖凝膠電泳割膠純化插入序列和載體，純化后的插入序列和載體DNA以3:1的摩爾比(4. 5nM:l. 5nM)于20 μ I總體積的緩沖液(由IOx配套濃縮緩沖液配制)中在O. I單位的Τ4 DNA連接酶催化下室溫反應(yīng)2h。取I μ I連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)染DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，接種至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，得到的陽性克隆經(jīng)質(zhì)粒純化后進(jìn)行DNA測序最終確證質(zhì)粒構(gòu)建。 實施例2序列號2代表的抑制劑多肽，其多核苷酸重組質(zhì)粒在真核/原核細(xì)胞中的表達(dá)和檢測。人胚腎細(xì)胞293Τ細(xì)胞的培養(yǎng)使用含10%小牛血清BCS的DMEM高糖培養(yǎng)液，加入終濃度為100units/ml的青霉素和100 μ g/ml的鏈霉素進(jìn)行培養(yǎng)。DNA轉(zhuǎn)染前，將I. 5xl06細(xì)胞接種在IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿中使用不含抗生素的正常培養(yǎng)液在37°C和5%C02條件下培養(yǎng)過夜。隨后制備轉(zhuǎn)染混合物=IOyg綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記的抑制劑多肽質(zhì)粒DNA，300 μ IDMEM,60 μ I SuperFect0轉(zhuǎn)染混合物經(jīng)室溫孵育5_10分鐘后加入3ml正常培養(yǎng)液混勻，用以替換細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2-3h，隨后再更換成正常培養(yǎng)液培養(yǎng)48h進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)情況可以直接使用熒光顯微鏡檢測綠色熒光，或?qū)⒓?xì)胞收集、裂解后取裂解液進(jìn)行檢測。100 μ I DH5 α感受態(tài)細(xì)胞與IOOng谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST標(biāo)記的質(zhì)粒DNA混合后于4°C靜置30min后，立即放入42°C水浴熱休克45sec，再置于4°C下2min，隨后添加O. 9mlS.O. C.培養(yǎng)基，37°C下200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)lh。取20 μ I上述培養(yǎng)液，接種至含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，在37°C下培養(yǎng)過夜。得到的陽性克隆需要經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)分子量。挑取單個克隆在3ml含30 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C下200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，隨后再添加IOOml預(yù)熱過的LB液體培養(yǎng)基(含50 μ g/ml氨芐青霉素)200rpm轉(zhuǎn)速37°C下培養(yǎng)l-2h直到體系的0D_值達(dá)到O. 3-0. 4，此時加入終濃度O. 4mM的異丙基-beta-D-硫代半乳糖苷IPTG繼續(xù)培養(yǎng)90min。4°C下5000xg離心收獲細(xì)胞，在IOml含有PMSF的PBS緩沖液中超聲裂解，并收集上清液。在上清液中加入2ml的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠GlutathioneSepharose 4B50%磷酸鹽緩沖液(PBS)懸濁液，4°C下30rpm培養(yǎng)2h，棄上清，使用PBS洗滌沉淀，得到GST柱結(jié)合多肽。再使用含IOmM還原型谷胱甘肽的50mM Tris (pH8. O)洗脫，洗脫液用PBS在CentriconYM-30超濾管中4°C下離心超濾得到較純的GST標(biāo)記多肽蛋白PBS溶液。檢測多肽的方法如下。以10%SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳分離多肽樣品。針對細(xì)胞裂解液，使用Western Blot方法，即把凝膠在350mA電流4°C下濕法電轉(zhuǎn)Ih至硝酸纖維膜，以兔抗GFP抗體的1: 500的5%脫脂牛奶稀釋液在4°C下孵育過夜，TBST緩沖液洗滌后在以辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 1:1000的5%脫脂牛奶稀釋液室溫孵育30分鐘，TBST緩沖液洗滌之后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色并在ImageStation 2000圖像系統(tǒng)上曝光成像得到檢測數(shù)據(jù)(如圖I);針對純化的GST多肽，則使用考馬斯亮藍(lán)室溫染色過夜，再使用脫色液(含30%冰醋酸，40%甲醇，其余為水)室溫脫色2h得到檢測結(jié)果(如圖2)。實施例3GST柱結(jié)合的序列號2代表的抑制劑多肽與Mtssl蛋白結(jié)合能力的檢測。將pMtssI-Myc-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，表達(dá)后的細(xì)胞裂解液中加入不同濃度的GST柱結(jié)合多肽，在4°C下30rpm培養(yǎng)2h，取上清樣品，以8%十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。使用Western Blot法,分別利用鼠抗anti-Myc抗體(9E10)和山羊抗鼠IgG處理之后再用化學(xué)發(fā)光 底物顯色并曝光成像得到結(jié)合能力數(shù)據(jù)，同時利用β -actin作為內(nèi)部參照以確定加樣量(如圖3)。樣品中Mtssl-Myc數(shù)量越少，暗示GST柱結(jié)合多肽的結(jié)合能力越強。實施例4GST標(biāo)記的序列號2代表的抑制劑多肽抑制Mtssl ニ聚化能力的檢測。將鼠源重組DNA質(zhì)粒pFlag-Mtssl和pMtssl_GFP共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，48小時候收集細(xì)胞并裂解，裂解液按照200 μ I體積分裝7組，其中加入不同濃度的GST標(biāo)記的抑制劑多肽溶液，在4°C下30rpm培養(yǎng)2h。取樣品上清，加入I μ I的兔抗GFP抗體以及20 μ I Protein A Sepharose的50%PBS懸池液混勻，在4°C下30rpm培養(yǎng)Ih,此時ニ聚化的Flag-Mtssl和Mtssl-GFP蛋白將形成免疫共沉淀。收集上清，以8%SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。使用Western Blot法,分別利用鼠抗anti-Flag抗體和山羊抗鼠IgG處理之后再用化學(xué)發(fā)光底物顯色并曝光成像得到結(jié)合能力數(shù)據(jù)，同時利用β-actin作為內(nèi)部參照以確定加樣量(如圖4)。樣品中Flag-Mtssl的量越多，暗示GST標(biāo)記多肽的抑制ニ聚化能力越強。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列。
2.一種多核苷酸，編碼包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的堿基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于包括SEQID No :1所示的堿基序列。
4.一種重組質(zhì)粒表達(dá)載體，其特征在于它包含SEQ ID No : I所示的堿基序列。
5.權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽與Mtssl蛋白I-BAR區(qū)結(jié)合，并抑制Mtssl蛋白的二聚化作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽，包含SEQ ID No2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼該多肽的多核苷酸以及該多核苷酸重組載體。該轉(zhuǎn)移腫瘤缺失蛋白抑制劑多肽通過抑制Mtss1蛋白二聚化作用，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)攝，干擾細(xì)胞膜形態(tài)變化以及干擾腫瘤相關(guān)信號傳導(dǎo)的效果，其中多肽-蛋白的體外結(jié)合解離常數(shù)和抑制活性均在納摩爾級。
文檔編號C12N15/63GK102816225SQ20121029454
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者詹熙, 吉民, 曹萌 申請人:東南大學(xué)