專利名稱：一種阿維菌素B1a高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及ー種阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株及其誘變方法與其在發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素Bla中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿維菌素(avermectin, AVM)是一種由放線菌阿維鏈霉菌(streptomycesavermitilis)經(jīng)液體發(fā)酵產(chǎn)生的ー類十六元環(huán)內(nèi)脂類抗生素,是ー種全新無(wú)公害生物農(nóng)用抗生素，具有高效、低毒及環(huán)境友好等特點(diǎn)，對(duì)蔬菜、果樹、棉花、水稻等多種作物的相關(guān)害蟲有良好防效殺滅作用，其殺蟲活性比一般化學(xué)農(nóng)藥高出幾到幾十倍。作為ー種農(nóng)用殺蟲劑，阿維菌素的作用機(jī)理獨(dú)特，對(duì)害蟲具有觸殺和胃毒作用，對(duì)靶標(biāo)作物有較強(qiáng)的滲透作用，能有效防治雙翅目、同翅目、鞘翅目和磷翅目害蟲。作為農(nóng)用藥物，它具有高選擇性和高安全性。在常用劑量下，不僅對(duì)人畜安全，還不傷害大多種類的有益昆蟲，不破壞生態(tài)。在光照條件下或在土壌微生物作用下迅速降解成無(wú)活性的化合物，其分子碎片最終作為碳源被植物和微生物分解利用，幾乎無(wú)任何殘留毒性。在水中易降解，無(wú)殘留，不污染環(huán)境，且在生物體內(nèi)也無(wú)積累和持久性殘留。是目前世界上最有前途的生物殺蟲殺螨劑。目前，上千種阿維菌素衍生物已經(jīng)合成出來(lái)，已經(jīng)商品化的有伊維菌素(ivermectin,簡(jiǎn)稱IVM),?，斁?emamectin,又稱甲氨基阿維菌素)，道拉菌素(dormectin),埃拍利諾菌素(eprinomectin,又稱こ酰氨基阿維菌素)和色拉菌素(selamectin)等?？梢?jiàn)，阿維菌素不僅是ー個(gè)優(yōu)異的產(chǎn)品，更是ー種寶貴的資源，被認(rèn)為是繼青霉素以來(lái)抗生素的又一次革命。因此，市場(chǎng)拉動(dòng)和技術(shù)進(jìn)步都推動(dòng)了阿維菌素得迅猛發(fā)展。經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的阿維菌素中包括結(jié)構(gòu)類似物共8種，按其中的C5、C22_23、C26三個(gè)位置上的結(jié)構(gòu)差異可以區(qū)分為Ala、Alb、A2a、A2b、Bla、Bib、B2a、B2b 8種組分，其中B組分的生物活性優(yōu)于A組分，其中以Bla組分活性最高且毒性最小。因此，提高發(fā)酵產(chǎn)物中Bla組分已經(jīng)成為目前研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。例如，河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙麗坤等人利用紫外線-氯化鋰(UV-LiCl)和紫外線-亞硝基胍(UV-NTG)對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變處理獲得了一株相對(duì)出發(fā)菌株含量提高65%左右的高產(chǎn)菌株。沈陽(yáng)藥科大學(xué)生物技術(shù)與生物制藥實(shí)驗(yàn)室采用NTG、DES、紫外線等誘變因子對(duì)阿維鏈霉菌的原始菌株進(jìn)行了多次誘變處理，產(chǎn)量有了明顯提高。CN201110003059. 2公開了ー種阿維菌素生產(chǎn)菌及其制備方法，其通過(guò)反復(fù)的誘變和篩選得到一株名為FT26-9的高產(chǎn)菌株，其應(yīng)用于エ業(yè)生產(chǎn)可提高發(fā)酵單位40%左右。但由于其誘變大多采用了具有致癌作用的劇毒有機(jī)試劑，且誘變エ藝復(fù)雜，對(duì)人體健康和環(huán)境保護(hù)帶來(lái)不利影響，上述技術(shù)方案有待進(jìn)ー步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之ー在于提供一種簡(jiǎn)單、高效、安全的阿維菌素Bla高產(chǎn)菌誘變方法，誘變篩選得到一株可大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素Bla組分的阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二在于提供上述阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株，其分類命名為阿維鏈霉菌(streptomycesavermitilis)AVE07-N2-16515,已于2012年4月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012094。本發(fā)明所述的阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515的篩選方法是將阿維鏈霉菌出發(fā)菌株，經(jīng)低能氮離子注入-氯化鋰(N+-LiCl)復(fù)合誘變結(jié)合紫外線-氯化鋰(UV-LiCl)復(fù)合誘變后，通過(guò)初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩選獲阿維菌素Bla產(chǎn)量高的菌株作為下一輪誘變的出發(fā)菌株，重復(fù)上述誘變過(guò)程，最后篩選出阿維菌素Bla產(chǎn)量高的目標(biāo)菌株。本發(fā)明菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化學(xué)特征如下菌落顏色灰白色。需氧方式好氧生長(zhǎng)。菌落大小2 5_。適宜生長(zhǎng)溫度27· 5 28. 5°C。適宜生長(zhǎng)pH :7.2 7. 4。菌體形態(tài)圓形菌落，無(wú)光澤。革蘭氏染色陽(yáng)性。本發(fā)明所提供的阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株的誘變方法，具體步驟如下(a)、單孢子懸浮液制備將阿維鏈霉菌出發(fā)菌株孢子制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為IO6個(gè)/毫升。(b)、低能氮離子注入-氯化鋰復(fù)合誘變?nèi). ImL的步驟(a)中孢子懸液均勻涂布于無(wú)菌空平皿上，以無(wú)菌風(fēng)吹干，在10 18KeV、注入劑量為40 X IO14 240 X 1014ions/cm2下對(duì)阿維鏈霉菌進(jìn)行氮離子注入，離子注入完畢后，取出平皿，在無(wú)菌環(huán)境下用ImL無(wú)菌水洗脫，涂布到氯化鋰平板培養(yǎng)基上，在26 30°C下倒置培養(yǎng)6 7d。(c)、紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變?nèi)?mL步驟(a)中孢子懸液移入含有磁力轉(zhuǎn)子的無(wú)菌空平板中，進(jìn)行紫外線照射誘變，照射時(shí)間為30 90s，誘變結(jié)束后取菌懸液涂布于氯化鋰平板培養(yǎng)基上，在26 30°C下避光倒置培養(yǎng)6 7d。(d)、誘變菌株的篩選初篩將步驟(b)和步驟(C)誘變得到的單菌落接種至斜面培養(yǎng)基上，在26 30°C下培養(yǎng)6 7d，鏟取二分之一的菌體于離心管中，用丙酮浸泡12 15h，然后加入
O.25mL乙酸乙酯，快速混勻，離心，取上清液測(cè)定各菌株浸取液中阿維菌素Bla效價(jià)，留取50 %的高效價(jià)菌株上搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩。、
復(fù)篩將初篩篩選到的菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)接入種子培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，按2 10%(v/v)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。在26 30°C，180 220rpm搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)8 IOd下?lián)u床，取3mL發(fā)酵液于離心管中，3500rpm高速離心IOmin,棄上清液,加入甲醇至9mL,在快速混勻器上震蕩30min ；3500rpm高速離心lOmin，取上清液測(cè)定發(fā)酵液中阿維菌素Bla效價(jià)。取發(fā)酵液阿維菌素Bla效價(jià)最高的菌株作為下次誘變的出發(fā)菌株，重復(fù)步驟(a) (d)，直至篩選出阿維菌素Bla產(chǎn)量高的目標(biāo)菌株阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515。
步驟(b)中低能氮離子注入，優(yōu)選誘變能量為16KeV，誘變劑量為160X 1014ions/
2
cm o步驟(c)中紫外線誘變，優(yōu)選照射時(shí)間為60s。步驟(b)和步驟(C)中所用的氯化鋰平板培養(yǎng)基為碳源0.5% 1.5%、氮源0. 1% 0. 3%、無(wú)機(jī)鹽0. 5% 1.0%、瓊脂I. 2% 1.8%、氯化鋰I. OmoL噸―1，其余為水，PH 7. 2 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和可溶性淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為乙酸銨和硫酸銨中的一種或兩種的混合；所述無(wú)機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽中的一種或幾種的混合步驟(d)中所用的斜面培養(yǎng)基為碳源0. 5% I. 5%、氮源0. I % 0. 3%、無(wú)機(jī)鹽0. 5% I. 0%、瓊脂I. 20Z0 I. 8%、其余為水，pH 7. 2 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和可溶性淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為乙酸銨和硫酸銨中的一種或兩種的混合；所述無(wú)機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽中的一種或幾種的混合。步驟(d)中所用的種子培養(yǎng)基為碳源2. 0% 3. 0%、氮源2. 0% 4. 0%、微量元素0. 0001% 0. 0004%，淀粉酶3 5u/g淀粉，其余為水，pH 7. 0 7. 2 ;其中所述碳源為玉米淀粉和葡萄糖中的一種或兩種的混合；所述氮源為有機(jī)含氮化合物，為花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿(也可作為生長(zhǎng)因子)、酵母粉和酵母膏中的一種或幾種的混合；所述的微量元素為氯化鈷。步驟(d)中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基為碳源5.0% 15. 0%、氮源2.0% 4.0%、微量元素0. 0001% 0. 0004%，淀粉酶3 5u/g淀粉，其余為水，pH 7. 0 7. 2 ;其中所述碳源為玉米淀粉、葡萄糖和麥芽糖中的一種或幾種的混合；所述氮源為有機(jī)含氮化合物，為花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿(也可作為生長(zhǎng)因子)、酵母粉中的一種或幾種的混合；所述的微量元素為氯化鈷。上述篩選出的阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515在發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素Bla中的應(yīng)用。具體步驟如下(I)、平板培養(yǎng)將阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515接種于平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26 30°C，培養(yǎng)時(shí)間為6 7d ;(2)、斜面培養(yǎng)將步驟⑴平板培養(yǎng)的阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515接種到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26 30°C，培養(yǎng)時(shí)間6 7d。(3)、種子培養(yǎng)將步驟(2)斜面培養(yǎng)的阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515接種到種子培養(yǎng)基中，250mL培養(yǎng)瓶中裝液量為20 50mL，培養(yǎng)溫度為26 30°C，180 220rpm搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)30 45h ；(4)、發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(3)中的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2 10% (v/v), 250mL培養(yǎng)瓶中裝液量為35 65mL，培養(yǎng)溫度為26 30°C，180 240rpm搖 床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)8 10d。其中，所述平板培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源0. 5% I. 5%、氮源
0.1% 0. 3%、無(wú)機(jī)鹽0. 5% I. 0%、瓊脂I. 2% I. 8%、其余為水，pH 7. 2 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和可溶性淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為乙酸銨和硫酸銨中的一種或兩種的混合；所述無(wú)機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽中的一種或幾種的混合。
所述斜面培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源O. 5% I. 5%、氮源O. 1%
O.3%、無(wú)機(jī)鹽O. 5% I. O %、瓊脂I. 2% I. 8 %、其余為水，pH 7. 2 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和可溶性淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為乙酸銨和硫酸銨中的一種或兩種的混合；所述無(wú)機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽中的一種或幾種的混合。所述種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源2. 0% 3. 0%、氮源2. 0% 4. 0%、微量元素O. 0001% O. 0004%，淀粉酶3 5u/g淀粉，其余為水，pH7. O 7. 2 ;其中所述碳源為玉米淀粉和葡萄糖中的一種或兩種的混合；所述氮源為花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿、酵母粉和酵母膏中的一種或幾種的混合；所述的微量元素為氯化鈷。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源5. O % 15. O %、氮源2. O % 4. O %、微量元素O. 0001% O. 0004%，淀粉酶3 5u/g淀粉，其余為水，pH7. O 7. 2 ;其中所述碳源為玉米淀粉、葡萄糖和麥芽糖中的一種或幾種的混合；所述氮源為花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿、酵母粉中的一種或幾種的混合；所述的微量元素為氯化鈷。本發(fā)明有益效果本發(fā)明采用低能氮離子注入-氯化鋰復(fù)合誘變和紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變相結(jié)合，最終篩選獲得一株阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515，可較大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素Bla組分并減少其他組分，且遺傳穩(wěn)定性好，菌株連續(xù)傳代5次后效價(jià)并無(wú)明顯變化。在5L發(fā)酵罐中，以葡萄糖為速效碳源，玉米淀粉為遲效碳源，發(fā)酵產(chǎn)阿維菌素Bla效價(jià)達(dá)到3048 μ g/mL，相比原始出發(fā)菌株提高了 23. 4%。本技術(shù)發(fā)明完全符合工業(yè)化阿維菌素生產(chǎn)菌株的誘變和篩選需要，并可應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖I :阿維鏈霉菌復(fù)合誘變圖譜；圖2 :為低能氮離子注入誘變不同能量、劑量下菌株的正負(fù)突變率，從圖中可以看出，10KeV、14KeV以及18KeV下菌株的正突變率普遍低于16KeV，可以確定16KeV為菌種的最佳誘變能量，另外在誘變劑量為160X1014ionS/cm2下正突變率最高，容易篩選出效價(jià)提高幅度超過(guò)10%的菌株，所以確定誘變能量16KeV，誘變劑量160X1014ionS/cm2為本發(fā)明中所用最佳低能氮離子注入誘變條件；圖3 :為紫外誘變的正負(fù)突變率，從圖中可以看出，隨著紫外誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，正突變率先上升后下降，在60s時(shí)，菌株的正突變率最高，達(dá)到18. I %，確定60s為本發(fā)明中所用紫外誘變最佳時(shí)間；圖4 :實(shí)施例3發(fā)酵液中阿維菌素Bla色譜圖，其中第3個(gè)峰為阿維菌素Bla色譜峰。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例I :本實(shí)施例說(shuō)明將阿維鏈霉菌出發(fā)菌株進(jìn)行誘變的方法。
以實(shí)驗(yàn)室保存的阿維鏈霉菌AVE07為出發(fā)菌株，進(jìn)行誘變，具體步驟如下(a)、單孢子懸浮液制備取26 30°C恒溫培養(yǎng)6 7d的阿維鏈霉菌新鮮斜面加無(wú)菌水10mL，刮洗下孢子傾于帶有一定玻璃珠的250mL三角瓶?jī)?nèi)震蕩搖勻20min (250rpm)，打散孢子鏈，三層脫脂紗布過(guò)濾，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度IO6個(gè)/毫升。(b)、低能氮離子注入-氯化鋰復(fù)合誘變?nèi)?. ImL的步驟(a)中孢子懸液均勻涂布于無(wú)菌空平皿上，鏡檢無(wú)細(xì)胞重疊者進(jìn)行低能氮離子注入。本實(shí)驗(yàn)低能氮離子注入機(jī)為多功能注入機(jī)。分別在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能 量下對(duì)阿維鏈霉菌進(jìn)行離子注入。注入劑量分別為 40 X 1014ions/cm2、80 X 1014ions/cm2、120 X 1014ions/cm2、160 X 1014ions/cm2、200X 1014ions/cm2、240X 1014ions/cm2。革巴室真空度為 10 3Pa,以 20S 脈沖式注入，間隔15s，靶室內(nèi)放置不接受注入的對(duì)照樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，確定誘變能量16KeV，誘變劑量160 X 1014ionS/cm2為最佳低能氮離子注入誘變條件。離子注入完畢后，取出平皿，在無(wú)菌環(huán)境下用Iml無(wú)菌水洗脫，涂布到氯化鋰平板培養(yǎng)基上，在26 30°C下倒置培養(yǎng)6 7d。(c)、紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變?nèi)?mL步驟(a)中孢子懸液移入含有磁力轉(zhuǎn)子的無(wú)菌空平板中，至于磁力攪拌器上。先開啟20W紫外燈預(yù)熱20min，再調(diào)整培養(yǎng)皿高度于紫外燈下30cm處，打開平皿蓋，分別照射30S、45S、60S、75S、90S，誘變結(jié)束后取菌懸液涂布于氯化鋰平板培養(yǎng)基上，于26 30°C條件下倒置避光恒溫培養(yǎng)6 7d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，確定60s為紫外誘變最佳時(shí)間，此時(shí)正突變率最高，達(dá)到18. I %。(d)、誘變菌株的篩選初篩將步驟(b)和步驟(C)誘變得到的單菌落接至斜面培養(yǎng)基上，在26 30°C下培養(yǎng)6 7d后，鏟取二分之一的菌體于離心管中，用0. 5mL丙酮浸泡12 15h，然后加入0. 25mL乙酸乙酯，快速混勻，3000rpm離心lOmin，取上清液，取上清液測(cè)定各菌株浸取液中阿維菌素Bla效價(jià)，留取50%的高效價(jià)菌株上搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩將初篩篩選到的菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)后接入種子培養(yǎng)基中于26 30°C、180 220rmp搖床轉(zhuǎn)速下擴(kuò)大培養(yǎng)30 45h，以2 10% (v/v)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在26 30°C、180 240rpm搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)8 IOd下?lián)u床，取3mL發(fā)酵液于離心管中，3500rpm高速離心IOmin,棄上清液,加入甲醇至9mL,在快速混勻器上震蕩30min ；3500rpm高速離心lOmin，取上清液測(cè)定發(fā)酵液中阿維菌素Bla效價(jià)。取發(fā)酵液阿維菌素Bla效價(jià)最高的菌株作為下次誘變的出發(fā)菌株，重復(fù)步驟(a) (d)，如圖I所示。最后篩選出阿維菌素 Bla 產(chǎn)量高的目標(biāo)菌株 streptomyces avermitilis AVE07-N2-16515。步驟(b)和步驟(C)中所用的氯化鋰平板培養(yǎng)基為可溶性淀粉I. 0%，(NH4)2SO4
0.25%,NaCl 0. 05 %, MgSO4 7H20 0. 12 %, K2HPO4 3H20 0.3 %, CaCO3O. 3 %，氯化鋰
1.OmoL L—1，瓊脂粉I. 5%，pH 7. 2 7. 4，蒸餾水配置。步驟(a)及(d)中所用的斜面培養(yǎng)基為可溶性淀粉I. 0%，(NH4)2SO4O. 25%,NaCl0. 05%, MgSO4 7H20 0. 12%, K2HPO4 3H20 0. 3%, CaCO3O. 3%，瓊脂粉 I. 5%, pH 7. 2 7. 4，蒸餾水配置。步驟⑷中所用的種子培養(yǎng)基為玉米淀粉1.5%，葡萄糖1.0%，花生餅粉1.0%，黃豆餅粉 0. 8%,酵母粉 0.5%，CoCl2 6H20 0. 0003 %，淀粉酶 4u/g 淀粉，pH 7. 0 7. 2，自來(lái)水配置。步驟(d)中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米淀粉6%，葡萄糖2%，花生餅粉1.4%，黃豆餅粉I. 2%，酵母粉O. 3%, CoCl2 · 6H20 O. 0003%，淀粉酶4u/g淀粉，ρΗ7· O 7. 2，自來(lái)
水配置。實(shí)施例2 :本實(shí)施例說(shuō)明突變株的傳代穩(wěn)定性。在以葡萄糖為速效碳源、玉米淀粉為遲效碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測(cè)突變株阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515的傳代穩(wěn)定性，菌株傳代發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如表I所示表I高產(chǎn)突變菌株阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.ー種阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株，其分類命名為阿維鏈霉菌istreptomycesavermitills)AVE07_N2_16515，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)CCTCCNO M 2012094。
2.權(quán)利要求I所述的阿維菌素Bla高產(chǎn)菌株在發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素Bla中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素Bla的方法包含如下步驟 (1)、平板培養(yǎng)將阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515接種于平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26 30°C，培養(yǎng)時(shí)間為6 7d ； (2)、斜面培養(yǎng)將步驟(I)平板培養(yǎng)的阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515接種到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26 30°C，培養(yǎng)時(shí)間為6 7d ； (3)、種子培養(yǎng)將步驟(2)斜面培養(yǎng)的阿維鏈霉菌AVE07-N2-16515接種到種子培養(yǎng)基中，250mL培養(yǎng)瓶中裝液量為2(T50mL，培養(yǎng)溫度為26 30°C，18(T220rpm搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)3(T45h ； (4)、發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(3)中的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2 10%(v/v)，250mL培養(yǎng)瓶中裝液量為35 65mL，培養(yǎng)溫度為26 30°C，18(T240rpm搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)8 IOcL
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述平板培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源 O. 59Γ1. 5%、氮源 O. 19Π). 3%、無(wú)機(jī)鹽 O. 5°/Γ . 0%、瓊脂 I. 2°/Γ . 8%、其余為水，pH7.2^7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和可溶性淀粉中的ー種或兩種的混合；所述氮源為こ酸銨和硫酸銨中的ー種或兩種的混合；所述無(wú)機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽中的ー種或幾種的混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述斜面培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源 O. 59Γ1. 5%、氮源 O. 19Π). 3%、無(wú)機(jī)鹽 O. 5°/Γ . 0%、瓊脂 I. 2°/Γ . 8%、其余為水，pH7.2^7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和可溶性淀粉中的ー種或兩種的混合；所述氮源為こ酸銨和硫酸銨中的ー種或兩種的混合；所述無(wú)機(jī)鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽中的ー種或幾種的混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源2. 0% 3. 0%、氮源2. 0% 4. 0%、微量元素O. 0001% O. 0004%,淀粉酶3 5u/g淀粉，其余為水，pH 7. (Γ7. 2 ;其中所述碳源為玉米淀粉和葡萄糖中的ー種或兩種的混合；所述氮源為花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿、酵母粉和酵母膏中的ー種或幾種的混合；所述的微量元素為氯化鈷。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分碳源5. 09Γ15. 0%、氮源2. 0% 4. 0%、微量元素O. ΟΟΟΡ/ΓΟ. 0004%,淀粉酶3 5u/g淀粉，其余為水，pH 7. (Γ7. 2 ;其中所述碳源為玉米淀粉、葡萄糖和麥芽糖中的ー種或幾種的混合；所述氮源為花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿、酵母粉中的ー種或幾種的混合；所述的微量元素為氯化鈷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種阿維菌素B1a高產(chǎn)菌株，其分類命名為阿維鏈霉菌streptomycesavermitilisAVE07-N2-16515，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)CCTCC NOM2012094，本發(fā)明以低能氮離子注入-氯化鋰(N+-LiCl)復(fù)合誘變結(jié)合紫外線-氯化鋰(UV-LiCl)復(fù)合誘變，通過(guò)初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩選獲阿維菌素B1a產(chǎn)量高的菌株作為下一輪誘變的出發(fā)菌株，最終篩選出目標(biāo)菌株AVE07-N2-16515，該菌株可較大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素B1a組分并減少其他組分，且遺傳穩(wěn)定性良好。該菌株利用葡萄糖為速效碳源，玉米淀粉為遲效碳源，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)阿維菌素B1a效價(jià)可達(dá)3048μg/mL，相對(duì)于原始出發(fā)菌株AVE07提高了23.4%，可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)并大幅度提高發(fā)酵單位，具有重大的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102634471SQ201210113850
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者崔莉, 虞龍, 陳曉雙, 黃思思, 龔文靜 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)