專利名稱：合成雙功能復(fù)合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于得到包含展示分子部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的方法。本發(fā)明還涉及一種用于生成雙功能復(fù)合物庫的方法，一種用于鑒定具有預(yù)選性能的展示分子的方法。
背景技術(shù)：
已經(jīng)開發(fā)出能夠?qū)Χ嚯暮推渌酆衔镞M行合成編碼的方法。該方法的一個例子公開于US 5，723，598，其中涉及雙功能分子庫的生成。雙功能復(fù)合物的一個部分是多肽且另一部分是包含用于編碼和鑒別已參與形成多肽的氨基酸的核苷酸序列的標(biāo)識符寡核苷酸。在生成雙功能分子的庫之后，在對靶親和性方面進行分配且雙功能分子的標(biāo)識符寡核苷酸部分利用PCR進行擴增。最終，PCR擴增子被測序和解碼用于鑒別具有靶親和性的多肽。雙功能復(fù)合物庫通過一種通常稱作分開-和-混合的方法而制成。該方法意味著接頭分子被分開至空間分離的隔室中并在每個隔室中在一端與特定氨基酸前體反應(yīng)并在另一端通過正交化學(xué)反應(yīng)添加編碼該特定氨基酸前體的核酸標(biāo)簽。隨后，收集(混合)各隔室的內(nèi)容物并隨后再次分開至數(shù)個隔室，用于新一輪的與氨基酸前體和核苷酸標(biāo)簽的交替反應(yīng)。繼續(xù)該分開-和-混合法直至多肽達到所需長度。該已有技術(shù)方法在其應(yīng)用中受到局限，因為用于加入化學(xué)單元或用于加入核苷酸或寡核苷酸序列的兩種交替合成步驟之間必須存在相容的化學(xué)。根據(jù)已有技術(shù)，合成相容性問題通過在合成交替聚合物時正確選擇相容的保護基團，和通過正確選擇用于在一種生長中的聚合物保持被封閉的同時選擇性地去保護另一生長中的聚合物的方法而解決。Halpin和Harbury在WO 00/23458中建議了另一方案，其中所形成的分子不僅被核酸標(biāo)簽鑒別而且被它指導(dǎo)。該方案也基于分開-和-混合技術(shù)，其中使用兩個或多個合成步驟得到組合庫。使用多個核酸模板，其中每個在一端具有化學(xué)反應(yīng)部位點和在整個鏈中分散多個密碼子區(qū)域，每個所述密碼子區(qū)域又規(guī)定不同的密碼子。模板通過密碼子雜交至固定化探針上而分離和隨后每個鏈在化學(xué)反應(yīng)部位與特定選擇的試劑反應(yīng)。隨后，所有的鏈被集中并基于第二密碼子區(qū)域進行第二分配。該分開-和-混合法進行合適的次數(shù)以得到通常IO3至IO6種不同的化合物的庫。該方法的缺點在于必須提供大量的核酸模板。如果需要IO6種不同化合物的最終庫，必須合成總共IO6個核酸模板。這種合成一般麻煩或昂貴，因為核酸模板必須具有相當(dāng)?shù)拈L度以確保密碼子區(qū)域和探針之間足夠的雜交。
在WO 02/074929中，公開了一種用于合成化合物的方法。這些化合物通過起始將包含反密碼子和反應(yīng)性單元的轉(zhuǎn)移單元與具有與其相連的反應(yīng)性單元的模板在允許反密碼子雜交至模板上的條件下接觸和隨后使反應(yīng)性單元反應(yīng)而合成。另外，該方法的缺點在于，必須起始提供大量的核酸模板。使用模板的已有技術(shù)方法的缺點在于，編碼取決于反密碼子和模板之間的鑒別。兩種寡核苷酸之間的雜交可在兩者之間存在足夠互補性時發(fā)生。有時，雜交甚至在寡核苷酸之間不存在完全匹配的情況下發(fā)生。其后果是，如果存在多個轉(zhuǎn)移單元，那么有時模板的密碼子序列不對應(yīng)于實際反應(yīng)的反應(yīng)性單元。該不希望的后果在希望形成庫時甚至更加明顯，因為多個模板和構(gòu)件被估計在反應(yīng)介質(zhì)中相互尋找。如果雜交步驟不完全適當(dāng)，會產(chǎn)生被在模板上的不正確密碼子編碼的分子。這對針對該庫進行的選擇方法產(chǎn)生兩種主要作用。首先，具有編碼結(jié)合配體的密碼子組合的模板會在選擇過程中損失。第二，而且更重要的是，具有編碼非結(jié)合性配體的密碼子組合的模板將被富集。本發(fā)明的一個方面的目的是提供一種用于得到被編碼分子的非模板依賴性方法，所述方法使得多種化學(xué)能夠被應(yīng)用于被編碼分子的形成，因為可避免相容的正交保護基團在被編碼分子和寡核苷酸標(biāo)簽的交替形成中的應(yīng)用。本發(fā)明在一個優(yōu)選方面意欲改進以前 在密碼子鑒別過程中顯示的易錯雜交方法。另外，本發(fā)明的目的是減少所形成的非特異性反應(yīng)產(chǎn)物。因此，在本發(fā)明的一個方面，本方法具有固有校正性質(zhì)以確保表現(xiàn)型被基因型準(zhǔn)確地編碼。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于得到包含展示分子(display molecule)部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的方法，其中包含化學(xué)反應(yīng)部位和用于酶加入標(biāo)簽(tag)的引發(fā)部位(priming site)的新生雙功能復(fù)合物在化學(xué)反應(yīng)部位與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng),并且在引發(fā)部位上使用一種或多種酶給該復(fù)合物提供標(biāo)識反應(yīng)物的各自的標(biāo)簽。酶一般是底物特異性的，因此標(biāo)簽至引發(fā)部位上的酶加入不可能干擾正在形成的展示分子。因此，保護基團在編碼部分以及新生展示分子上的應(yīng)用因此可被避免。但可因為其它原因需要保護正生長中的展示分子?？傻玫皆诤陀袡C介質(zhì)中具有活性的酶。但大多數(shù)酶在水介質(zhì)中具有高于在有機介質(zhì)中的活性。因此，在提供標(biāo)簽之前或之后，可能需要改變介質(zhì)以得到可用于反應(yīng)物在化學(xué)反應(yīng)部位上反應(yīng)的條件。一般，展示分子部分通過一種或多種反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位之間一輪以上的反應(yīng)而形成。在本發(fā)明的某些方面，與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)和提供有各自的標(biāo)簽的新生雙功能復(fù)合物進一步一次或多次與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)和向其提供各自的標(biāo)識標(biāo)簽，得到作為雙功能復(fù)合物的一部分的反應(yīng)產(chǎn)物和包含標(biāo)簽的標(biāo)識部分，所述標(biāo)識部分編碼已參與形成反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)物的身份(identity)。在本發(fā)明的某些方面，反應(yīng)的輪或周期是指，單個反應(yīng)物與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)且用于標(biāo)識反應(yīng)物的各自的標(biāo)簽被提供在用于酶加入的引發(fā)部位上。在本發(fā)明的另一方面，一輪反應(yīng)意味著多個反應(yīng)物在化學(xué)反應(yīng)部位上反應(yīng)且用于標(biāo)識一種或多個，但不必所有的，反應(yīng)物的標(biāo)簽被提供在用于酶加入的引發(fā)部位上。在化學(xué)反應(yīng)部位上的反應(yīng)和標(biāo)簽的加入可按照任何順序發(fā)生，即反應(yīng)可在標(biāo)簽加入之后，同時，或之前發(fā)生。對順序的選擇可取決于酶種類，反應(yīng)條件，和反應(yīng)物種類，以及其它。新生雙功能復(fù)合物包含化學(xué)反應(yīng)部位和用于標(biāo)簽的酶加入的引發(fā)部位。任選地，新生雙功能復(fù)合物還包含連接部分(linking moiety),它連接化學(xué)反應(yīng)部位與引發(fā)部位。連接部分可用于各種目的，如使引發(fā)部位與化學(xué)反應(yīng)部位彼此相距足夠遠(yuǎn)以允許酶進行標(biāo)簽加入和提供雜交區(qū)域。在本發(fā)明的一個方面，連接部分是核酸序列。寡核苷酸的長度優(yōu)選適用于與互補性寡核苷酸雜交，即連接部分中的核苷酸的數(shù)目合適地是8或以上。在某些實施方案中，連接部分通過間隔基連接到化學(xué)反應(yīng)部位上，間隔基包含可選擇性地斷裂的接頭以使展示分子能夠在形成最終雙功能復(fù)合物之后的步驟中脫離編碼部分。新生雙功能復(fù)合物也被稱作生長中的復(fù)合物和表示待根據(jù)本發(fā)明方法處理的起始或中間復(fù)合物。中間復(fù)合物表示已進行一輪或多輪反應(yīng)物反應(yīng)和標(biāo)簽加入的起始復(fù)合物?；瘜W(xué)反應(yīng)部位可包含單個或多個能夠與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)的反應(yīng)基團。在某些方面，化學(xué)反應(yīng)部位包含連接有一個或多個反應(yīng)基團的支架(scaffold)。合適的反應(yīng)基團的例子包括胺，羧酸，硫(thio)，醛，和羥基基團。支架的例子包括苯并二氮雜笨類，甾族’乙內(nèi)酰脲類(hydantiones)，哌嗪類，二酮哌嗪類，嗎啉類,托烷類,香豆素類,喹啉類,吲哚類，呋喃類，吡咯類，藝唑類，氨基酸前體，和噻唑類。另外，化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)基團可以是在可與反應(yīng)物進行反應(yīng)之前必須被活化的前形(pro-form)。例如，反應(yīng)基團可用合適的基團保護，后者需要在可與反應(yīng)物進行反應(yīng)之前被去除。本說明書或權(quán)利要求中的展示分子表示已與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)部位。本發(fā)明的反應(yīng)物包括游離反應(yīng)物以及包含功能實體(funcitional entity)和核酸序列的反應(yīng)物。游離反應(yīng)物參與與化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)和可得到最終展示分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。連接到核酸上的功能實體在本文中可被稱作構(gòu)件(building block)和表示功能實體能夠在化學(xué)反應(yīng)部位上反應(yīng)的化學(xué)實體。在本發(fā)明的某些方面，功能實體從核酸部分上分開和轉(zhuǎn)移至化學(xué)反應(yīng)部位。構(gòu)件的寡核苷酸可具有或不具有關(guān)于功能實體身份的信息。在本發(fā)明的某些實施方案中，反應(yīng)物是包含與連接部分足夠互補從而能夠雜交的寡核苷酸，可轉(zhuǎn)移的功能實體，和用于標(biāo)識該功能實體的反密碼子的構(gòu)件。游離反應(yīng)物一般不連接到核酸上，除非在最終展示分子中需要核酸組分。游離反應(yīng)物可具有任何化學(xué)結(jié)構(gòu)和優(yōu)選包含反應(yīng)基團或其前體，它們能夠與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)。反應(yīng)基團的例子包括羥基基團，羧酸基團，硫醇，異氰酸酯，胺，酯，和硫酯。任選地，可存在其它的反應(yīng)物介導(dǎo)游離反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位之間的連接。構(gòu)件的功能實體就與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)的要求而言類似游離反應(yīng)物。但是，另外，在大多數(shù)情況下需要在該反應(yīng)之后斷開功能實體和核酸之間的連接。任選地，反應(yīng)和斷裂可在單個步驟中發(fā)生。以下詳細(xì)公開各類構(gòu)件。在本發(fā)明的某些方面，游離反應(yīng)物或功能實體不包括核苷酸。新生雙功能復(fù)合物的編碼部分通過使用一種或多種酶向引發(fā)部位加入至少一個標(biāo)簽而形成。進一步的標(biāo)簽可連接到以前的標(biāo)簽上以得到直鏈或支鏈標(biāo)識符(identifier)。只要標(biāo)識符的至少一個標(biāo)簽通過酶催化反應(yīng)而連接,進一步的標(biāo)簽可使用化學(xué)方式或酶方式根據(jù)試驗者的意愿而提供。在本發(fā)明的某些實施方案中，所有的標(biāo)簽使用酶催化反應(yīng)而提供。標(biāo)簽合適地包含識別單元，即可被識別基團識別的單元。識別單元具有攜帶信息以標(biāo)識反應(yīng)物的能力。實際上存在各種不同種類的識別。例子是識別表位的抗體，識別另一蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，識別蛋白質(zhì)的mRNA，和識別互補性寡核苷酸序列的寡核苷酸。一般優(yōu)選的是，標(biāo)簽是核苷酸序列。雙功能復(fù)合物的編碼部分在本發(fā)明的優(yōu)選方面是可擴增的。被擴增的能力使得能夠在選擇過程中使用低量的雙功能復(fù)合物。如果標(biāo)簽是蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可通過連接已編碼其合成的mRNA，由mRNA生成cDNA和使所述mRNA經(jīng)受翻譯體系而擴增。這些體系公開于WO 98/31700，其內(nèi)容在此通過參考并入本發(fā)明。用于擴增蛋白質(zhì)標(biāo)簽的另一方法是使用噬菌體展示的蛋白質(zhì)。但一般來說，標(biāo)簽是可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如PCR擴增的核苷酸序列。如果兩個或多個標(biāo)簽存在于線性標(biāo)識性寡核苷酸中，所述寡核苷酸一般由某一種類的主鏈結(jié)構(gòu)組成，以允許酶識別該寡核苷酸作為底物。例如，主鏈結(jié)構(gòu)可以是DNA或RNA。新生雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位能夠接受標(biāo)簽。引發(fā)部位的化學(xué)身份取決于所用的標(biāo)簽和特定酶的種類以及其它。如果標(biāo)簽是多核苷酸，引發(fā)部位一般包含接受性核苷酸的3’ -OH或5’ -磷酸基團，或這些基團的功能衍生物?？捎糜趯?biāo)簽酶促加入引發(fā)部位上的酶包括選自聚合酶，連接酶，和重組酶，和這些酶的組合的酶。
化學(xué)反應(yīng)部位和一種或多種反應(yīng)物之間的反應(yīng)可在有利于該反應(yīng)的合適的條件下進行。在本發(fā)明的一些方面，該反應(yīng)在雜交條件下進行，即在反應(yīng)條件下保持兩種互補性寡核苷酸之間的退火。在本發(fā)明的其它方面，該反應(yīng)在變性條件下進行以使條件合適反應(yīng)發(fā)生。如果生長中的復(fù)合物的編碼部分包含寡核苷酸；所述寡核苷酸在本發(fā)明的一個方面在反應(yīng)過程中是雙鏈形式以減少寡核苷酸的組分和反應(yīng)物之間副反應(yīng)的可能性。用于標(biāo)識反應(yīng)物的標(biāo)簽可使用任何合適的酶而加至引發(fā)部位。在某些實施方案中，標(biāo)簽采用酶延伸反應(yīng)被提供在新生雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位。延伸反應(yīng)可通過聚合酶或連接酶或其組合而進行。使用聚合酶的延伸作用合適地使用反標(biāo)簽寡核苷酸(anti-tagoligonucleotide)作為模板而進行。反標(biāo)簽寡核苷酸在新生雙功能復(fù)合物的寡核苷酸部分的3’端退火，并有一個包含能夠標(biāo)識反應(yīng)物的反密碼子的單鏈突出端。反標(biāo)簽的反密碼子可使用聚合酶和dNTPs混合物被轉(zhuǎn)錄至標(biāo)識符部分上?；蛘撸B接酶用于使用一種或多種寡核苷酸作為底物而加入標(biāo)簽。連接可根據(jù)所用的酶在單鏈或雙鏈態(tài)下進行。一般來說優(yōu)選在雙鏈態(tài)下連接，即所要連接在一起的寡核苷酸通過一種能夠互補這兩個寡核苷酸的末端的互補性寡核苷酸而保持在一起。合適的酶的例子包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶，DNA連接酶，RNA連接酶，Taq DNA聚合酶，Pfu聚合酶，Vent聚合酶，IV-I反轉(zhuǎn)錄酶，Klenow片段,或任何能夠催化互補性元件如單_，二-或多核苷酸的引入的其它酶。也可使用允許錯配延伸的其它種類的聚合酶，例如 DNA 聚合酶 n (Washington 等人，(2001) JBC276 :2263-2266)，DNA 聚合酶I (Vaisman等人，(2001)JBC276 :30615-30622)，或允許延伸錯配退火堿基對的任何其它酶。另一方面，如果使用連接酶，合適的例子包括Taq DNA連接酶，T4DNA連接酶，T4 RNA連接酶，T7 DNA連接酶，和大腸桿菌(E. coli)DNA連接酶。對連接酶的選擇在一定程度上取決于所要連接在一起的末端的設(shè)計。因此，如果末端是平端，T4 RNA連接酶可以是優(yōu)選的，而對于粘性末端連接，即其中每端上的突出端是相互互補的連接，Taq DNA連接酶可以是優(yōu)選的。加至新生雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位上的標(biāo)簽具有有關(guān)反應(yīng)物的信息。在本發(fā)明中以及權(quán)利要求書中，涉及反應(yīng)物的信息被稱作密碼子。除了編碼反應(yīng)物身份的核苷酸的組合，標(biāo)簽可包含其它核苷酸。在本發(fā)明的某些方面，標(biāo)簽包含構(gòu)架序列(framingsequence)。構(gòu)架序列可用于各種目的，如用于反標(biāo)簽的退火區(qū)域和/或用作提供相關(guān)反應(yīng)物已反應(yīng)的合成歷史的時間點信息的序列。密碼子和反應(yīng)物的身份之間的相關(guān)可根據(jù)所需輸出而變化。在某些實施方案中，密碼子用于編碼幾種不同的反應(yīng)物。在隨后的鑒定步驟中，展示分子的結(jié)構(gòu)可根據(jù)對不同的連接化學(xué)，位阻，正交保護基團(orthogonal protection groups)的去保護,等的知識而推斷。在另一實施方案中，同一密碼子用于具有共性，如親油性質(zhì)，分子量，某些連接化學(xué)，等的一組反應(yīng)物。但在一個優(yōu)選實施方案中，密碼子是獨特的，即核苷酸的類似組合不標(biāo)識另一反應(yīng)物。在實際方案中，對于特定反應(yīng)物，僅使用核苷酸的單個組合。在本發(fā)明的一些方面，可針對相同的反應(yīng)物有利地使用幾種不同的密碼子。兩種或多種標(biāo)識相同反應(yīng)物的密碼子可攜帶有關(guān)不同的反應(yīng)條件的其它信息。在本發(fā)明的另一方面，單個密碼子指定兩種或多種反應(yīng)物。在本發(fā)明的一個方面，每種雙功能復(fù)合物通過同時或順序標(biāo)記和反應(yīng)物反應(yīng)而制成，如以下方案所說明 χ-Χ — ax-XA — Iax-XAl大寫字母表示反應(yīng)物或化學(xué)反應(yīng)部位。小寫字母表示標(biāo)簽。支架“X”連接至標(biāo)簽“X”上。反應(yīng)物連接至“X”上，如“A”，并連接針對該片段的標(biāo)簽，如“a”。合適地，標(biāo)簽是獨特的。最終形成的雙功能復(fù)合物的編碼部分包含所有的密碼子。每個密碼子的序列用于破譯已參與形成展示分子，即反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)物的結(jié)構(gòu)。密碼子的順序也可用于確定反應(yīng)物的引入順序。這在形成線性聚合物時可具有特殊的意義，因為聚合物的準(zhǔn)確序列可通過解碼該編碼序列而確定。通常，為了有助于解碼步驟，恒定或結(jié)合區(qū)域與密碼子一起被轉(zhuǎn)移至雙功能復(fù)合物上。該恒定區(qū)域可包含有關(guān)所相關(guān)的反應(yīng)物在展示分子的合成路徑中的位置的信息。本發(fā)明還涉及一種用于鑒定具有預(yù)選性能的展示分子的方法，包括步驟將根據(jù)上述方法制成的庫經(jīng)受一種條件，其中具有預(yù)定性能的展示分子或展示分子的子集與該庫的剩余部分分開，和通過解碼復(fù)合物的編碼部分而鑒定具有預(yù)選功能的展示分子。一般稱作選擇的以上方法包括，將庫經(jīng)受一種條件以選擇具有對該條件起反應(yīng)的性能的展示分子。該條件可包括該庫暴露于靶。具有對該靶的親和性的雙功能復(fù)合物可通過去除非結(jié)合復(fù)合物和隨后在更嚴(yán)格的條件下洗脫已結(jié)合到靶上的復(fù)合物而與該庫的剩余部分分開。或者，雙功能復(fù)合物的編碼部分可在去除非結(jié)合復(fù)合物之后從展示分子上切離并可將編碼部分回收和解碼以鑒定展示分子。可針對特定靶進行單輪或幾輪選擇，隨后擴增所選的變型。所得的這些變型隨后在合適的分析中分開測試。選擇條件可以是嚴(yán)格的和特異的以在一輪選擇中得到結(jié)合分子?？捎欣厥褂脝屋嗊x擇進行該方法，因為可能的結(jié)合物的數(shù)目或多樣性與其中可能損失潛在結(jié)合物的使用更多選擇的方法相比而言較大。在另一實施方案中，選擇程序包括使用日益嚴(yán)格的條件進行幾輪選擇。在每次選擇之間，可有益地擴增所選的復(fù)合物。編碼部分可通過使用產(chǎn)生兩個獨特的切割位點的引物進行PCR擴增。這些切割位點可通過克隆到適用于測序的載體中而用于編碼區(qū)域的多聚化。該方案能夠?qū)υS多編碼區(qū)域同時測序?；蛘撸琍CR產(chǎn)物使用例如TA克隆而被直接克隆到合適的載體中。在另一方案中，展示分子的身份通過將PCR產(chǎn)物應(yīng)用于合適的微陣列而確立。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員完全能夠構(gòu)建寡核苷酸的所需設(shè)計。如果需要特定退火溫度，那么建議合適的核酸單體的組成和其長度是標(biāo)準(zhǔn)步驟。合適設(shè)計的構(gòu)建可通過軟件，如Vector NTI Suite 或因特網(wǎng)地址 http://www. nwfsc. noaa. gov/protocols/oligoTMcalc.html上的公眾數(shù)據(jù)庫而輔助。兩種寡核苷酸能夠雜交的條件受許多因素的影響，包括溫度，鹽濃度，緩沖劑的種類，和酸度。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員完全能夠選擇合適的條件以確保兩種寡核苷酸之間的接觸在雜交條件下進行。兩種單鏈寡核苷酸形成雙螺旋時的溫度被稱作退火溫度或融解溫度。融解曲線通常是不尖銳的，表明退火在一溫度范圍內(nèi)發(fā)生。本發(fā)明可按照兩種基本模式進行。第一模式使用這樣的反應(yīng)物，其中密碼子或反密碼子共價連接至其所要標(biāo)識的功能實體上。第二模式使用不共價連接到密碼子或反密碼子上的反應(yīng)物。標(biāo)簽通過與反應(yīng)物分開的實體被提供在雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位上。如果進行一輪以上，第一和第二模式可按照任何順序結(jié)合。如果要生成不同的雙功能復(fù)合物的 庫，那么兩種模式按照兩種不同的方案進行。使用第一模式制成的庫可在單個容器中進行，這在本文中稱作一罐合成，而根據(jù)第二模式制成的庫需要分開-和-混合合成，即針對每種復(fù)合物反應(yīng)和標(biāo)簽加入必須在不同的隔室中進行。在本發(fā)明的某些實施方案中，在涉及兩種或多種反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)之前或之后，提供一種或多種分別編碼該兩種或多種反應(yīng)物的標(biāo)簽。模式I :本發(fā)明在第一模式中涉及一種用于編碼被轉(zhuǎn)移至雙功能復(fù)合物上的化學(xué)實體的身份的方法，所述方法包括步驟a)提供包含反應(yīng)基團和寡核苷酸標(biāo)識符區(qū)域的新生雙功能復(fù)合物，b)提供包含對標(biāo)識符區(qū)域足夠互補從而允許雜交的寡核苷酸，可轉(zhuǎn)移的功能實體，和標(biāo)識該功能實體的反密碼子的構(gòu)件，c)將新生雙功能復(fù)合物和構(gòu)件在雜交條件下混合形成雜交產(chǎn)物，d)通過涉及新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團的反應(yīng)將構(gòu)件的功能實體轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上，和e)酶促延伸該寡核苷酸標(biāo)識符區(qū)域，以得到連接到已接收該化學(xué)實體的雙功能復(fù)合物上的密碼子。本發(fā)明方法包括為被轉(zhuǎn)移至復(fù)合物上的功能實體引入密碼子。密碼子的引入通過使用合適的酶，即對核酸有活性的酶在構(gòu)件的反密碼子上延伸而進行。編碼區(qū)域的轉(zhuǎn)錄可通過酶，如聚合酶或連接酶而進行。一般來說優(yōu)選使用對底物和最終產(chǎn)物特異性的酶，這樣盡可能精確地轉(zhuǎn)錄反密碼子。高度的特異性一般為核酸活性酶可得到，因為非特異活性可破壞活細(xì)胞存活的能力。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的酶是具有校正活性以用于精確編碼但保存上游核酸堿基的聚合酶。酶延伸可在功能實體轉(zhuǎn)移之后或同時或甚至在轉(zhuǎn)移之前進行。但一般優(yōu)選在轉(zhuǎn)移步驟之后進行延伸步驟，這樣避免酶和功能實體之間的任何可能相互作用。因為酶僅當(dāng)標(biāo)識符區(qū)域和互補性標(biāo)識符區(qū)域已相互雜交形成雙螺旋時進行延伸，所以確保功能實體和反應(yīng)基團在給該復(fù)合物提供密碼子時緊密靠近。與以前所建議的雜交方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于，通過非定向反應(yīng)而提供功能實體的復(fù)合物不會被提供以密碼子。因此，假陽性分子可由于不存在密碼子而容易被檢測。本發(fā)明還涉及一種用于得到由展示分子部分和編碼部分組成的雙功能復(fù)合物的方法，其中用于編碼被轉(zhuǎn)移至雙功能復(fù)合物上的化學(xué)實體的身份的方法進一步包括步驟f)分開雜交產(chǎn)物的組成部分和回收該復(fù)合物。本發(fā)明可通過僅將單個功能實體和相應(yīng)的密碼子轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上而進行。但一般來說，優(yōu)選構(gòu)建由兩個或多個功能實體組成的展示分子。因此，在本發(fā)明優(yōu)選方面，提供了一種用于得到由展示分子部分和編碼部分組成的雙功能復(fù)合物的方法，所述展示分子部分是功能實體和起始復(fù)合物的反應(yīng)基團的反應(yīng)產(chǎn)物，其中步驟c)至f)適當(dāng)?shù)刂貜?fù)。在制備雙功能復(fù)合物的最終周期中，步驟f)可省去，尤其是在其中得到雙鏈標(biāo)識符寡核苷酸的情況下，因為雙鏈核酸通常比相應(yīng)的單鏈寡核苷酸更穩(wěn)定。標(biāo)識符寡核苷酸也可通過延伸過程而變成雙鏈，其中引物被退火至該寡核苷酸的3’端和使用合適的聚合酶延伸。雙鏈性在隨后選擇過程中可能是一個優(yōu)點，因為單鏈核酸可按照一種類似于aptamers的方式進行與生物學(xué)靶的相互作用。在周期的重復(fù)過程中，以前周期中的所得雙功能復(fù)合 物，即已接收功能實體和密碼子的新生雙功能復(fù)合物，在功能實體轉(zhuǎn)移和密碼子引入的下一周期中用作新生雙功能復(fù)合物。根據(jù)本方法使用的寡核苷酸具有合理的長度。因此，一般避免在已有技術(shù)(在WO00/23458中，建議使用至少220和優(yōu)選420個核苷酸的寡核苷酸)中建議的長預(yù)制模板。本發(fā)明還涉及一種用于產(chǎn)生雙功能復(fù)合物庫的方法，包括步驟a)提供一種或多種不同的包含反應(yīng)基團和寡核苷酸標(biāo)識符區(qū)域的新生雙功能復(fù)合物，b)提供每個構(gòu)件包含與標(biāo)識符區(qū)域足夠互補從而允許雜交的寡核苷酸，可轉(zhuǎn)移的功能實體，和標(biāo)識該功能實體的反密碼子的多個不同的構(gòu)件，c)將新生雙功能復(fù)合物和多個構(gòu)件在雜交條件下混合以形成雜交產(chǎn)物，d)通過涉及新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團的反應(yīng)將構(gòu)件的功能實體轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上，e)酶促延伸該寡核苷酸標(biāo)識符區(qū)域，以得到連接到已接收該化學(xué)實體的雙功能復(fù)合物上的密碼子，f)分開雜交產(chǎn)物的組分和回收復(fù)合物，g)適當(dāng)?shù)刂貜?fù)步驟c)至f) 一次或多次。與已有技術(shù)中所建議的雜交技術(shù)有關(guān)的缺點在考慮形成庫時變得明顯。即使兩種雙鏈寡核苷酸具有相同數(shù)目的核苷酸，也決不能確保它們具有相同的融解溫度。這至少部分由于，不同的堿基對涉及不同數(shù)目的氫鍵(C-G對涉及三個氫鍵和A-T堿基對涉及兩個氫鍵)。因此，確立用于將各種構(gòu)件退火至模板的溫度要兼顧避免錯配和確保足夠的退火。本發(fā)明意欲通過在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中提供對所有構(gòu)件具有類似親和性的標(biāo)識符區(qū)域而避免該缺點。如果使用一個以上的標(biāo)識符序列，如在存在一種以上的反應(yīng)基團或支架時，構(gòu)件有時可被錯退火至其上。但轉(zhuǎn)移的功能實體實際上通過延伸過程被正確地編碼在復(fù)合物上。該方案類似于自然中使用的安排在DNA水平上允許堿基錯誤摻入(與構(gòu)件的錯配退火相比)，得到多樣性，但堅持對表型的正確編碼(與復(fù)合物上的正確密碼子的延伸相比)。
標(biāo)識符和構(gòu)件之間的退火可以是隨機過程或通過標(biāo)識符區(qū)域和互補性標(biāo)識符區(qū)域中的序列而引導(dǎo)。隨機過程可通過在所有的標(biāo)識符區(qū)域和互補性標(biāo)識符區(qū)域中使用相同的序列而實現(xiàn)。因此標(biāo)識符和構(gòu)件的混合物隨機或半隨機地退火并得到功能實體的獨特組合?；蛘?，隨機或半隨機過程可通過在與標(biāo)識符核酸堿基相對的構(gòu)件位置上使用通用堿基而實現(xiàn)，其中所述標(biāo)識符核酸堿基編碼特定支架或反應(yīng)基團的身份。標(biāo)識符寡核苷酸和構(gòu)件寡核苷酸的序列可被優(yōu)化以確保退火過程涉及的庫中的序列以相等的退火程度組裝，而與連接到構(gòu)件上的功能實體無關(guān)。因此，在選擇步驟中沒有或較少有由于特定構(gòu)件的不同的退火性能產(chǎn)生的偏差。另外，在每個退火步驟中和針對庫中的每種雜交產(chǎn)物的退火過程類似性可確保為反應(yīng)基團/支架同等地提供功能實體。這樣提供用于轉(zhuǎn)移步驟的最佳條件。新生雙功能復(fù)合物包含寡核苷酸標(biāo)識符區(qū)域和反應(yīng)基團。反應(yīng)基團可通過可斷裂的接頭連接至寡核苷酸上，允許最終反應(yīng)產(chǎn)物與寡核苷酸分離?？纱嬖趩蝹€反應(yīng)基團或多個反應(yīng)基團可作為支架的一部分而存在。支架可通過可斷裂的接頭連接到寡核苷酸，這樣能夠隨后分離反應(yīng)過的支架。反應(yīng)基團可選自任何能夠接受功能實體的基團。合適的反應(yīng)基團的例子包括胺，羧酸，硫(thio)，和羥基基團。另外，新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團可以 是在開始本發(fā)明的方法之前必需被活化的前形。新生雙功能復(fù)合物也被稱作生長中的復(fù)合物和表示要根據(jù)本發(fā)明方法進一步處理的起始或中間復(fù)合物。標(biāo)識符分子的標(biāo)識符區(qū)域中的核苷酸數(shù)根據(jù)標(biāo)識符和構(gòu)件之間的退火的強度和特異性而確定。較強的和更特異的退火過程一般使用較長的核苷酸序列而得到。通常約10-20個核苷酸足以實現(xiàn)特異和有效的退火。但在本發(fā)明的一些方面，該范圍可以是2-1000，最優(yōu)選15-30個核苷酸。標(biāo)識符區(qū)域可在某些實施方案中包含有關(guān)新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團或支架的身份的信息。這些支架密碼子的位置一般遠(yuǎn)離支架，這樣允許在包含所要轉(zhuǎn)移的功能實體和支架的部分形成穩(wěn)定的雙螺旋。支架密碼子可具有任何長度，但一般選擇為與規(guī)定功能實體的密碼子相同的長度。標(biāo)識符區(qū)域的后部一般提供有恒定或結(jié)合序列。結(jié)合序列在被退火至構(gòu)件的合適部分上時提供酶進行延伸的底物。構(gòu)件包含與至少一部分標(biāo)識符區(qū)域足夠互補從而允許雜交的寡核苷酸。構(gòu)件的寡核苷酸可不完全與標(biāo)識符互補，即，可允許一個或多個錯配，但必須確保構(gòu)件能夠退火至標(biāo)識符區(qū)域上。為簡便起見，構(gòu)件寡核苷酸的能夠退火至標(biāo)識符上的部分被稱作互補性標(biāo)識符區(qū)域。在本說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語雜交要理解為將兩個單鏈寡核苷酸相互附著使得形成雜交產(chǎn)物的過程。構(gòu)件還包含由寡核苷酸組成的反密碼子區(qū)域。反密碼子標(biāo)識構(gòu)件的功能實體的身份。在某些實施方案中，相同的反密碼子用于編碼幾種不同的功能實體。在隨后鑒定步驟中，展示分子的結(jié)構(gòu)可根據(jù)對不同的連接化學(xué)，位阻，正交保護基團的去保護，等的認(rèn)識而推斷。在另一實施方案中，同一反密碼子用于具有共性，如親油性質(zhì)，某些連接化學(xué)，等的一組功能實體。但在一個優(yōu)選實施方案中，反密碼子是獨特的，即核苷酸的類似組合不出現(xiàn)在攜帶另一功能實體的另一構(gòu)件上。在實際方案中，對于特定功能實體，僅使用核苷酸的單個組合。在本發(fā)明的一些方面，可有利地為相同的功能實體使用幾種反密碼子，其方式非常類似于自然界為單個氨基酸使用最高六個不同的反密碼子。兩種或多種標(biāo)識相同的功能實體的反密碼子可攜帶有關(guān)不同的反應(yīng)條件的更多信息。各個反密碼子與庫中的另一反密碼子的區(qū)別可僅在于單個核苷酸。但為了有助于隨后解碼過程，一般最好在特定的反密碼子和出現(xiàn)在各種構(gòu)件上的任何其它反密碼子之間存在兩個或多個錯配。例如，如果選擇5個核苷酸的密碼子/反密碼子長度，那么存在100個以上的核苷酸組合，其中出現(xiàn)兩個或多個錯配。對于密碼子中的一定數(shù)目的核苷酸，一般希望優(yōu)化特定密碼子/反密碼子相對于出現(xiàn)在該庫中的任何其它密碼子/反密碼子的錯配數(shù)。功能實體與互補性標(biāo)識符區(qū)域的偶聯(lián)可使用合適的偶聯(lián)反應(yīng)進行。本領(lǐng)域已知的這些反應(yīng)的任何偶聯(lián)反應(yīng)或組合可適當(dāng)?shù)厥褂?，這是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所容易認(rèn)識。連接至互補性標(biāo)識符區(qū)域上的功能實體為優(yōu)選包含至少一個反應(yīng)基團從而允許鍵接至標(biāo)識符的反應(yīng)基團上的分子。反密碼子的序列標(biāo)識連接在相同的構(gòu)件中的功能實體。該反密碼子序列直接包括在構(gòu)件序列中或例如使用聚合酶或連接酶連接到預(yù)先存在的構(gòu)件上。在例如詳細(xì)公開于實·施例7的某些實施方案中，在實施例中被稱作載體oligo的互補性標(biāo)識符區(qū)域最初用各種功能實體加載。每個加載的載體oligo隨后使用夾板oligo (splint oligo)連接至反密碼子oligo上以組裝這兩個寡核苷酸。連接反應(yīng)用于將所要轉(zhuǎn)移的功能實體與指定功能實體的結(jié)構(gòu)的反密碼子連接。反密碼子oligo可按照各種方式設(shè)計。通常，允許夾板退火的區(qū)域被包括在該設(shè)計中。但一些連接酶如T4 RNA連接酶無需雙鏈DNA的區(qū)段。因此，夾板和退火至夾板上的反密碼子oligo的部分可在一些實施方案中可被省去。如果標(biāo)識符區(qū)域包含編碼支架的身份的密碼子，那么反密碼子oligo包含一串通用堿基，如次黃嘌呤核苷。如果與標(biāo)識符區(qū)域上的結(jié)合區(qū)域互補的區(qū)域被包括在下游，那么通用堿可被省去。后一實施方案通常要求一部分標(biāo)識符環(huán)出?；パa性結(jié)合區(qū)域通常被選擇使得聚合酶能夠識別與新生雙功能分子的結(jié)合區(qū)域所形成的雙螺旋作為底物。反密碼子合適地位于互補性結(jié)合區(qū)域的5’側(cè)，這樣它可通過延伸反應(yīng)被轉(zhuǎn)移至新生復(fù)合物上。合適地，設(shè)計互補性結(jié)合區(qū)域使得可鑒別出現(xiàn)在最后雙功能復(fù)合物上的密碼子序列中的特定密碼子的位置。反密碼子序列通過延伸過程被轉(zhuǎn)錄至標(biāo)識符以形成在標(biāo)識符分子上的密碼子。這可通過本領(lǐng)域任何方法而進行，包括，但不限于，聚合酶延伸反應(yīng)。聚合酶延伸反應(yīng)通常需要在合適的緩沖劑中存在足夠的聚合酶活性以及四種天然核苷酸三磷酸(ATP，CTP,GTPJPTTP)中的每一種。因此，當(dāng)構(gòu)件和標(biāo)識符分子已退火并在功能實體和接受性反應(yīng)基團之間進行反應(yīng)時，特定反密碼子的序列僅被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識符上作為密碼子。四種天然核苷酸可編碼4N變型，其中N是密碼子的長度。例如，果獨特密碼子是5個核苷酸的長度，那么用于不同的功能實體的可能編碼的數(shù)目是1024。密碼子也可在每個位置上使用四種天然核苷酸的子集而設(shè)計。這可有利地與通用核酸堿基結(jié)合使用。每個構(gòu)件中的反密碼子為相同的構(gòu)件中的功能實體編碼。該序列在本發(fā)明的一個方面可通過利用功能實體引物和反密碼子引物的互補性標(biāo)識符區(qū)域的PCR而引入。構(gòu)件的功能實體所起的作用是用作最終被引入展示分子中的結(jié)構(gòu)實體的前體。因此，在本申請和權(quán)利要求書中，如果敘述到功能實體被轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上，這要理解為未必該原始功能實體的所有原子會出現(xiàn)在最終形成的展示分子中。另外，由于該連接所涉及的反應(yīng)，功能實體的結(jié)構(gòu)可在它出現(xiàn)在新生展示分子上時被改變。尤其，導(dǎo)致釋放功能實體的斷裂作用可產(chǎn)生在隨后步驟中可參與形成新生展示分子和功能實體之間連接的反應(yīng)基團。構(gòu)件的功能實體優(yōu)選包含至少一個能夠參與反應(yīng)的反應(yīng)基團,該反應(yīng)導(dǎo)致構(gòu)件的功能實體和攜帶反應(yīng)基團的標(biāo)識符之間的連接。出現(xiàn)在功能實體上的反應(yīng)基團的數(shù)目合適地是I至10。以僅一個反應(yīng)基團為特征的功能實體用于例如聚合物或支架的末端位置，而具有兩個反應(yīng)基團的功能實體適用于形成能夠進一步反應(yīng)的聚合物或支架的體部分。意欲用于形成連接的兩個或多個反應(yīng)基團通常存在于支架上。支架是核心結(jié)構(gòu)，構(gòu)成用于產(chǎn)生多個變型的基礎(chǔ)。支架的變型形式通常通過支架的反應(yīng)基團與其它功能實體的反應(yīng)基團，任選地在填入基團或催化劑的媒介下反應(yīng)而形成。所要連接至支架上的功能實體可包含一個，兩個或幾個能夠形成連接的反應(yīng)基團。支架的例子包括留族，乙內(nèi)酰脲類，苯并二氮雜草，等。構(gòu)件的反應(yīng)基團可以能夠形成與標(biāo)識符的反應(yīng)基團的直接連接或構(gòu)件的反應(yīng)基團可以能夠通過橋接填入基團而形成與標(biāo)識符的反應(yīng)基團的連接。可以理解，不是反應(yīng)基團的所有原子必需保持在所形成的連接中。相反，反應(yīng)基團要被認(rèn)為是用于該連接結(jié)構(gòu)的 前體。在形成連接之后或同時，進行斷裂以使功能實體轉(zhuǎn)移至標(biāo)識符上。斷裂可按照任何合適的方式進行。在本發(fā)明的一個方面，斷裂包括試劑或和酶的使用。斷裂導(dǎo)致功能實體轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上或?qū)е聫?fù)合物轉(zhuǎn)移至構(gòu)件的功能實體上。在某些情況下，可有利地通過接頭斷裂而引入新化學(xué)基團。新化學(xué)基團可用于在隨后周期中，直接或在已被活化之后進一步反應(yīng)。在其它情況下，最好在斷裂之后沒有留下接頭的痕跡(trace)。另一方面，連接和斷裂作為同時反應(yīng)而進行，即構(gòu)件的功能實體或新生展示分子是該反應(yīng)的離去基團。在本發(fā)明的一些方面，優(yōu)選設(shè)計該體系使得連接和斷裂同時發(fā)生，因為這樣可減少步驟數(shù)和復(fù)雜性。同時連接和斷裂也可設(shè)計使得沒有留下接頭的痕跡或使得用于進一步反應(yīng)的新化學(xué)基團被引入，如上所述。在本發(fā)明其它方面，優(yōu)選進行分開的交聯(lián)和斷裂步驟，因為逐步方案能夠控制每個子步驟并能夠減少非特異性轉(zhuǎn)移的可能性。優(yōu)選，至少一個接頭在斷裂步驟之后保持完整。該至少一個接頭將新生展示分子連接至編碼區(qū)域上。如果該方法基本上包括功能實體至支架或正形成的聚合物上的轉(zhuǎn)移，那么最終支架上的分子或聚合物可與可選擇性地斷裂的接頭連接?？蛇x擇性地斷裂的接頭設(shè)計使得它在導(dǎo)致功能實體轉(zhuǎn)移至新生模板引導(dǎo)的分子上的條件下不斷裂?？蓴嗔训慕宇^可選自大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)。接頭的例子包括，但不限于此，具有酶斷裂位點的接頭，包含化學(xué)可降解組分的接頭，和可通過電磁輻射而斷裂的接頭。特別有意義的可斷裂的接頭目前是可通過光斷裂的接頭。合適的實施例包括位于展示分子和標(biāo)識符區(qū)域之間的O-硝基芐基基團。用于根據(jù)本發(fā)明的方法使用的構(gòu)件可按照該構(gòu)件所涉及的特定實體而設(shè)計。例如，反密碼子可用聚乙二醇(PEG)接頭連接到互補性標(biāo)識符區(qū)域上且功能實體可直接連接到所述互補性標(biāo)識符區(qū)域上。在另一和優(yōu)選的實施例中，反密碼子、互補性標(biāo)識符區(qū)域和功能實體是鄰接的線性寡核苷酸。在本發(fā)明的某些實施方案中，構(gòu)件設(shè)計使得一部分標(biāo)識符環(huán)出。常常發(fā)生標(biāo)識符的環(huán)出，因為構(gòu)件oligo不退火至整個長度的標(biāo)識符上。通常，構(gòu)件設(shè)計使得它能夠退火至雙功能復(fù)合物的至少標(biāo)識符區(qū)域上和標(biāo)識符后面部分的結(jié)合區(qū)域上。互補性標(biāo)識符區(qū)域和反密碼子可通過單個鍵直接連接，通過合適的長度的PEG接頭，或核酸堿基序列而連接，其中所述核酸堿基序列可或可不包含與標(biāo)識符上的各種密碼子和結(jié)合區(qū)域互補的核酸堿基。在本發(fā)明的某些實施方案中，構(gòu)件被設(shè)計成僅退火至結(jié)合區(qū)域上，通常在與已連接展示分子的末端相對的標(biāo)識符末端。在本發(fā)明的一個方面，構(gòu)件和/或新生標(biāo)識符由兩個或多個能夠相互雜交以形成雜交復(fù)合物的單獨的核苷酸組成。寡核苷酸之間的間隙可使用合適的酶活性，如聚合酶和連接酶填充以合適的核苷酸，得到連貫的標(biāo)識符和/或構(gòu)件。功能實體與互補性標(biāo)識符區(qū)域的連接通常通過接頭而進行。優(yōu)選接頭將功能實體與互補性標(biāo)識符區(qū)域在末端核苷酸或寡核苷酸下游一個或兩個核苷酸的核苷酸處連接。功能實體的連接可處于任何可用于連接的實體上，即功能實體可連接到寡核苷酸的核苷酸的核酸堿基上，或主鏈上。一般來說，優(yōu)選在核苷酸間鍵的磷上或在核酸堿基上連接功能實體。在本發(fā)明的某些方面，功能實體的反應(yīng)基團連接到接頭寡核苷酸上。反應(yīng)基團優(yōu)選能夠通過相應(yīng)的反應(yīng)基團之間的直接反應(yīng)或通過使用合適的填入基團而產(chǎn)生與新生展 示分子的連接。將功能實體與接頭偶聯(lián)的反應(yīng)基團優(yōu)選在建立連接的同時被斷裂。功能實體在一些情況下可包含能夠在隨后周期中涉及形成連接的第二反應(yīng)基團。第二反應(yīng)基團可在它能夠參與形成連接之前需要活化。如果兩個或多個功能實體要被轉(zhuǎn)移至復(fù)合物上，密碼子可被恒定區(qū)域或結(jié)合區(qū)域分開。結(jié)合區(qū)域的一個功能可以是確立一個聚合酶可在其上結(jié)合的平臺。根據(jù)所形成的被編碼分子，標(biāo)識符可包含其它的密碼子，如3，4，5，或更多的密碼子。其它密碼子每一個可通過合適的結(jié)合區(qū)域而分開。優(yōu)選，標(biāo)識符的所有的或至少大多數(shù)的密碼子通過結(jié)合序列與相鄰密碼子分開。結(jié)合區(qū)域可具有任何合適數(shù)目的核苷酸，如I至20個。除了用作酶的底物，結(jié)合區(qū)域(如果有的話)可用于各種目的。在本發(fā)明的一種設(shè)置中，結(jié)合區(qū)域標(biāo)識密碼子的位置。通常，在密碼子的上游或下游的結(jié)合區(qū)域包含允許確定密碼子的位置的信息。在另一設(shè)置中，結(jié)合區(qū)域具有交替序列(alternating sequences),允許在形成庫時由兩個池(pool)加入構(gòu)件。另外，結(jié)合區(qū)域可調(diào)節(jié)退火溫度至所需水平。具有高親和性的結(jié)合區(qū)域可通過引入一個或多個與相關(guān)核酸堿基形成三個氫鍵的核酸堿基而提供。具有該性能的核酸堿基的例子是鳥嘌呤和胞嘧啶。作為替代方案，或在此之外，結(jié)合區(qū)域可經(jīng)受主鏈修飾。幾種主鏈修飾提供較高親和性，如核糖部分的2’-0_甲基取代，肽核酸(PNA)，和也被稱作LNA(鎖定的核酸)的核糖部分的2’-4’0_亞甲基環(huán)化。標(biāo)識符可包含在密碼子周圍的側(cè)翼區(qū)域。側(cè)翼區(qū)域可包括信號基團，如熒光團或放射性活性基團從而能夠檢測復(fù)合物的存在或不存在或側(cè)翼區(qū)域可包含可被檢測的標(biāo)記，如生物素。如果標(biāo)識符包含生物素部分，標(biāo)識符可容易被回收。側(cè)翼區(qū)域也可用作擴增反應(yīng)，如PCR的引發(fā)部位。通常，在形成雙功能復(fù)合物的最后周期包括引發(fā)部位的引入。雙功能復(fù)合物的標(biāo)識符區(qū)域通常用作另一引發(fā)部位，這樣允許對雙功能復(fù)合物的編碼區(qū)域進行PCR擴增?？梢岳斫猓?dāng)術(shù)語標(biāo)識符用于本說明書和權(quán)利要求書時，標(biāo)識符可以是有義或反義形式，即標(biāo)識符可包含實際編碼該分子的密碼子的序列或可以是與其互補的序列。另外，標(biāo)識符可根據(jù)需要是單鏈或雙鏈的。
一般在活性反密碼子之前包含一個或多個反密碼子的那部分互補性標(biāo)識符區(qū)域或構(gòu)件寡核苷酸的設(shè)計可以是隨機或半隨機的且可允許與標(biāo)識符區(qū)域的一個或多個錯配。但尤其是當(dāng)考慮庫時，可有利地在與前面的密碼子互補的區(qū)域中引入一個或多個非特異堿基配對的核酸堿基。非特異堿基配對的核酸堿基是當(dāng)連接到主鏈上時能夠與五種自然存在的核酸堿基(C，T，G，A，和U)中的至少兩種配對的堿基。優(yōu)選，此兩種或多種天然核酸堿基和該非特異性堿基配對的核酸堿基之間的堿基配對基本上等能量地發(fā)生，即所形成的鍵具有同數(shù)量級的強度。術(shù)語“非特異性堿基配對的核酸堿基”在本文中可與術(shù)語“通用堿基”互換使用。在天然tRNA中，存在核酸堿基次黃嘌呤核苷。次黃嘌呤核苷具有與三種核酸堿基，即胞嘧啶，胸腺嘧啶，和腺嘌呤非特異性雜交的能力。以下描述次黃嘌呤核苷和具有與天然核酸堿基非特異性堿基配對的相同能力的其它合成化合物的例子通用堿基的例子
權(quán)利要求
1.新生雙功能復(fù)合物，其包含 a)通過化學(xué)反應(yīng)部位與反應(yīng)物反應(yīng)得到的反應(yīng)產(chǎn)物， 其中，化學(xué)反應(yīng)部位通過連接部分與標(biāo)識該化學(xué)反應(yīng)部位的第一寡核苷酸標(biāo)簽連接， 其中，第一寡核苷酸標(biāo)簽包括用于通過酶催化來加入第二寡核苷酸標(biāo)簽的引發(fā)部位， b)標(biāo)識反應(yīng)物的第二寡核苷酸標(biāo)簽，和 c)互補的寡核苷酸，它雜交到所述的第一核苷酸標(biāo)簽和第二寡核苷酸標(biāo)簽的每一個上。
2.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，連接部分是核酸序列。
3.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，連接部分中的核苷酸數(shù)目為8個或更多。
4.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，連接部分通過間隔基連接到化學(xué)反應(yīng)部位上，間隔基包含可選擇性地斷裂的接頭以使反應(yīng)產(chǎn)物能脫離寡核苷酸標(biāo)簽。
5.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，反應(yīng)產(chǎn)物通過共價鍵與第一核苷酸標(biāo)簽連接。
6.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是環(huán)加成產(chǎn)物。
7.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是烷基化產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是芳基化產(chǎn)物。
9.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是?；a(chǎn)物。
10.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是酰胺鍵。
11.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是羧酸酯鍵。
12.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是磺酰胺鍵。
13.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是二硫鍵。
14.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是S-烷基鍵。
15.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是NR-烷基鍵。
16.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是O-烷基鍵。
17.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是芳基-乙烯基鍵。
18.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是炔-乙烯基鍵。
19.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是肟鍵。
20.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是亞胺鍵。
21.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是雙環(huán)產(chǎn)物。
22.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是三唑。
23.權(quán)利要求5的新生雙功能復(fù)合物，其中，共價鍵是己烯。
24.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，化學(xué)反應(yīng)部位包含能與I種或多種反應(yīng)物反應(yīng)的單個反應(yīng)基團。
25.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，化學(xué)反應(yīng)部位包含能與I種或多種反應(yīng)物反應(yīng)的多個反應(yīng)基團。
26.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，化學(xué)反應(yīng)部位包含連接有一個或多個反應(yīng)基團的支架。
27.權(quán)利要求24-26任一項的新生雙功能復(fù)合物，其中，一個或多個反應(yīng)基團選自胺基團、羧酸基團、硫基團、醛基團和羥基基團。
28.權(quán)利要求26的新生雙功能復(fù)合物，其中，支架選自苯并二氮雜輩類、留族、乙內(nèi)酰脲類、哌嗪類、二酮哌嗪類、嗎啉類、托烷類、香豆素類、喹啉類、吲哚類、呋喃類、吡咯類、1 唑類、氨基酸前體和噻唑類。
29.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，可使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)擴增寡核苷酸標(biāo)簽。
30.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽由允許酶識別該寡核苷酸作為底物的主鏈結(jié)構(gòu)組成。
31.權(quán)利要求30的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽的主鏈結(jié)構(gòu)是DNA或RNA。
32.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，引發(fā)部位包含3’-OH。
33.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，引發(fā)部位包含5’-磷酸基團。
34.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽長2至100個核苷酸。
35.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽長3至50個核苷酸。
36.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽長4至20個核苷酸。
37.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽長5至15個核苷酸。
38.權(quán)利要求I的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽的核苷酸由核酸堿基部分和主鏈單元組成，其中主鏈單元由糖部分和核苷間接頭組成。
39.權(quán)利要求38的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽的核酸堿基選自天然存在的核酸堿基以及非天然存在的核酸堿基。
40.權(quán)利要求38的新生雙功能復(fù)合物，其中，核酸堿基選自嘌呤雜環(huán)、嘧啶雜環(huán)、以及其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。
41.權(quán)利要求38的新生雙功能復(fù)合物，其中，核酸堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮黃嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶、N6, N6-橋亞乙基-2，6- 二氨基-嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤和次黃嘌呤核苷。
42.權(quán)利要求38的新生雙功能復(fù)合物，其中，核酸堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
43.權(quán)利要求38的新生雙功能復(fù)合物，其中，主鏈單元選自
44.權(quán)利要求38的新生雙功能復(fù)合物,其中，主鏈單元的糖部分是戍糖。
45.權(quán)利要求44的新生雙功能復(fù)合物，其中，戊糖選自核糖、2’-脫氧核糖、2’ -O-甲基-核糖、2’ -氟-核糖和2’ -4’ -O-亞甲基-核糖(LNA)。
46.權(quán)利要求38-42任一項的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽的核苷酸的核酸堿基連接在戊糖的I’位上。
47.權(quán)利要求38的新生雙功能復(fù)合物，其中，連接寡核苷酸標(biāo)簽中相鄰的兩個核苷酸的核苷間鍵選自磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、甲基膦酸酯鍵、氨基磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵和~■硫代憐Ife酷鍵。
48.權(quán)利要求38的新生雙功能復(fù)合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽包括通過磷酸二酯鍵連接的DNA及RNA家族天然存在的核苷。
49.權(quán)利要求48的新生雙功能復(fù)合物，其中，脫氧核糖核苷選自脫氧腺苷、脫氧鳥嘌呤核苷、脫氧胸腺嘧啶核苷和脫氧胞苷；而核糖核苷選自腺苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞苷和次黃嘌呤核苷。
50.合成權(quán)利要求1-49任一項的新生雙功能復(fù)合物的方法，所述的方法包括步驟 a)提供化學(xué)反應(yīng)部位，其通過連接部分連接到標(biāo)識該化學(xué)反應(yīng)部位的第一寡核苷酸標(biāo)簽，所述的第一寡核苷酸標(biāo)簽包括用于酶加入第二寡核苷酸標(biāo)簽的引發(fā)部位； b)將反應(yīng)物與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)，由此獲得反應(yīng)產(chǎn)物； c)提供標(biāo)識所述反應(yīng)物的第二寡核苷酸標(biāo)簽； d)提供在序列上與第一寡核苷酸標(biāo)簽和第二寡核苷酸標(biāo)簽互補的寡核苷酸，和 e)使該互補核苷酸與第一寡核苷酸標(biāo)簽和第二寡核苷酸標(biāo)簽雜交。
51.不同的權(quán)利要求1-49任一項的新生雙功能復(fù)合物的庫。
52.用于鑒定包含具有預(yù)選性質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物的新生雙功能復(fù)合物的方法，所述方法包括步驟 a)分開權(quán)利要求51的庫,和 b)通過解碼雙功能復(fù)合物的寡核苷酸標(biāo)簽鑒定具有預(yù)選性質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物。
53.權(quán)利要求1-49任一項的新生雙功能復(fù)合物在制備用于治療需要該治療的個體的臨床疾病的有潛力的藥物候選物中的用途。
54.組合物，包含 a)能與包含連接有I個或者多個反應(yīng)基團的支架的化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)的反應(yīng)物，所述的支架通過連接部分共價連接于用于標(biāo)識該支架的第一寡核苷酸標(biāo)簽， b)包含連接有I個或者多個反應(yīng)基團的支架的化學(xué)反應(yīng)部位，所述的支架通過連接部分共價連接于用于標(biāo)識該支架的第一寡核苷酸標(biāo)簽， c)標(biāo)識所述反應(yīng)物的第二寡核苷酸標(biāo)簽，和 d)能連接第一寡核苷酸標(biāo)簽和第二寡核苷酸標(biāo)簽的酶。
55.權(quán)利要求54的組合物，還包含能與所述的第一寡核苷酸標(biāo)簽和第二寡核苷酸標(biāo)簽的每一個雜交的互補寡核苷酸。
56.權(quán)利要求54的組合物，其中，連接部分是核酸序列。
57.權(quán)利要求54的組合物，其中，連接部分的核苷酸數(shù)目為8個或更多。
58.權(quán)利要求54的組合物，其中，連接部分通過間隔基連接到化學(xué)反應(yīng)部位上，間隔基包含可選擇性地斷裂的接頭以使反應(yīng)產(chǎn)物能脫離寡核苷酸標(biāo)簽。
59.權(quán)利要求54的組合物，其中，所述I個或多個支架反應(yīng)基團選自胺基團、羧酸基團、硫基團、醛基團和羥基基團。
60.權(quán)利要求54的組合物，其中，支架選自二氮雜輩類、留族、乙內(nèi)酰脲類、哌嗪類、二酮哌嗪類、嗎啉類、托烷類、香豆素類、喹啉類、吲哚類、呋喃類、吡咯類J惡唑類、氨基酸前體和噻唑類。
61.權(quán)利要求54的組合物，其中，可使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)擴增寡核苷酸標(biāo)簽。
62.權(quán)利要求54的組合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽由允許酶識別該寡核苷酸作為底物的主鏈結(jié)構(gòu)組成。
63.權(quán)利要求62的組合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽的主鏈結(jié)構(gòu)是DNA或RNA。
64.權(quán)利要求54的組合物，其中，引發(fā)部位包含3’-OH。
65.權(quán)利要求54的組合物，其中，引發(fā)部位包含5’-磷酸基團。
66.權(quán)利要求54的組合物,其中，寡核苷酸標(biāo)簽長2至100個核苷酸。
67.權(quán)利要求54的組合物,其中，寡核苷酸標(biāo)簽長3至50個核苷酸。
68.權(quán)利要求54的組合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽長4至20個核苷酸。
69.權(quán)利要求54的組合物,其中，寡核苷酸標(biāo)簽長5至15個核苷酸。
70.權(quán)利要求54的組合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽的核苷酸由核酸堿基部分和主鏈單元組成，其中主鏈單元由糖部分和核苷間接頭組成。
71.權(quán)利要求70的組合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽的核酸堿基選自天然存在的核酸堿基以及非天然存在的核酸堿基。
72.權(quán)利要求71的組合物，其中，所述核酸堿基選自嘌呤雜環(huán)、嘧啶雜環(huán)、及其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。
73.權(quán)利要求71的復(fù)合物，其中，核酸堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮黃嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶、N6，N6-橋亞乙基-2，6- 二氨基-嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5- (C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤和次黃嘌呤核苷。
74.權(quán)利要求71的組合物，其中，核酸堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
75.權(quán)利要求71的組合物，其中，主鏈單元選自
76.權(quán)利要求70的組合物，其中，主鏈單元的糖部分是戊糖。
77.權(quán)利要求76的組合物，其中，戊糖選自核糖、2’-脫氧核糖、2’ -O-甲基-核糖、2’ -氟-核糖和2’ -4’ -O-亞甲基-核糖(LNA)。
78.權(quán)利要求76或77的組合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽的核苷酸的核酸堿基連接在戊糖的I’位上。
79.權(quán)利要求70的組合物，其中，連接寡核苷酸標(biāo)簽中相鄰兩個核苷酸的核苷間接頭選自磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、甲基膦酸酯鍵、氨基磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵和二硫代磷酸酯鍵。
80.權(quán)利要求54的組合物，其中，寡核苷酸標(biāo)簽包括通過磷酸二酯鍵連接的DNA及RNA家族天然存在的核苷。
81.權(quán)利要求80的組合物，其中，脫氧核糖核苷選自脫氧腺苷、脫氧鳥嘌呤核苷、脫氧胸腺嘧啶核苷和脫氧胞苷；而核糖核苷選自腺苷、鳥嘌呤核甙、尿嘧啶核苷、胞苷和次黃嘌呤核苷。
82.權(quán)利要求54-81任一項的組合物在制備用于治療需要該治療的個體的臨床疾病的有潛力的藥物候選物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種合成包含反應(yīng)產(chǎn)物和編碼區(qū)域的雙功能復(fù)合物的方法。該復(fù)合物是新生雙功能復(fù)合物和構(gòu)件之間的雜交產(chǎn)物。新生雙功能復(fù)合物包含連接到寡核苷酸標(biāo)識符區(qū)的連接實體，構(gòu)件包含和與該標(biāo)識符區(qū)足夠互補以允許雜交的寡核苷酸連接的功能實體。然后，功能實體可通過化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)移到連接實體上?；パa標(biāo)識符區(qū)還包含獨特密碼子，它明確地標(biāo)識該功能實體。該密碼子在使用酶(例如聚合酶)延伸該標(biāo)識符區(qū)域時用作模板以形成獨特密碼子。獨特密碼子可用于解碼幾輪功能實體轉(zhuǎn)移后反應(yīng)產(chǎn)物的合成歷史。
文檔編號C12N15/10GK102838654SQ20121022202
公開日2012年12月26日 申請日期2003年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月30日
發(fā)明者P-O·弗里斯克加德, T·弗朗奇, A·H·古利艾夫, M·D·倫多夫, J·費爾丁, E·K·奧爾森, A·霍爾特曼, S·N·雅克布森, C·薩姆斯, S·S·格萊德, K·B·延森, H·佩德森 申請人:紐韋盧森公司