一種納米金復合物及其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種納米金復合物及其制備和應用。具體地，本發(fā)明提供的納米金復合物包括納米金顆粒和功能分子，并且所述的功能分子通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒表面。所述的功能分子具有富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)、功能區(qū)、和位于結合區(qū)與功能區(qū)之間的過渡區(qū)。本發(fā)明還提供了所述納米金復合物的制備方法及應用。
【專利說明】一種納米金復合物及其制備和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術和生物檢測領域，具體地，本發(fā)明涉及一種納米金復合物及其制備和應用。
【背景技術】
[0002]納米金復合物是一種常用的生物納米材料，它由功能分子通過一定的方式聯(lián)接在納米金顆粒上，在生物診斷等方面有廣泛的應用。
[0003]DNA-納米金復合物是一種常見的納米金復合物形式。通常，這種DNA-納米金復合物是由巰基修飾的DNA通過金硫鍵在金表面自組裝作用得到的。應用這種方法制備DNA-納米金復合物，需要將DNA進行化學修飾，操作過程十分復雜，而且成本很高，操作過程中還可能形成不需要的雙硫鍵，或存在樣品污染等問題。該方法常見的缺點是未完全功能化的納米金顆粒納米金由于表面非特異性吸附，DNA吸附在納米金表面呈現(xiàn)倒伏狀態(tài)；此外，這種方法雖然攜帶的DNA密度很高，但是在高度功能化的納米金顆粒上，DNA的高密度使得目標檢測分子不易接近，影響檢測效率。
[0004]使用競爭性的小分子，如巰基己醇(MCH)，可以通過取代掉吸附在金表面的DNA并迫使DNA序列保持直立狀態(tài)來提高雜交效率，但是該方法中使用的競爭性小分子數(shù)量和反應的控制非常復雜，并且競爭性小分子的引入會降低納米金顆粒的穩(wěn)定性。
[0005]因此，本領域迫切需要開發(fā)一種新型的制備納米金復合物的方法，能通過一種簡單有效的方法將功能分子連接到納米金顆粒上，并能有效調(diào)控納米金粒子表面固定的功能分子的密度、方向以及構型，從而提高納米金納米金復合物的檢測效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是提供一種新的納米金-復合物及其制備和應用。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種納米金復合物，所述復合物包括納米金顆粒和功能分子，并且所述的功能分子通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒的表面。
[0008]在另一優(yōu)選例中，所述的功能分子具有式1-式III任一所示結構:
[0009]B-L-RI ；
[0010]R-L-B-L-R11 ；
[0011 ] (B-L-R-L-B)m III ；
[0012] 式中，
[0013]B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)；
[0014]R表示功能區(qū)；
[0015]L表示位于B和R之間的任選的過渡區(qū)；
[0016]m為選自1-20的整數(shù)。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)具有選自下組的一個或多個特征:
[0018](i)結合區(qū)的長度為5-100個堿基，較佳地5-40個堿基，更佳地10_30個堿基；
[0019](ii)結合區(qū)含有一個或多個poly (A)η區(qū)段，其中η為選自1_100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3_20的整數(shù)；
[0020](iii)結合區(qū)中A堿基的含量≥70%,較佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%，或為100% ；
[0021](iv)結合區(qū)中T堿基和U堿基的總量≤20%,較佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地
(0%。
[0022]在另一優(yōu)選例中，poly (A)η區(qū)段的個數(shù)為1_3個。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的結合區(qū)包括DNA、RNA、和/或PNA構成的單鏈。
[0024]在另一優(yōu)選 例中，所述的過渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的過渡區(qū)是長度為0-50個(較佳地5-20個)堿基組成的
寡核苷酸。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的堿基為T或U，較佳地為Τ。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標記或未標記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的小分子為膽固醇。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的修飾包括:生物素修飾、親和素修飾、羧基修飾、羥基修飾、氨基修飾、糖基修飾、熒光修飾。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的熒光修飾為熒光分子修飾或熒光團修飾。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的納米金顆粒具有選自下組的一個或多個特征:
[0032](I)納米金顆粒的平均粒徑為l-150nm，較佳地為5-lOOnm，更佳地5_20nm ；
[0033](2)在納米金顆粒中，80%以上(較佳地90%以上)的納米金顆粒的粒徑在l_150nm范圍內(nèi)，較佳地在5-100nm范圍內(nèi)。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述納米金顆粒的表面上功能分子的結合密度為IX IO5—5 X IO13 個 /cm2,較佳地為 I X IO7-2 X IO13 個 /cm2,更佳佳地為 I X IO9-2 X IO13 個 /cm2,更佳地為 I X IO11-2 X IO13 個 /cm2，最佳地為 I X IO12— 2 X IO13 個 /cm2。
[0035]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種功能分子，所述的功能分子可通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒表面，并且所述的功能分子具有式1-式III任一所示結構:
[0036]B-L-RI ；
[0037]R-L-B-L-R 11 ；
[0038](B-L-R-L-B)m III ；
[0039]式中，
[0040]B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)；
[0041]R表示功能區(qū)；
[0042]L表示位于B和R之間的任選的過渡區(qū)；[0043]m為選自1-20的整數(shù)。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述功能分子的富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)具有選自下組的一個或多個特征:
[0045](i)結合區(qū)的長度為5-100個堿基，較佳地5-40個堿基，更佳地10_30個堿基；
[0046](ii)結合區(qū)含有一個或多個poly (A)η區(qū)段，其中η為選自1_100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3_20的整數(shù)；
[0047](iii)結合區(qū)中A堿基的含量≥70%,較佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%，或為100% ；
[0048](iv)結合區(qū)中T堿基和U堿基的總量≤20%,較佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地
≤0%。
[0049]在另一優(yōu)選例中，poly (A)η區(qū)段的個數(shù)為1-3個。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述的結合區(qū)包括DNA、RNA、和/或PNA構成的單鏈。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述功能分子的過渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合。
[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的過渡區(qū)是長度為0-50個(較佳地5-20個)堿基組成的
寡核苷酸。
[0053]在另一優(yōu)選例中，所述的堿基為T或U，較佳地為Τ。
[0054]在另一優(yōu)選例中，所述功能分子的功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標記或未標記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。
[0055]在另一優(yōu)選例中，所述的小分子為膽固醇。
[0056]在另一優(yōu)選例中，所述的修飾包括:生物素修飾、親和素修飾、羧基修飾、羥基修飾、氨基修飾、糖基修飾、熒光修飾。
[0057]在另一優(yōu)選例中，所述的熒光修飾為熒光分子修飾或熒光團修飾。
[0058]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種組合物，所述的組合物含有藥學上可接受的載體或檢測學上可接受的載體，以及本發(fā)明第一方面所述的納米金復合物。
[0059]在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的納米金復合物的制備方法，包括步驟:將功能分子與納米金顆粒接觸，使得功能分子通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒的表面，從而形成納米金復合物。
[0060]在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟:
[0061](a)將功能分子與納米金顆?；旌?，獲得功能分子與納米金顆粒的混合溶液；
[0062](b)向步驟(a)的混合溶液中加入老化劑，促進富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)與納米金顆粒的表面的連接，獲得含有第一方面所述的納米金復合物的溶液體系；和
[0063](C)從步驟(b)的溶液中分離所述的納米金復合物。
[0064]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(d):對納米金復合物進行洗滌和/或性能驗證。
[0065]在另一優(yōu)選例中，(b)中所述的老化劑選自下組:氯化鈉溶液、氯化鉀溶液、氯化鎂溶液、或其組合。[0066]在本發(fā)明的第五方面，提供了第一方面所述的納米金復合物的用途，它被用于制備檢測試劑或用于制備調(diào)控基因表達或調(diào)節(jié)蛋白活性的藥物組合物。
[0067]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測產(chǎn)品，所述的產(chǎn)品含有第一方面所述的納米金復合物，所述復合物作為檢測劑。
[0068]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測產(chǎn)品包括測試片、測試條、側流片等。
[0069]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包括第一方面所述的納米金復合物或第六方面所述的檢測產(chǎn)品。 [0070]在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測方法，包括步驟:將第一方面所述的納米金復合物用作檢測劑，進行檢測。
[0071]在另一優(yōu)選例中，在檢測時觀察/檢測所述檢測劑與待測物形成的復合物。
[0072]在另一優(yōu)選例中，在檢測時觀察/檢測因所述檢測劑與待測物的相互作用所導致的變化，所述變化包括:顏色變化或熒光變化。
[0073]在另一優(yōu)選例中，在本發(fā)明第一方面所述的納米金復合物中，功能分子的功能區(qū)為核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、凝集素、膽固醇。
[0074]在另一優(yōu)選例中，所述方法用于檢測核酸、小分子(如ATP)、金屬離子(如鉛、汞、銅、銀等)、蛋白、多肽、多糖等。
[0075]在另一優(yōu)選例中，納米金復合物的功能分子的功能區(qū)為核酸，用于檢測序列與功能區(qū)核酸互補的目標多核苷酸。
[0076]在另一優(yōu)選例中，2種或2種以上的納米金復合物同時與目標多核苷酸結合。
[0077]在另一優(yōu)選例中，所述的目標多核苷酸為DNA或RNA。
[0078]在另一優(yōu)選例中，納米金復合物的功能分子的功能區(qū)為核酸適配體，用于檢測核酸適配體的底物。
[0079]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸適配體還包括核酸適配體的活性片段或其互補序列。
[0080]在另一優(yōu)選例中，納米金復合物的功能分子的功能區(qū)為核酶，用于檢測金屬離子。
[0081]在另一優(yōu)選例中，所述的核酶為DNAzyme或RNAzyme。
[0082]在另一優(yōu)選例中，所述的核酶還包括核酶的活性片段，以及核酶或其活性片段的互補序列。
[0083]在另一優(yōu)選例中，納米金復合物的功能分子的功能區(qū)為抗體，用于檢測抗原。
[0084]在本方面的第九方面，提供了一種檢測溶液中待測物的方法，包括步驟:將第一方面所述的納米金復合物加入所述的溶液，使得所述納米金復合物上的功能分子與待測物結合或作用，并檢測溶液的變化。
[0085]在另一優(yōu)選例中，所述的溶液的變化為顏色變化或熒光變化。
[0086]在另一優(yōu)選例中，所述的待測物質(zhì)選自下組:核酸、多肽、ATP，金屬離子(如鉛、汞、銅、銀等)。
[0087]在本方面的第十方面，提供了一種體外非治療性的基因調(diào)控方法，包括步驟:在培養(yǎng)體系中加入第一方面所述的納米金復合物，并且所述的功能分子具有調(diào)控目標基因表達的核苷酸序列。
[0088]在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控目標基因表達的核苷酸序列為MiCT0RNA、干擾RNA、反義RNA等。[0089]在另一優(yōu)選例中，所述的功能分子還可以包括多肽分子(如TAT多肽)等。
[0090]應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0091]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0092]圖1顯示了本發(fā)明一種優(yōu)選的納米金復合物的示意圖；結合于納米金表面的功能分子包括三部分:結合區(qū)、過渡區(qū)和功能區(qū)；結合區(qū)利用腺嘌呤與金之間的親和作用力固定到納米金表面，并且能通過改變結合區(qū)調(diào)控探針之間的距離；過渡區(qū)位于結合區(qū)和功能區(qū)之間，起連接過渡作用；功能區(qū)為實現(xiàn)具體功能所需的功能分子。
[0093]圖2顯示不同體系的DNA-納米金在不同離子強度下的電解質(zhì)溶液中的穩(wěn)定性，圖2a右側為該體系在不同離子強度的電解質(zhì)溶液中所呈現(xiàn)的顏色，紅色說明該納米金在溶液中分散良好，紫色或藍色說明納米金發(fā)生聚合，結果顯示該體系的耐鹽度很低，在NaCl濃度僅為50mM時溶液顏色即變紫，離子強度更高時顏色即變?yōu)樗{色，該體系在高離子強度的電解質(zhì)溶液中穩(wěn)定性較差。圖2b顯示在含多聚腺嘌呤核苷酸結合區(qū)的DNA與金納米粒子的體系中，PolyA能夠?qū)⒐丫酆塑账峤Y合在納米金上，寡聚核苷酸表面的負電荷使納米金在高離子強度的電解質(zhì)溶液中仍然能夠良好地分散，在離子濃度高達0.3M的NaCl電解質(zhì)溶液中仍十分穩(wěn)定。圖2c顯示巰基修飾的寡聚核苷酸與金納米粒子結合的體系中在高離子強度的電解質(zhì)溶液中也有很好的穩(wěn)定性。
[0094]圖3顯示三種納米金寡聚核苷酸-納米金樣品溶液的紫外可見吸收光譜圖；圖3a顯示DNA中不含多聚腺嘌呤核苷酸組成的結合區(qū)polyA與金納米粒子的體系在不同NaCl濃度下的紫外可見吸收光譜，說明該體系在無鹽時分散性良好，在體系中含有300mMNaCl時納米金即發(fā)生聚合；圖3b和圖3c分別顯示含有多聚腺嘌呤核苷酸組成的結合區(qū)的DNApolyA與金納米粒子的體系和巰基修飾的寡聚核苷酸與金納米粒子結合的體系在無鹽和300mM NaCl時體系的紫外可見吸收光譜圖。
[0095]圖4顯示含有多聚腺嘌呤核苷酸結合區(qū)的DNA-納米金復合體系對其互補富T鏈的雜交解析作用具有良好的抵抗力；所使用的含有多聚腺苷寡聚核苷酸一端標記有熒光基團FAM，另一端為包含不同數(shù)目的腺嘌呤堿基的polyA，分別含有10個腺嘌呤核苷酸(polyAlO,圖4a)，15個腺嘌呤核苷酸(polyA15,圖4b)，20個腺嘌呤核苷酸(polyA20,圖4c) ,30個腺嘌呤核苷酸(polyA30,圖4d);各圖中blank線為不經(jīng)處理的寡聚核苷酸-納米金體系的熒光光譜圖，各圖中(polyTIO或polyT15或polyT20或polyT30)線為用同樣長度的多聚胸腺嘧啶核苷酸與納米金復合體系雜交處理后體系的熒光光譜圖，各圖中MCH線表示用巰基己醇(MCH)取代處理后的納米金復合體系的熒光光譜圖。
[0096]圖5顯示通過改變polyA結合區(qū)的長度可以調(diào)控納米金上DNA的組裝密度；圖5a為隨著寡聚核苷酸中PolyA結合區(qū)長度的增加，金納米粒子表面所結合的DNA的密度逐漸降低的理論示意圖；圖5b為通過熒光光譜的檢測和計算得到含有不同長度polyA(從左到右依次含有polyA5、polyA10、polyA15、polyA20、polyA30)的DNA在納米金上的組裝密度，縱坐標為納米金粒子上連接的寡聚核苷酸的密度，結果顯示隨著polyA長度的增加，納米金粒子上組裝的寡聚核苷酸密度逐漸降低，與理論示意圖5a—致；圖5c顯示為通過計算得到的納米金粒子表面所吸附的脫氧腺嘌呤核苷酸的密度。
[0097]圖6顯示為含有不同長度polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物納米金流體動力學直徑的動態(tài)光散射檢測圖。圖中，從上到下依次為含有polyA5、pOlyA10、pOlyA15、pOlyA20、polyA30的復合體系的流體動力學直徑。
[0098]圖7顯示含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物的功能區(qū)部分采取了一種延伸且直立的構型；圖中由上到下分別為巰基修飾的寡聚核苷酸-納米金復合物、含有Po I yA結合區(qū)的DNA-納米金復合物的流體動力學直徑的動態(tài)光散射檢測結果。
[0099]圖8顯示通過polyA結合區(qū)組裝的DNA-納米金復合物的熱動力學性質(zhì)；圖8a為通過polyA組裝的寡聚核苷酸-納米金與完全互補的目標雜交物的的熱解曲線，顯示溫度轉折點在70°C左右；圖8b為通過polyA組裝的寡聚核苷酸-納米金復合結構在一系列溫度循環(huán)中的循環(huán)等離子振動變化；當溫度有序地在熔鏈點(約70°C )上(80°C )下(60°C )循環(huán)時，顏色會重復地在紅色(說明顆粒是分散的)和藍色(說明顆粒是聚集的)之間可逆變化。[0100]圖9顯示基于POlyA組裝的寡聚核苷酸_納米金體系具有非?？斓碾s交動力學，圖9a顯示將兩種通過polyA組裝的DNA-納米金納米金復合物與互補DNA鏈混合后Omin (a曲線)，Imin (b曲線)，IOmin (c曲線)，20min (d曲線)9,40min (e曲線)反應過程的紫外可見吸收光譜圖；圖9b顯示將兩種通過巰基組裝的DNA-納米金與互補DNA鏈混合后Omin (a曲線)，Imin (b曲線)，IOmin (c曲線)，20min(d曲線)，40min(e曲線)時體系的紫外可見吸收光譜圖。上述結果顯示基于polyA組裝的體系紫外可見吸收峰在40min內(nèi)紅移了 80nm,而巰基組裝的體系在40min內(nèi)僅移動了 13nm，表明基于polyA組裝的體系由于雜交作用，納米金較快發(fā)生了較大程度的聚集，基于PolyA組裝的寡聚核苷酸-納米金體系比基于巰基的體系雜交動力學更快。
[0101]圖10顯示基于polyA結合和基于巰基組裝的寡聚核苷酸-納米金體系納米金的雜交動力學對比；圖1Oa顯示通過計算兩種體系的與反應時間和聚合反應幾何學有關的特征時間τ和與聚合生長的物理過程有關的Avrami指數(shù)η比較兩種體系的反應動力學；圖1Ob顯示為兩種納米結合體系在IOmin內(nèi)檢測不同濃度(0.5，1，2，4，6，8，IOnM)物的目標DNA的Α650/Α520快速(IOmin內(nèi))比值色檢測的劑量反應曲線和相對應的體系顏色變化。
[0102]圖11顯示基于含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合探針可以通過熒光檢測，實現(xiàn)對目標DNA的定量分析。
[0103]圖12顯示含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合探針可以實現(xiàn)對目標DNA的定量分析；圖中的待測DNA濃度分別為0.5nM, InM, 2ηΜ, 4ηΜ, 6ηΜ, 8ηΜ, ΙΟηΜ。Α650/Α520為各待測DNA濃度下紫外可見吸收光譜圖中650nm和520nm處吸光度信號強度的比值。
[0104]圖13顯示含有polyA結合區(qū)的核酸適配體-納米金復合探針可以實現(xiàn)對ATP分子的定量分析；圖中目標ATP的濃度依次分別為0.1mM, 0.5mM, 1.5mM, ImM, 2mM ；A520為各待測ATP濃度下紫外可見吸收光譜圖中520nm處吸光度信號強度。
[0105]圖14顯示含有polyA結合區(qū)的寡聚核苷酸-納米金復合探針可以實現(xiàn)對鉛離子的定量分析；圖中顯示鉛離子濃度與紫外光譜信號的對應關系圖。其中鉛離子濃度依次分別為2μΜ，4μΜ，6μΜ，8μΜ，10μΜ。Α520為各待測鉛離子濃度下紫外可見吸收光譜圖中520nm處吸光度信號強度。
[0106]圖15是顯示含有polyA結合區(qū)的抗體-納米金復合探針可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)TNF-a的定量分析；圖中顯示蛋白質(zhì)TNF-a濃度與紫外光譜信號的對應關系圖。其中，圖中的TNF_a 濃度依次分別為 Ing/mL, 2ng/mL, 4ng/mL, 6ng/mL。A650/A520 為各待測 TNF_a 濃度下紫外可見吸收光譜圖中650nm和520nm處吸光度信號強度的比值。
[0107]圖16顯示通過poly A結合于金表面的siRNA-納米金復合物對對細胞內(nèi)目標基因表達抑制效果圖。
【具體實施方式】
[0108]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，功能分子可以通過富含腺嘌呤核苷酸(A)或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)與納米金顆粒的表面結合，從而形成納米金復合物；所述功能分子包括富含A的寡核苷酸結合區(qū)、功能區(qū)和位于結合區(qū)和功能區(qū)之間過渡區(qū)。本發(fā)明的納米金復合物可實現(xiàn)納米金表面上功能分子密度的自我調(diào)控；在納米尺度上可以精確控制功能分子之間的距離，充分保證功能區(qū)的識別活性，促進功能區(qū)對目標分子的檢測能力。在此基礎上完成了本發(fā)明。
[0109]術語
[0110]納米金
[0111]如本文所用，術語“納米金”或“納米金顆?！笨梢曰Q使用，都是指一種微小的，其平均粒徑為l-150nm。納米金顆粒具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物分子結合，且不影響其生物活性。
[0112]在本發(fā)明中，優(yōu)選的納米金顆粒為5-100nm,更佳地為5-20nm。在納米金顆粒的群體中，80%以上(較佳地90%以上)的納米金顆粒的粒徑在l_150nm范圍內(nèi)，優(yōu)選在5-100nm范圍內(nèi)。
[0113]本領域的普通技術人員可以商業(yè)購買途徑(如向Sigma-Aldrich公司購買)或常規(guī)方法制備獲得。
[0114]功能分子
[0115]本申請?zhí)峁┝艘环N新的功能分子，該功能分子可通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒表面。
[0116]本發(fā)明的的功能分子具有式1-式III任一所示結構:
[0117]B-L-RI ；
[0118]R-L-B-L-R 11 ；
[0119](B-L-R-L-B)m III ；
[0120]式中，B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)；R表示功能區(qū)山表示位于B和R之間的任選的過渡區(qū)；m為選自1-20的整數(shù)。
[0121]在本發(fā)明中，富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)具有選自下組的一個或多個特征:(i)結合區(qū)的長度為5-100個堿基，較佳地5-40個堿基，更佳地10-30個堿基；(ii)結合區(qū)含有一個或多個poly (A) η區(qū)段，其中η為選自1-100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3-20的整數(shù)；(iii)結合區(qū)中A堿基的含量≥70%,較佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%，或為100% ； (iv)結合區(qū)中T堿基和U堿基的總量(20%，較佳地< 10%，更佳地< 5%，最佳地< 0%。本發(fā)明優(yōu)選poly(A)n區(qū)段的個數(shù)為1_3個。更優(yōu)選地，結合區(qū)包括DNA、RNAjP /或PNA構成的單鏈。
[0122]在本發(fā)明中，過渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合。過渡區(qū)優(yōu)選為長度為0-50個(較佳地5-20個)堿基組成的寡核苷酸；所述的堿基為T或U，較佳地為T。
[0123]在本發(fā)明中，功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標記或未標記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。所述的小分子也可以為膽固醇。所述的修飾包括:生物素修飾、親和素修飾、羧基修飾、羥基修飾、氨基修飾、糖基修飾、熒光修飾。熒光修飾為熒光分子修飾或熒光團修飾。
[0124]如本文所用，術語“核酸適配體”或“Apatmer ”可以互換使用，都是指一段DNA或RNA序列，該序列能夠與多種目標物質(zhì)高特異性高敏感性高選擇性的結合，當核酸適配體與特定的目標物質(zhì)發(fā)生結合時，核酸適配體自身的結構發(fā)生變化，這種變化可以進行檢測。本領域的普通技術人員使用常規(guī)方法(如體外篩選技術等)可以對核酸適配體的序列進行選擇；使用全人工化學方法制備所述的核酸適配體。此外，所述的核酸適配體還包括核酸適配體的活性片段或其互補序列。
[0125]如本文所用，術語“核酶”是指具有催化活性的核酸序列，其化學本質(zhì)雖然是核酸，卻具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是分子中的特定部位。核酶包括DNAzyme或RNAzyme等,所述的核酶還包括核酶的活性片段，以及核酶或其活性片段的互補序列。一種優(yōu)選的DNAzyme底物鏈(substrate strand)序列如下:
[0126]5，-ACTCATCTGTGAACTCACTAT @ GGAAGAGATGTGTCAACTCGTG-3，
[0127]其中，rA代表組成RNA的腺嘌呤核糖核苷酸，其他的都代表組成DNA的脫氧核糖核苷酸，形成了切割位點(cleavage site)。
[0128]納米金復合物
[0129]如本文所用，術語“納米金復合物”、“納米金復合”、“納米金-功能分子復合物”或“納米金-功能分子復合體”可以互換使用，所述復合物或復合體包括納米金顆粒和功能分子，并且所述的功能分子通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒表面。
[0130]本發(fā)明納米金復合物的表面上具有適宜的功能分子的結合密度，所述密度為I X IO5— 5 X IO13 個 /cm2，較佳地為 I X IO7— 2 X IO13 個 /cm2,更佳地為 I X IO9— 2 X IO13 個 /cm2，更佳地為 I X IO11— 2 X IO13 個/cm2，最佳地為 I X 1012—2 X IO13 個/cm2。
[0131]本發(fā)明納米金復合物的納米金顆粒的平均粒徑為l_150nm,較佳地為5-100nm,更佳地5-20nm。在納米金顆粒中，80%以上(較佳地90%以上)的納米金顆粒的粒徑在l_150nm范圍內(nèi)，較佳地在5-100nm范圍內(nèi)。
[0132]本發(fā)明還提供了納米金復合物的制備方法:將功能分子與納米金顆粒接觸，使得功能分子通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒的表面，從而形成納米金復合物。[0133]在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，包括步驟:將功能分子與納米金顆粒混合，獲得功能分子與納米金顆粒的混合溶液；加入老化劑，促進富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)與納米金顆粒的表面的連接，獲得含有納米金復合物的溶液體系；從溶液中分離納米金復合物。優(yōu)選地，還包括步驟:對納米金復合物進行洗滌和/或性能驗證。本領域的普通技術人員可以選用常規(guī)的老化劑，如氯化鈉溶液、氯化鉀溶液、氯化鎂溶液等。
[0134]本發(fā)明還提供了納米金復合物的應用方法，它被用于制備檢測試劑或用于制備調(diào)控基因表達或調(diào)節(jié)蛋白活性的藥物組合物。
[0135]本發(fā)明提供了一種檢測產(chǎn)品，它含有本發(fā)明的納米金復合物，將其作為檢測劑；該檢測產(chǎn)品抗原包括測試片、測試條、側流片等。 [0136]本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，它包括本發(fā)明的納米金復合物或上述的檢測產(chǎn)
品O
[0137]可以將本發(fā)明所述的納米金復合物用作檢測劑，進行檢測；在檢測中，優(yōu)選觀察/檢測所述檢測劑與待測物形成的復合物或觀察/檢測因所述檢測劑與待測物的相互作用所導致的變化；所述變化可以包括:顏色變化或熒光變化。
[0138]本發(fā)明還提供了一種應用納米金復合物進行體外非治療性的基因調(diào)控方法:在培養(yǎng)體系中加入納米金復合物，所述的功能分子具有調(diào)控目標基因表達的核苷酸序列。調(diào)控目標基因表達的核苷酸序列為優(yōu)選MicroRNA、干擾RNA、反義RNA。的功能分子還可以包括多肽分子(如TAT多肽)等。
[0139]如本文所用，術語“TAT”或“TAT多肽”可以互換使用，將TAT與目標分子連接，TAT多肽可以幫助目標分子進入細胞(核)。一種優(yōu)選的TAT多肽序列如SEQ ID NO:24所示。
[0140]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:
[0141]1.本發(fā)明的納米金復合物可實現(xiàn)納米金表面上連接上的功能分子密度的自我調(diào)控，通過控制功能分子之間的距離，充分保證功能區(qū)的識別活性，促進功能區(qū)對目標分子的檢測能力；
[0142]2.本發(fā)明的納米金復合物，其功能分子通過富A結合區(qū)結合于納米金顆粒的表面，使得功能分子中的功能區(qū)采用更加延伸且直立的構型，促進功能區(qū)與目標分子的識別效率；
[0143]3.本發(fā)明的制備納米金復合物的方法簡單，成本低廉，無需任何化學修飾和人工合成的部分。
[0144]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0145]部分實驗材料
[0146]所有使用納米金粒子均購自Sigma-Aldrich公司，所有的寡聚核苷酸由TaKaRa公司(Dalian，China)合成并純化。實驗中所用儀器:紫外-可見分光光度計(U-3010紫外可見光譜，日立，日本東京)；熒光光譜儀(F-4500，日立，日本東京)；DelsaTM納米亞微米粒度和Zeta電位粒度儀，貝克曼庫爾特公司；真彩色數(shù)碼相機(尼康)。
[0147]實驗方法[0148]納米金復合物的組裝[0149]首先將金納米顆粒與含富A寡聚核苷酸結合區(qū)的功能分子以一定的比例(功能分子:納米金=200:1)混合，輕輕吹打使混勻，室溫孵育16小時后，加入IM PBS(1M NaCl/0.1MPB，ρΗ7.0)使其終濃度為0.1M PBS (分5~6次加入，5min/次間隔)，室溫下放置16h，12000r，4°C，20min 離心，吸棄上清，加入等量的 0.1M PBS (0.1M NaCl/lOmM PB, ρΗ7.0)洗離三次，雜交溶液(0.3MNaCl/10mM PB, pH7.0)懸浮，4°C冰箱長期保存。
[0150]納米金復合物表面DNA密度的定量檢測
[0151]向含有組裝好的DNA-納米金復合體的溶液中加入巰基己醇(MCH)(終濃度為20mM)，在室溫下震蕩并過夜培育，巰基己醇可以將寡聚核苷酸從納米金表面上取代下來；將被取代下來的DNA探針通過離心法進行分離，上清液在熒光分光光度計(F-4500，日立公司，東京，日本)下進行熒光檢測；將該熒光值與通過標準曲線法得到的熒光線性曲線對應，得到DNA的濃度從而計算得出DNA的物質(zhì)量。熒光標準曲線是在相同pH的緩沖中，同樣的離子強度和巰基乙醇濃度下用已知濃度的熒光標記的寡聚核苷酸檢測熒光得到的。納米金的濃度由紫外可見吸收光譜(U-3100紫外可見吸收光譜，日立公司，東京，日本)測得，即根據(jù)納米金在520nm處的吸收強度，代入摩爾吸光系數(shù)計算求得納米金的濃度從而計算得出納米金的物質(zhì)量。納米金表面組裝的DNA密度等于DNA的物質(zhì)量除以納米金物質(zhì)的量。
[0152]納米金表面組裝的功能序列的雜交效率檢測方法
[0153]向200 μ 1，IOnM合成好的含富A結合區(qū)的DNA-納米金復合物中加入3 μ M與其功能區(qū)核酸序列互補的有熒光標記的DNA鏈，在雜交條件(0.3Μ PBS, ρΗ7)下反應24h。用磷酸鹽緩沖清洗混合物兩次，通過離心除去未雜交的DNA ;通過加入氫氧化鈉(終濃度大于50mM,pHll-12)反應2h，使雜交結合的熒光標記的DNA與DNA-納米金復合物解離。通過離心分離出解離的熒光標記的DNA，加入IM HCl將pH調(diào)回中性，用熒光光度計檢測其熒光強度，通過與標準曲線對比得到雜交在多聚腺苷寡聚核苷酸-納米金復合物上的DNA濃度。
[0154]動力學實驗方法
[0155]在自組裝動力學的研究中，向50 μ L含有8nM DNA-納米金復合物(兩種DNA-納米金復合物探針1:1混合)的0.3Μ PBS雜交緩沖溶液中加入2μ L適當?shù)腎Oy M的DNAlinker，兩種DNA-納米金復合物中的DNA功能區(qū)分別與DNAlinker中的不同區(qū)段的序列互補。每兩分鐘進行紫外-可見光譜檢測。
[0156]熔鏈分析方法
[0157]通過使用溫度控制儀(PolyScience)在25_80°C之間調(diào)控溫度,用紫外可見分光光度計記錄不同溫度下復合物的紫外可見吸收光譜。
[0158]動態(tài)光散射(DLS)檢測方法
[0159]將1.5mL3nM的組裝好的DNA-納米金復合物加入到比色皿中，使用Delsa? NanoSubmicron Particle Size and Zeta potential Particle Analyzer (貝克曼庫爾特公司)進行檢測。
[0160]實施例1
[0161]納米金復合物的組裝
[0162]首先將金納米顆粒與含富A寡聚核苷酸結合區(qū)的功能分子以一定的比例(DNA/納米金為200:1)混合，輕輕吹打使混勻，室溫孵育16小時后，加入IMPBSdM NaCl/0.1M PB，ρΗ7.0)使其終濃度為0.1M PBS (分5~6次加入，5min/次間隔)，室溫下放置16h，12000r,4°C，20min離心，吸棄上清，加入等量的0.1M PBS (0.1M NaCl/lOmM PB, pH7.0)洗離三次，雜交溶液(0.3M NaCl/lOmMPB, pH7.0)懸浮，4°C冰箱長期保存。圖1顯示了功能分子和納米金復合物的示意圖。
[0163]實施例2
[0164] 含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物在電解質(zhì)溶液中的穩(wěn)定性
[0165]為了確定寡聚核苷酸DNA可以通過其結構中的polyA結合區(qū)穩(wěn)定地連接到納米金表面，本實施例取三種DNA樣品:(a) DNA中無多聚腺嘌呤核苷酸(polyA)組成的結合區(qū)、(b) DNA中含有多聚腺嘌呤核苷酸組成的結合區(qū)A10、(c) DNA端部修飾巰基基團，上述DNA中過渡區(qū)為T5，功能區(qū)均為ATgAT gTTCg TTgTgo上述三種DNA分別和IOnm納米金顆粒納米金形成DNA-納米金復合物，對其在不同離子強度的電解質(zhì)溶液的穩(wěn)定性進行比較。
[0166]實驗原理:分散在溶液中的粒徑為IOnm的納米金呈紅色，納米金聚集后由于表面等離子共振效應會使其顏色發(fā)生藍移，沒有修飾DNA的納米金在高離子強度環(huán)境中不穩(wěn)定，容易發(fā)生聚集；修飾在納米金表面上DNA可以使納米金穩(wěn)定存在于高離子強度環(huán)境中。
[0167]實驗結果如圖2和圖3所示，含polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物和巰基修飾的DNA-納米金復合物在離子濃度高達0.3M的NaCl電解質(zhì)溶液中仍然保持紅色并且在520nm處有一個明顯的特征吸收峰，表明polyA和巰基有相同的作用，可以使DNA連接到納米金上，并可以使納米金在高離子強度環(huán)境下保持很好的穩(wěn)定性；與之相反，不含PolyA結合區(qū)的DNA-納米金體系非常不穩(wěn)定，在NaCl濃度僅為20mM時，溶液顏色就有所變化并且其紫外吸收峰發(fā)生藍移，在離子強度變高后顏色即變?yōu)樗{色，這種顏色變化說明金膠已經(jīng)發(fā)生聚合，證明不含polyA的DNA多聚腺苷寡聚核苷酸不能穩(wěn)定結合到納米金表面。
[0168]上述實驗結果表明，功能分子可以通過與之連接的polyA結合區(qū)穩(wěn)定地結合到納米金表面。
[0169]實施例3
[0170]含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物的熱穩(wěn)定性
[0171]DNA-納米金復合物的熱穩(wěn)定性對其實際用途中有很重要的影響，為了證明含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物有很好的熱穩(wěn)定性，本實施例使用一條有熒光素標記的含PolyA的寡聚核苷酸，將其連接到納米金上，并檢測它們從納米金上隨著溫度變化的解吸過程。
[0172]實驗原理:納米金具有猝滅熒光的能力，連接在納米金表面上修飾了熒光分子的DNA表現(xiàn)出很低熒光值，如果修飾了熒光分子的DNA從金表面脫落下來，體系的熒光值就會升高。
[0173]實驗結果表明，含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物高度耐熱，即使在高溫(900C )時，仍只有很少的DNA從納米金表面脫離，這與巰基DNA-納米金復合物的穩(wěn)定性相當。
[0174]上述結果表明含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物具有良好的熱穩(wěn)定性。
[0175]實施例4
[0176]富T鏈對含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物不產(chǎn)生影響
[0177]由于本發(fā)明中DNA是通過一段polyA結合區(qū)和納米金結合，這種DNA-納米金復合物的穩(wěn)定性可能會由于與結合區(qū)序列互補的DNA(富T序列)的雜交作用而變得比較低。本實施例將一系列修飾了突光分子的富A序列(polyA1(l, PolyA15, poIyA20, poIyA30)按照標準步驟組裝到納米金表面上，然后向這些體系中加入高濃度(2μΜ)的與其對應互補的富T鏈(polyT10, PolyT15, polyT20, polyT3(l)。納米金具有粹滅突光的能力,連接在納米金表面上修飾了熒光分子的PolyA序列表現(xiàn)出很低熒光值，如果修飾了熒光分子的polyA從表面取代下來，體系的熒光值就會升高。
[0178]結果如圖4所示，由于納米金對連接在DNA末端的熒光分子FAM有淬滅作用，因此復合體系的熒光值幾乎為零，MCH可以將DNA從納米金上取代下來，導致體系的熒光值升高；而同等長度的poly dT處理后的DNA-納米金復合體系與未經(jīng)處理時的熒光強度相當，表明只有極少量金納米粒子上的PolyA被A-T互補雜交作用取代下來。
[0179]上述結果 表明，納米金上所吸附的polyA非常穩(wěn)定，可以抵抗富A-富T之間的雜交解吸作用。
[0180]實施例5
[0181]PolyA結合區(qū)的長度對功能分子在納米金表面上組裝密度的影響
[0182]本實施例試圖通過改變polyA結合區(qū)的長度，從而實現(xiàn)從空間上調(diào)控組裝在納米金表面上功能分子密度的目的。
[0183]使用一系列結合區(qū)不同長度熒光基團標記的含多聚腺苷寡聚核苷酸，按照標準方法將其組裝到納米金表面，然后利用基于取代反應的熒光法定量金納米粒子表面DNA的組裝密度。如圖5所示，隨著polyA長度的增加，納米金粒子上組裝的寡聚核苷酸密度逐漸降低(圖5a、圖5b)。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)不論polyA結合區(qū)長度為多少，納米金粒子表面所吸附的腺嘌呤核苷酸的數(shù)目沒有顯著的差別(圖5c)，說明結合區(qū)所有腺嘌呤核苷酸都可以完全吸附在金納米顆粒的彎曲表面，實現(xiàn)表面的完全覆蓋。
[0184]上述結果表明可以通過調(diào)節(jié)含多聚腺苷結合區(qū)的長度來調(diào)控功能分子在納米金表面上組裝密度。
[0185]實施例6
[0186]含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物上功能區(qū)DNA與目標DNA的雜交效率
[0187]DNA-納米金復合物上的DNA雜交活性對其在生物檢測和生物效應等實際應用中有重要的影響。傳統(tǒng)利用巰基結合于納米金的DNA-納米金復合物，由于其納米金表明的DNA形態(tài)和DNA密度的影響導致其功能區(qū)DNA探針雜交效率很低。含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物,理論上其polyA部分不僅可以使功能分子連接到納米金表面上,還可能屏蔽納米金表面上非特異性作用位點，使功能分子在納米金表面呈垂直構型，保持高的生物活性。
[0188]在本實施例中，發(fā)明人研究了含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物上功能區(qū)DNA與目標DNA的雜交效率。首先制備一系列含不同長度polyA結合區(qū)的DNA，其過渡區(qū)均為T5，功能區(qū)均為ATgAT gTTCg TTgTg，然后檢測它們與互補DNA鏈的雜交效率。
[0189]實驗結果如表1所示，含有polyA結合區(qū)的DNA-納米金復合物上功能區(qū)DNA與目標DNA的雜交效率顯著提高，比基于巰基修飾的DNA-納米金復合物的雜交效率(約5%-10%)提高了一個數(shù)量級；而且隨著polyA長度的增加，功能區(qū)DNA的雜交效率逐漸提高，含polyA5的DNA的雜交效率約為42%，含polyA30的DNA的雜交效率達到約90%。[0190]表1
【權利要求】
1.一種納米金復合物，其特征在于，所述復合物包括納米金顆粒和功能分子，并且所述的功能分子通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒的表面。
2.如權利要求1所述的納米金復合物，其特征在于，所述的功能分子具有式1-式III任一所示結構: B-L-RI ； R-L-B-L-R II；
(B-L-R-L-B)m III ； 式中， B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)； R表示功能區(qū)； L表示位于B和R之間的任選的過渡區(qū)； m為選自1-20的整數(shù)； 或優(yōu)選地， 所述的富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)具有選自下組的一個或多個特征: (i)結合區(qū)的長度為5-100個堿基，較佳地5-40個堿基，更佳地10-30個堿基； (?)結合區(qū)含有一個或多個poly (A) η區(qū)段，其中η為選自1_100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3-20的整數(shù)； (iii)結合區(qū)中A堿基的含量>70%，較佳地> 80%，更佳地> 90%，最佳地> 95%，或為100% ； (iv)結合區(qū)中T堿基和U堿基的總量≤20%,較佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地≤0%； 或較佳地， 所述的過渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合； 或優(yōu)選地， 所述的功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標記或未標記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。
3.如權利要求1所述的納米金復合物，其特征在于，所述的納米金顆粒具有選自下組的一個或多個特征: (1)納米金顆粒的平均粒徑為l_150nm，較佳地為5_100nm，更佳地5_20nm； (2)在納米金顆粒中，80%以上(較佳地90%以上)的納米金顆粒的粒徑在l_150nm范圍內(nèi)，較佳地在5-100nm范圍內(nèi)。
4.如權利要求1所述的納米金復合物，其特征在于，所述納米金顆粒的表面上功能分子的結合密度為I X IO5— 5 X IO13個/cm`2，較佳地為I X IO7— 2 X IO13個/cm2，更佳佳地為I X IO9-2 X IO13 個 /cm2,更佳地為 I X 1011—2 X IO13 個 /cm2,最佳地為 I X 1012—2 X IO13 個/ cm2。
5.一種功能分子，其特征在于，所述的功能分子可通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒表面，并且所述的功能分子具有式1-式III任一所示結構: B-L-RI ； R-L-B-L-R II ； (B-L-R-L-B)m III ； 式中， B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)； R表示功能區(qū)； L表示位于B和R之間的任選的過渡區(qū)； m為選自1-20的整數(shù)； 或優(yōu)選地， 所述的富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)具有選自下組的一個或多個特征: (i)結合區(qū)的長度為5-100個堿基，較佳地5-40個堿基，更佳地10-30個堿基； (?)結合區(qū)含有一個或多個poly (A) η區(qū)段，其中η為選自1_100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3-20的整數(shù)； (iii)結合區(qū)中A堿基的含量>70%，較佳地> 80%，更佳地> 90%，最佳地> 95%，或為100% ； (iv)結合區(qū)中T堿基和U堿基的總量≤20%,較佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地≤0%； 或較佳地， 所述的過渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合； 或優(yōu)選地， 所述的功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標記或未標記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。
6.一種組合物，其特征在于，所述的組合物含有藥學上可接受的載體或檢測學上可接受的載體，以及權利要求1所述的納米金復合物。
7.—種權利要求1所述的納米金復合物的制備方法，其特征在于，包括步驟:將功能分子與納米金顆粒接觸，使得功能分子通過富含腺嘌呤核苷酸或其類似物的寡核苷酸結合區(qū)結合于納米金顆粒的表面，從而形成納米金復合物。
8.權利要求1所述的納米金復合物的用途，其特征在于，它被用于制備檢測試劑或用于制備調(diào)控基因表達或調(diào)節(jié)蛋白活性的藥物組合物。
9.一種檢測產(chǎn)品，其特征在于，所述的產(chǎn)品含有權利要求1所述的納米金復合物，所述復合物作為檢測劑。
10.一種檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒包括權利要求1所述的納米金復合物或權利要求9所述的檢測產(chǎn)品。
11.一種檢測方法，其特征在于，包括步驟:將權利要求1所述的納米金復合物用作檢測劑，進行檢測; 或優(yōu)選地， 納米金復合物的功能分子的功能區(qū)為核酸，用于檢測序列與功能區(qū)核酸互補的目標多核苷酸； 或較佳地， 納米金復合物的功能分子的功能區(qū)為核酸適配體，用于檢測核酸適配體的底物； 或優(yōu)選地， 納米金復合物的功能分子的功能區(qū)為核酶，用于檢測金屬離子； 或較佳地， 納米金復合物的功能分子的功能區(qū)為抗體，用于檢測抗原。
12.—種體外非治療性的基因調(diào)控方法，其特征在于，包括步驟:在培養(yǎng)體系中加入權利要求I所述的納米金復合物，并且所述 的功能分子具有調(diào)控目標基因表達的核苷酸序列。
【文檔編號】C12Q1/44GK103540651SQ201210241611
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月12日 優(yōu)先權日:2012年7月12日
【發(fā)明者】樊春海, 裴昊, 黃慶 申請人:中國科學院上海應用物理研究所