專利名稱：斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體c3基因、載體、重組菌株和蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種rC3B蛋白及編碼該蛋白的基因、含有該基因的載體及其應(yīng)用；還涉及一種補(bǔ)體C3蛋白及編碼該蛋白的基因、含有該基因的載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
補(bǔ)體第三組分(C3)是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心，它是1912年Ritg用蛇毒處理血清時(shí)發(fā)現(xiàn)的。在補(bǔ)體各成分中，補(bǔ)體C3的血清含量最高。補(bǔ)體C3蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)，是一種β 2糖蛋白，由α、β兩條肽鏈組成，兩肽鏈間以二硫鍵相連，分子量為195KDa，其中α鏈為115KDa，由998個(gè)氨基酸殘基組成，N末端和C末端均為絲氨酸；β鏈為75KDa，由669個(gè)氨基酸組成，N末端為絲氨酸，C末端為丙氨酸。兩鏈間氫鍵、疏水鍵及二硫鍵相互連接，其 中二硫鍵散在于α鏈的92-93位氨基酸及β鏈的11-656位氨基酸之間。C3的激活與滅活酶的作用部位主要在α鏈，β鏈則與穩(wěn)定必要的分子構(gòu)象有關(guān)。在α鏈的半胱氨酸和谷氨酸殘基之間有一個(gè)分子內(nèi)硫酯鍵，此鍵不穩(wěn)定，尤其是對(duì)蛋白質(zhì)和碳水化合物中的親核基團(tuán)敏感，如羥基(一 0Η)和氨基(一順2)。C3當(dāng)被C3轉(zhuǎn)化酶裂解為C3a和C3b時(shí)，C3b分子內(nèi)硫酯鍵變得更加不穩(wěn)定，可被附近的羥基或氨基激活，斷裂為?；蛶€基。?；哂休^強(qiáng)的親電性，可與相應(yīng)膜表面的親核基團(tuán)形成酯鍵或酰氨鍵，由此C3b結(jié)合于相應(yīng)的膜表面，此結(jié)合部位為C3b的不穩(wěn)定結(jié)合部位，借此部位，C3b除可結(jié)合于細(xì)胞膜表面外，還可結(jié)合于相應(yīng)的免疫復(fù)合物、脂多糖、酵母多糖及多糖等。在功能上，C3亦居于中心地位，它既是3條激活途徑的交匯，又是C3b依賴性陽(yáng)性反饋環(huán)路的基礎(chǔ)；同時(shí)C3裂解片段及其結(jié)合蛋白復(fù)雜而多樣。C3分子上存在著眾多與其他分子的結(jié)合位點(diǎn)，C3通過(guò)其上的系列受體位點(diǎn)與補(bǔ)體其它成分、病原體、血細(xì)胞等發(fā)生廣泛的作用，從而在機(jī)體的免疫防御和免疫病理中發(fā)揮重要作用。rC3B是C3上與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面補(bǔ)體受體的結(jié)合位點(diǎn)，也就是補(bǔ)體III型受體(CR3，⑶Ilb /⑶18 )結(jié)合位。C3裂解片段通過(guò)該結(jié)合位點(diǎn)與大量存在于單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等上的C R 3結(jié)合，從而促進(jìn)機(jī)體對(duì)血液中病原體的吞噬和清除，提高魚(yú)類(lèi)抗病性，增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)自身的免疫力。石斑魚(yú)類(lèi)隸屬S盧形目iPerciformes),鯧科{Serranidae),石斑魚(yú)亞科(Bpinephelinae),石斑魚(yú)屬(Bpinephelus),為暖水性礁棲魚(yú)類(lèi),廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域。石斑魚(yú)是馳名世界的名貴海產(chǎn)魚(yú)類(lèi)之一，其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，為餐桌中的上等佳肴，被港澳地區(qū)推為我國(guó)的四大名魚(yú)之一，深受各地消費(fèi)者的喜愛(ài)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值巨大。但是，當(dāng)前氣候?yàn)?zāi)害和環(huán)境污染導(dǎo)致的高致病率和高死亡率，一直是石斑魚(yú)人工養(yǎng)殖過(guò)程中難以解決的問(wèn)題。市場(chǎng)上還沒(méi)有一種能夠有效增強(qiáng)石斑魚(yú)免疫力的飼料添加劑。酵母是最簡(jiǎn)單的真核生物，以其作為宿主表達(dá)外源蛋白有很大的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)繁殖快，易培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)單；能對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工修飾，如糖基化、乙?；龋话踩愿?，無(wú)致病性。巴斯德畢赤酵母是一種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，能將甲醇作為代謝的唯一碳源和能源。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有很多優(yōu)點(diǎn)在科研及生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用使用強(qiáng)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子-AOXl基因啟動(dòng)子；外源基因以單拷貝或多拷貝定點(diǎn)整合入基因組中，遺傳穩(wěn)定性好；重組蛋白以高水平分泌到幾乎無(wú)蛋白的培養(yǎng)基中，利用表達(dá)蛋白的純化；容易進(jìn)行高密度發(fā)酵，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目 的在于提供一種石斑魚(yú)rC3B蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述石斑魚(yú)rC3B蛋白的基因。本發(fā)明的另一目的在于提供一種石斑魚(yú)rC3B蛋白的前體蛋白，即石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白的基因。本發(fā)明的另一目的在于提供含有石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白基因及功能片段rC3B的克隆載體。本發(fā)明的另一目的在于提供含有石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白基因及功能片段rC3B的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一目的在于提供一種石斑魚(yú)補(bǔ)體C3功能片段rC3B重組蛋白及其制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供石斑魚(yú)rC3B蛋白和/或C3蛋白在制備提高魚(yú)類(lèi)免疫力制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
石斑魚(yú)rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,或者是SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。編碼上述石斑魚(yú)rC3B蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，或者是SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。編碼上述石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。生產(chǎn)石斑魚(yú)rC3B蛋白或石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白的方法，包括將上述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，表達(dá)得到rC3B蛋白或C3蛋白。本發(fā)明的有益效果如下
1.本發(fā)明首次獲得了石斑魚(yú)的補(bǔ)體C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不僅豐富了石斑魚(yú)的基因庫(kù)，而且可應(yīng)用于制備重組蛋白、魚(yú)類(lèi)免疫制劑或飼料添加劑，為石斑魚(yú)的生理免疫研究提供了新的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)；
2.將石斑魚(yú)rC3B核苷酸序列在畢赤酵母重組株表達(dá)，可以大量生產(chǎn)石斑魚(yú)rC3B重組蛋白，大大降低了生產(chǎn)成本，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；
3.本發(fā)明所提供的石斑魚(yú)rC3B重組蛋白，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明具有提高石斑魚(yú)免疫力等功能，可以應(yīng)用于制備魚(yú)類(lèi)尤其是石斑魚(yú)免疫制劑或飼料添加劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I是斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因5’端片段合成的第二次PCR凝膠電泳分析圖；圖2是斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因3’端片段合成的第二次PCR凝膠電泳分析 圖3是C3基因ORF的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖。圖4是斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3功能片段rC3B的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析 圖5是克隆載體pMD18-T-rC3B雙酶切(McoRI ,XbaI)驗(yàn)證 圖6是表達(dá)載體pPICZaA-rC3B雙酶切(McoRUXbaD驗(yàn)證 圖7是重組株pPICZaA-rC3B-X-33表達(dá)產(chǎn)物rC3B重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖； 圖8是重組株pPICZaA-rC3B-X-33表達(dá)產(chǎn)物rC3B重組蛋白的western_blot鑒定圖； 圖9是pPICZaA-rC3B畢赤酵母表達(dá)載體構(gòu)建示意 圖10是石斑魚(yú)rC3B的氨基酸序列和人類(lèi)rC3B氨基酸序列的對(duì)比圖；
圖11是rC3B抗原表位預(yù)測(cè)分析；
圖12是重組株pPICZaA-rC3B-X-33高密度發(fā)酵產(chǎn)物rC3B重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖(M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 pPICZaA- rC3B -X-33發(fā)酵產(chǎn)物；NC :陰性對(duì)照pPICZ α Α-33發(fā)酵產(chǎn)物);
圖13是在低溫應(yīng)激中的，Α，B, C三組魚(yú)血細(xì)胞數(shù)目隨應(yīng)激時(shí)間的變化情況(*表示與對(duì)照組相比有顯著性差異，P <0.0 = 5)；
圖14是在低溫應(yīng)激中A、B、C三組魚(yú)血細(xì)胞呼吸爆發(fā)水平隨應(yīng)激時(shí)間的變化情況(*表示與對(duì)照組相比有顯著性差異，P < O. 05);
圖15是在低溫應(yīng)激中A、B、C三組魚(yú)血細(xì)胞凋亡情況隨應(yīng)激時(shí)間的變化情況(*表示與對(duì)照組相比有顯著性差異，P < O. 05)。
具體實(shí)施例方式通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)獲得斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因中間片段
通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了石斑魚(yú)低溫文庫(kù)，測(cè)序得到一些功能基因，其中包含與石斑魚(yú)補(bǔ)體C3高度同源的片段。該補(bǔ)體C3基因中間片段長(zhǎng)度為396bp (SEQ IDNO. 5)。斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因5’端片段的合成
操作按照 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech,CA, USA) Protocol來(lái)進(jìn)行。根據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已測(cè)序的補(bǔ)體C3中間片段的序列設(shè)計(jì)了兩條下游引物C351和C352以進(jìn)行嵌套PCR。第一條下游引物C351為5’ - CTTTCGGCCTTGGCGGGTTTG(SEQ ID NO. 6)，第二條下游引物 C352 為5’ -ACGGAAACAACACGTCCTCTACG(SEQ ID NO. 7)。第一次PCR以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反轉(zhuǎn)錄得到的斜帶石斑魚(yú)肝臟cDNA為模板，經(jīng)降落PCR方法擴(kuò)增原補(bǔ)體C3中間片段的序列第298位至5’端的核苷酸序列，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘；(I) 94°C變性30秒，72 0C退火30秒，共5循環(huán)，72 °C延伸2分鐘；(2 )94 V變性30秒，70 V退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；最后94°C變性30秒68°C退火30秒，共30循環(huán)，72°C延伸2分鐘。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增原補(bǔ)體C3中間片段的序列第150位至5’端的核苷酸序列，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘；(I) 94°C變性30秒，72°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；(2) 94°C變性30秒，70°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；最后94°C變性30秒68°C退火30秒，共30循環(huán)，72°C延伸2分鐘。第一次PCR在瓊脂糖凝膠上未能檢測(cè)出條帶，第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見(jiàn)圖1，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；NC為陰性對(duì)照；1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將1804bp的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上得到重組質(zhì)粒pMD18-T-C3-5’-1804。將重組質(zhì)粒pMD18-T-C3-5’-1804用pMD18_T的一對(duì)通用引物進(jìn)行序列測(cè)定，其序列如SEQID NO. 14所示。測(cè)序結(jié)果與Genebank的序列進(jìn)行比較,結(jié)果表明克隆的1804bp產(chǎn)物是斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因5’端基因。斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因3’端片段的合成
操作按 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech,CA, USA) Protocol來(lái)進(jìn)行。根據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已測(cè)序的補(bǔ)體C3中間片 段的序列設(shè)計(jì)了兩條上游引物C331和C332以進(jìn)行嵌套PCR。第一條上游引物C331 為5’ -GTGGAAATCAGCGTACGGCAGA(SEQ ID NO. 8)，第二條上游引物 C332 為5’ -ACCCGCTCAAGCGTCCGAAAG(SEQ ID NO. 9)。第一次PCR以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反轉(zhuǎn)錄得到的斜帶石斑魚(yú)肝臟cDNA為模板，引物為C331，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增補(bǔ)體C3中間片段的序列第120位至3’poly A端的核苷酸序列，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘；(1)94°C變性30秒，72°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；(2)94°C變性30秒，70°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；最后94°C變性30秒68°C退火30秒，共30循環(huán)，72°C延伸2分鐘。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘；(I) 94°C變性30秒，72°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；(2) 94°C變性30秒，70°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；最后94°C變性30秒68°C退火30秒，共30循環(huán)，72°C延伸2分鐘。第一次PCR在瓊脂糖凝膠上未能檢測(cè)出條帶，第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見(jiàn)圖2，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；NC為陰性對(duì)照；1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將3332bp的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上得到重組質(zhì)粒pMD18-T-C3-3’-3210。將重組質(zhì)粒pMD18-T-C3-3’-3332用pMD18_T的一對(duì)通用引物進(jìn)行序列測(cè)定，其序列如SEQID NO. 15所示。測(cè)序結(jié)果與Genebank的序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明克隆的3332bp產(chǎn)物是斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3的3’端基因。斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因全長(zhǎng)序列的拼接
將已經(jīng)測(cè)序的補(bǔ)體C3中間片段、5’RACE片段和3’RACE片段進(jìn)行拼接，得到斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因的ORF全長(zhǎng)，即補(bǔ)石斑魚(yú)補(bǔ)體C3 cDNA全序列(SEQ ID NO. I)的第I一4974bp,總長(zhǎng)為4974bp，并推測(cè)出其氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)。根據(jù)拼接得到的C3基因ORF全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物C3qF5’-CTTCAGGGTTTAGGACGATGTG(SEQ ID NO. 10)，C3qA5’ -CCAGTGGGTCTTCTGGTGAGTG(SEQ ID NO. 11)。擴(kuò)增的長(zhǎng)度為5120bpo 以 M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反轉(zhuǎn)錄得到的斜帶石斑魚(yú)肝臟cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增石斑魚(yú)的補(bǔ)體C3功能片段rC3B序列，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3分鐘；下邊為40個(gè)循環(huán)94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸5分鐘；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見(jiàn)圖3，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；NC為陰性對(duì)照；1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物送去華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和拼接結(jié)果一致。
生物信息學(xué)方法分析斜帶石斑魚(yú)活性區(qū)段C3補(bǔ)體受體III結(jié)合區(qū)rC3B序列 經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，得到了人類(lèi)補(bǔ)體C3功能片段的序列。使用clustalx和GeneDoc兩個(gè)序
列分析軟件，將石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因氨基酸序列和人類(lèi)補(bǔ)體C3氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的補(bǔ)體C3功能片段rC3B序列和石斑魚(yú)的補(bǔ)體C3功能片段rC3B同源性較高(圖10)。另外。通過(guò)DNAstar軟件分析了石斑魚(yú)的補(bǔ)體C3基因的抗原表位(圖11)。進(jìn)一步的確定了包含最多結(jié)合位點(diǎn)的活性區(qū)段石斑魚(yú)C3補(bǔ)體受體III結(jié)合區(qū)rC3B(C3蛋的1331—1430 AA)。最后,使用RNAstructure 4. 6軟件分析了該功能片段的RNA 二級(jí)機(jī)構(gòu),發(fā)現(xiàn)沒(méi)有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)。斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B序列基因的合成
根據(jù)分析好的斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B的cDNA序列(SEQ ID NO. 3)，設(shè)計(jì)合成兩段引物，上游引物是在該片段第I位堿基起的19個(gè)堿基前加上現(xiàn)的限制酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基5’- CCGGAATTCATGGAAGCAACGGTGAAAA(SEQ ID NO. 12)，共 28bp ;下游引物是在該 片段第284位堿基起的前17個(gè)堿基加上油a/的限制酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基、6Xhis終止密碼子 5’ -TGCAGATCTTTAATGATTGAGATAGATGATGTCTTTCTGACAGGACTG-3’ (SEQ ID NO. 13)，共48bp。以 M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反轉(zhuǎn)錄得到的斜帶石斑魚(yú)肝臟cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增石斑魚(yú)的補(bǔ)體C3功能片段rC3B序列，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3分鐘；下邊為40個(gè)循環(huán)94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30分鐘；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見(jiàn)圖4，其中M: marker,NC為陰性對(duì)照，I : PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。從圖4可見(jiàn)PCR擴(kuò)增了一段長(zhǎng)約350bp的序列。含斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B序列的克隆載體
將實(shí)施例6所獲得目的基因片段分離純化，然后與pMDlS-T (TAKARA)載體按照該試劑盒提供的體系4°C連接過(guò)夜(約16h)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)Amp+抗性和藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性克隆，通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切驗(yàn)證以及測(cè)序驗(yàn)證，證明斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B序列克隆到載體中，命名為pMD18-T-rC3B，克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α所得到的重組菌株命名為pMD18-T-rC3B_DH5 α。使用EcoRI、XbaI對(duì)克隆載體pMD18-T-rC3B進(jìn)行雙酶切，酶切圖譜見(jiàn)圖5，其中M: marker, NC為pMD18_T_rC3B，I pMD18-T-rC3B 的及、XbaI 雙酶切產(chǎn)物。含斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B序列的表達(dá)載體pPICZaA- rC3B的構(gòu)建
克隆載體pMD18-T-rC3B用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI雙酶切后，酶切產(chǎn)物用
E.Z. N. A. Gel Extraction Kit回收,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,分離純化約350bp的斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B序列；
載體質(zhì)粒pPICZaA經(jīng)限制性內(nèi)切酶及和油a/雙酶切后分離純化3. 6kb的大片段，與約350bp的斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B的基因片段按1:3混合，用T4連接酶16°C連接16小時(shí)后用標(biāo)準(zhǔn)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，用低鹽LB平板篩選具Zeocin抗性的轉(zhuǎn)化子，以標(biāo)準(zhǔn)方法提取質(zhì)粒，篩選大小約4. O kb的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶及和油a/雙酶切重組質(zhì)粒，得到約350bp和3. 6kb的兩個(gè)片段，大小分別與斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B的基因片段和表達(dá)載體pPICZaA大小相同，證明斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B的基因片段已克隆入畢赤酵母表達(dá)載體PPICZaA中，重組質(zhì)粒命名為pPICZaA-rC3B。質(zhì)粒構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖9。使用EcoRI、XbaI對(duì)表達(dá)載體PPICZaA_rC3B進(jìn)行雙酶切，酶切分析圖見(jiàn)圖6，其中M:marker, NC為pPICZ a A雙酶切產(chǎn)物，I pPICZaA-rC3B雙酶切產(chǎn)物。能高效表達(dá)斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B蛋白的畢赤酵母重組株pPICZaA- rC3B-X-33構(gòu)建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect Pichia Expression Kit 說(shuō)明書(shū)制備畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒pPICZaA- rC3B用fee/線形化后凝膠回收，用標(biāo)準(zhǔn)方法電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞，在含Zeocin 400 μ g/ml的YPDS平板上28°C進(jìn)行培養(yǎng)。約3d后長(zhǎng)出單克隆，挑取單克隆經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定篩選出能高效表達(dá)斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B重組蛋白的畢赤酵母重組株pPICZaA- rC3B _X_33。利用畢赤酵母基因工程菌pPICZaA- rC3B _X_33生產(chǎn)重組斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B蛋白
分別挑取各種工程菌的單克隆，接種于BMGY中，28°C，200rpm培養(yǎng)0D600至2_6，換培養(yǎng)基BMMY稀釋0D600至I. 0，每24h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加O. 5%甲醇，培養(yǎng)48h_72h后2000rpm， 4°C收集上清。取Iml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法濃縮后，加5X電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標(biāo)準(zhǔn)方法跑TriCine-SDS-PAGE凝膠電泳，同時(shí)取陰性對(duì)照按同樣方法處理后電泳。陰性對(duì)照為空載質(zhì)粒PPICZaA轉(zhuǎn)化X-33后長(zhǎng)出的單克隆培養(yǎng)后的上清蛋白。結(jié)果見(jiàn)圖7，其中:M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4、5、6、7、8 :重組株pPICZaA- rC3B -X-33表達(dá)產(chǎn)物；NC為陰性對(duì)照，顯示pPICZaA- rC3B _X_33在12Kd和17Kd之間出現(xiàn)一條新的蛋白條帶，而陰性對(duì)照不出現(xiàn)此帶。從圖中看出，第四個(gè)菌株的表達(dá)量最高。石斑魚(yú)rC3B蛋白抗原活性鑒定實(shí)驗(yàn)
將重組斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B蛋白采用免疫印跡(Western blot)方法進(jìn)行免疫活性鑒定。一抗為鼠源his單克隆抗體(Novagen), 二抗為羊抗鼠IgG-HRP(鼎國(guó)公司)。結(jié)果見(jiàn)圖8，其中:M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4、5、6、7、8 :重組株pPICZaA- rC3B -X-33表達(dá)產(chǎn)物Western blot鑒定圖譜；NC為陰性對(duì)照，顯示鼠源his單克隆抗體能識(shí)別我們用畢赤酵母表達(dá)的重組斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B蛋白，證明得到的蛋白是重組斜帶石斑魚(yú)功能片段rC3B蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
一、畢赤酵母基因工程菌PPICZaA- rC3B _X_33的高密度發(fā)酵
發(fā)酵過(guò)程參照 invitrogen 公司的 Pichia Fermentation Process Guidelines,具體步驟如下
I.分別挑取篩選好的單克隆菌株pPICZ a A-rC3B-X-33與pPICZ α Α_33，pPICZ α Α-33菌株作為空載對(duì)照。加入200ml MGY液體培養(yǎng)基到IL的錐形瓶中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至 0D600=2-6 (約 16-24hours)。2. 組裝好發(fā)酵罐，加入3L含有4%甘油的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(配方見(jiàn)PichiaFermentation Process Guidelines),然后121°C,15min滅菌，待冷卻后，用流加瓶加入氨水，調(diào)pH到5。3.在火焰圈保護(hù)下，將步驟I中搖好的菌種接種于自動(dòng)控制發(fā)酵罐中。調(diào)節(jié)通氣量，灌壓，轉(zhuǎn)速來(lái)維持溶氧高于20%。設(shè)定發(fā)酵溫度為29°C，自動(dòng)流加氨水控制pH 5±0.05。4.當(dāng)發(fā)酵罐中的甘油耗盡后(約接種后20個(gè)小時(shí))，用流加瓶流加每升含12mlPTMl (配方見(jiàn) Pichia Fermentation Process Guideline),設(shè)置流加速度為 54.45ml/h，直到細(xì)胞濕重為200 g/liter結(jié)束(流加大約4個(gè)小時(shí))。5.甘油消耗盡后，開(kāi)始添加每升含12mlPTMl的甲醇，設(shè)定流加速度為10.8 ml/h，兩個(gè)小時(shí)，設(shè)定流加速度為21.9 ml/h，兩個(gè)小時(shí)后，設(shè)定流加速度為32.7 ml/h，保持這個(gè)速度直到發(fā)酵結(jié)束。這個(gè)階段需要60個(gè)小時(shí)，總共添加約I. 2L的甲醇。此時(shí)的細(xì)胞濕重約為 290 g/liter ο6.分別取pPICZ a A-rC3B_X_33與pPICZ α Α-33發(fā)酵的菌液各Iml，上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法濃縮后，加5Χ電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標(biāo)準(zhǔn)方法跑Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，pPICZ α Α-33發(fā)酵的菌液做為陰性對(duì)照組，結(jié)果見(jiàn)圖12。顯示pPICZaA- rC3B _X_33在12Kd和17Kd之間出現(xiàn)一條新的蛋白條帶，而陰性對(duì)照不出現(xiàn)此帶。結(jié)果說(shuō)明，pPICZaA- rC3B _X_33菌種發(fā)酵產(chǎn)生了高濃度的重組蛋白。7.把發(fā)酵液用噴霧干燥器處理，得到粉末，pPICZaA- rC3B -X-33菌種的發(fā)酵液粉末做為飼料添加劑，PPICZ αΑ-33菌種的發(fā)酵液粉末做為對(duì)照，用于下面的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。二、飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn) I實(shí)驗(yàn)條件
選取同一批次、體質(zhì)健康、規(guī)格相近的斜帶石斑魚(yú)放養(yǎng)在養(yǎng)殖桶中。水溫25 30°C,水體鹽度28 32%。，pH值8. I 8. 3，溶解氧值大于5. O mg/L,并且水體持續(xù)循環(huán)。2飼料配置
飼料共分為3種，A為商品料，B為商品料+ lwt% pPICZ α Α-33菌種的發(fā)酵液粉末，C為商品料+ lwt%pPICZaA- rC3B _X_33菌種的發(fā)酵液粉末。分別將各組粉料攪拌均勻，每天投喂前準(zhǔn)確稱量，用水稀釋后制備成濕顆粒飼料投喂。 3實(shí)驗(yàn)魚(yú)飼養(yǎng)
本試驗(yàn)設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組30條魚(yú)。分別投喂A、B、C組飼料。試驗(yàn)魚(yú)平均體重O. 95±0. Olg，長(zhǎng)度為3±0. 5cm。養(yǎng)殖水不斷充氣，水溫29土 2°C，水體pH值8. 1-8. 3，鹽度28 32%。。上午和下午按照魚(yú)體重的8%左右各投喂一次，雨天少量投喂。每天及時(shí)清理殘餌，觀察記錄，飼養(yǎng)時(shí)間7周。實(shí)驗(yàn)前禁食一天。4應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 4. I實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
取用飼喂的斜帶石斑魚(yú)做溫度應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，應(yīng)激溫度為14土 0.5°C。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備I.OmXO. 5 mX 0.5 m的儲(chǔ)物箱3個(gè)，在每個(gè)儲(chǔ)物箱先裝滿40L的海水，并將裝有海水的儲(chǔ)物箱置于氣候箱中并放入水溫計(jì)來(lái)測(cè)定水溫，待水溫穩(wěn)定在14±0. 5°C，然后每個(gè)儲(chǔ)物箱分別放A，B，C三組魚(yú)各30條魚(yú)，將做低溫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的儲(chǔ)物箱置于氣候箱中并放入水溫計(jì)來(lái)測(cè)定水溫。應(yīng)激12小時(shí)，分別在O小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)取樣，每組取6尾。4. 2血細(xì)胞計(jì)數(shù)及滲透壓的測(cè)定
用I mL—次性無(wú)菌注射器臀鰭下方尾靜脈或尾動(dòng)脈抽血，取完血后，拔下針頭，將血液注入玻璃采血管中，4°C下靜置，取血清。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)血細(xì)胞方法按照WHO手冊(cè)進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)血細(xì)胞3次，取3次結(jié)果的平均值為計(jì)數(shù)結(jié)果。4. 2. I血細(xì)胞計(jì)數(shù)的測(cè)定原理
血細(xì)胞的計(jì)數(shù)一般使用血球計(jì)數(shù)板。每塊計(jì)數(shù)板由H形凹槽分為2個(gè)同樣的計(jì)數(shù)池，計(jì)數(shù)池高O. 1mm。計(jì)數(shù)池分為9個(gè)大方格，每個(gè)大格面積為I. Omm.容積為O. Imm3 ( μ I),其中，中央大方格分成25個(gè)中方格，位于正中及四角5個(gè)中方格是紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域。四角的4個(gè)大方格是白細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域。在計(jì)數(shù)血細(xì)胞時(shí)，要計(jì)算位于中央的大方格中，其正中及四角5個(gè)中方格的總細(xì)胞數(shù)目，再根據(jù)公式細(xì)胞數(shù)/ml=五個(gè)中方格內(nèi)的細(xì)胞個(gè)數(shù)/5X25X 10000X 稀釋倍數(shù)。4. 2. 2血細(xì)胞計(jì)數(shù)的測(cè)定方法
視待測(cè)血細(xì)胞的濃度，加抗凝劑適當(dāng)稀釋(一般稀釋100倍)，然后取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，并在計(jì)數(shù)區(qū)內(nèi)蓋上一塊蓋玻片。將血細(xì)胞輕輕吹打混勻，用移液槍吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生。靜置片刻后，把血球計(jì)數(shù)板放在顯微鏡的載物臺(tái)上然后觀察并計(jì)數(shù)中央的大方格中，其正中及四角5個(gè)中方格的總細(xì)胞數(shù)目。在計(jì)數(shù)時(shí)，要遵循原則數(shù)上 線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線。測(cè)數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈。每個(gè)血樣分別計(jì)數(shù)血細(xì)胞3次，取3次結(jié)果的平均值為計(jì)數(shù)結(jié)果。結(jié)果顯示應(yīng)激過(guò)程中，在14±0. 5°C應(yīng)激O小時(shí)，三種飼料喂養(yǎng)的魚(yú)血細(xì)胞數(shù)目并沒(méi)有明顯差異，C組略高。應(yīng)激3小時(shí)后，A，B，C三組的血細(xì)胞數(shù)目均有下降，但是C組的血細(xì)胞數(shù)目高于A、B組,并且差異顯著。應(yīng)激6小時(shí)后，A, B, C三組的血細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步下降，但是C組的血細(xì)胞數(shù)目下降較A、B組少，數(shù)目明顯高于A、B組，并且差異顯著。應(yīng)激12小時(shí)后，A，B，C三組的血細(xì)胞數(shù)目均有上升，C組的血細(xì)胞數(shù)目略高于A，B組，沒(méi)有明顯差異(見(jiàn)圖13)。4.3呼吸爆發(fā)的測(cè)定
4.3. I細(xì)胞呼吸爆發(fā)的測(cè)定原理
活性氧(Reactive oxygen species, R0S)包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。2, 7-二氯氫化突光素二脂(2，7-dichlorof luorescein diacetate, DCFH-DA)是迄今為止最常用、最靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢探針。本身沒(méi)有熒光的DCFH-DA可穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。在激發(fā)波長(zhǎng)502nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm附近，使用流式細(xì)胞儀的FLl通道檢測(cè)DCF熒光，從而測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。4. 3. 2血細(xì)胞呼吸爆發(fā)的測(cè)定方法
取200 μ I的血細(xì)胞懸液，加入200 μ I PBS緩沖液(MAS抗凝劑進(jìn)行稀釋)，混勻，調(diào)整細(xì)胞的濃度為I X IO6個(gè)/ml左右，使用熒光染料2，7- 二氯氫化熒光素二脂(DCFH-DA)(終濃度10 μ Μ) 25°C下避光染色30min。然后使用200目的篩網(wǎng)過(guò)濾將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到上樣管中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并用Cellquest軟件分析DCF平均熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果顯示A，B, C三組魚(yú)受到低溫14±0. 5°C應(yīng)激后，應(yīng)激O小時(shí)，三種飼料喂養(yǎng)的魚(yú)血細(xì)胞的活性氧(呼吸爆發(fā))并沒(méi)有明顯差異。隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，血細(xì)胞的活性氧(呼吸爆發(fā))水平不斷升高，A，B組血細(xì)胞的活性氧含量上升明顯比C組多，在6小時(shí)達(dá)到最大值，并且A，B組的活性氧含量明顯高于C組。應(yīng)激12小時(shí)后，A，B, C三組的血細(xì)胞的活性氧(呼吸爆發(fā))均有下降，但是C組的血細(xì)胞的活性氧(呼吸爆發(fā))明顯低于A，B組(見(jiàn)圖14)。
細(xì)胞凋亡測(cè)定
4. 4. I血細(xì)胞凋亡的測(cè)定原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液 用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞。血淋巴細(xì)胞凋亡的測(cè)定原理在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)由膜脂內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合。用標(biāo)記了 FITC的Annexin V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的。碘化丙唳(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜,但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。將Annexin V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。在雙參數(shù)流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為(FIT C— / PI—)；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為(FITC + / PI +);而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)(FIT C + / PI —)。4. 4. 2血淋巴細(xì)胞凋亡的測(cè)定方法
使用Annexin V/PI apoptosis kit,購(gòu)自聯(lián)科生物。具體步驟
收集血細(xì)胞，用MAS抗凝劑進(jìn)行稀釋，調(diào)整血細(xì)胞濃度大約為1-5X106 cells/ml，取200 μ I稀釋的血細(xì)胞，在細(xì)胞懸浮液中加入5 μ I Annexin V-FITC和10 μ I PI后輕輕混勻，在黑暗環(huán)境下靜置5分鐘，然后使用200目的篩網(wǎng)過(guò)濾將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到上樣管中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明Α，B, C三組魚(yú)受到低溫14±0. 5°C應(yīng)激后，應(yīng)激O小時(shí)，三種飼料喂養(yǎng)的魚(yú)血細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)目并沒(méi)有明顯差異。隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),血細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)目不斷增加，A、B組血細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)目增加比C組多，在6小時(shí)達(dá)到最大值，并且A、B組的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯高于C組。應(yīng)激12小時(shí)后，A、B、C三組的血細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)目均有下降，但是C組的血細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯少于A、B組，并且差異顯著(見(jiàn)圖15)。以上實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組C組，食用了含有重組蛋白rC3B的飼料后，在低溫應(yīng)激過(guò)程中，其抗應(yīng)激能力明顯優(yōu)于對(duì)照組A、B。由此可見(jiàn)，重組蛋白rC3B可用于制備魚(yú)類(lèi)免疫制劑或飼料添加劑，提高魚(yú)類(lèi)尤其是石斑魚(yú)的免疫力。
權(quán)利要求
1.石斑魚(yú)rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO: 4所示,或者是SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
2.編碼權(quán)利要求I所述石斑魚(yú)rC3B蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:3所示。
4.石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO :2所示,或者是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
5.編碼權(quán)利要求4所述石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
7.一種克隆載體，含有權(quán)利要求2、3、5或6所述的基因。
8.—種表達(dá)載體,含有權(quán)利要求2、3、5或6所述的基因。
9.生產(chǎn)石斑魚(yú)rC3B蛋白或石斑魚(yú)補(bǔ)體C3蛋白的方法，包括將權(quán)利要求8所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，表達(dá)得到rC3B蛋白或C3蛋白。
10.權(quán)利要求I或4所述的蛋白在制備提高魚(yú)類(lèi)免疫力制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了斜帶石斑魚(yú)補(bǔ)體C3基因、載體、重組菌株和蛋白及其應(yīng)用。石斑魚(yú)rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，或者是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。本發(fā)明首次獲得了石斑魚(yú)的補(bǔ)體C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不僅豐富了石斑魚(yú)的基因庫(kù)，而且可應(yīng)用于制備重組蛋白、魚(yú)類(lèi)免疫制劑或飼料添加劑，為石斑魚(yú)的生理免疫研究提供了新的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102702339SQ20121013612
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月24日
發(fā)明者劉玉鳳, 王維娜, 祁增華 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)