專利名稱：H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒核酸的檢測方法，尤其涉及一種檢測H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian influenza, Al)是由Al病毒(AIV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，通常只感染鳥類，少見情況會感染豬。禽流感病毒高度針對特定物種，但在罕有情況下會跨越物種障礙感染人。按病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)抗原性的不同，可將禽流感病毒(Avian influenza vrius,AIV)分成16個(gè)H亞型和9個(gè)N亞型。由H5亞型禽流感病毒引起的高致病性禽流感(Highlypathogenic avian influenza,HPAI)近幾年愈演愈烈，馬來西亞、俄羅斯、中國、波黑、羅馬尼亞、法國、印度、埃及、德國、奧地利、伊朗、希臘、斯洛文尼亞、意大利等國相繼報(bào)道了禽流感疫情。目前，我國流行的禽流感病毒以H5亞型為主。因此，建立H5亞型禽流感病毒快速、靈敏、特異的鑒別診斷方法，可為我國禽流感的防控提供技術(shù)支持與保障。現(xiàn)有禽流感病毒檢測方法主要分為抗體檢測及抗原檢測方法?？贵w檢測方法包括血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination inhibition, HI)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(Agarosegel immunodiffusion, AGID)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked ImmunosorbentAssay, ELISA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(Complement FixationAssays, CF)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(Neuraminidase inhibitor test, NIT)以及病毒中和試驗(yàn)(Virusneutralization Test,VNT)等。抗體檢測方法因不能區(qū)分人工注射疫苗和病毒感染，故在實(shí)際中應(yīng)用價(jià)值不大，所以目前基于抗原檢測技術(shù)為AIV的主流檢測方法。針對AIV抗原檢測，經(jīng)典的金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法為雞胚病毒分離鑒定技術(shù)，該方法檢測周期長，操作步驟繁雜。常見的快速檢測方法包括ELISA和熒光RT-PCR。二者相比，ELISA檢測靈敏度較低，免疫試劑質(zhì)量穩(wěn)定性、批間重復(fù)性較差；而RT-PCR技術(shù)靈敏性高、特異性好，正越來越為人們所接受。然而，傳統(tǒng)的RT-PCR方法，一方面需經(jīng)過“高溫變性、中溫延伸、低溫退火”等溫度循環(huán)過程；另一方面，樣品處理所涉及的細(xì)胞裂解、核酸提取純化、擴(kuò)增等步驟，需要在幾個(gè)獨(dú)立的檢測區(qū)，使用兒臺(套)設(shè)備才能實(shí)現(xiàn)，因此實(shí)際應(yīng)用中存在以下缺陷(I)檢測成本較高，基層單位難以應(yīng)用；(2)不能在養(yǎng)殖場、檢疫站和臨床等場所現(xiàn)場使用，須配備專門的實(shí)驗(yàn)室，需使用具有熱循環(huán)功能的專用PCR儀；(3)操作繁瑣，檢測時(shí)間冗長(幾小時(shí)以上)，直接影響了疫情的及早發(fā)現(xiàn)與防控。進(jìn)入21世紀(jì)，日本科學(xué)家Notomi等開發(fā)出環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)技術(shù),核酸鏈通過在等溫環(huán)境中的循環(huán)置換擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對靶序列的放大，不需要PCR儀。LAMP的擴(kuò)增效率是目前最高的一種，其靈敏度比傳統(tǒng)PCR高出約2-3個(gè)數(shù)量級。擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA數(shù)量比PCR產(chǎn)物高很多，能夠達(dá)到幾個(gè)微克。然而，由于該技術(shù)太過于靈敏和產(chǎn)物量的巨大，使得LAMP極其容易被污染。I個(gè)擴(kuò)增的LAMP產(chǎn)物，往往又是同一片段的重復(fù)序列，因此，如果實(shí)驗(yàn)室一旦遭到氣溶膠污染，假陽性率會很高而且難于去除。所以，有人認(rèn)為，LAMP最終的應(yīng)用方向，應(yīng)該是不開蓋的檢測。1990年瑞士的Manz等提出微全分析O -TAS)概念,也稱之為芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on a Chip)或微流控芯片(Microfluidic Chip)技術(shù),具有自動化、集成化、便攜化等優(yōu)勢。 因此，將LAMP與y -TAS進(jìn)行系統(tǒng)集成，利用二者各自獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢，恰恰可以解決上述問題，提供一種簡便、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、自動化程度高的禽流感病毒核酸分子檢測方法，在微全分析系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)樣本的細(xì)胞裂解、核酸提取純化、核酸擴(kuò)增及檢測，全分析為程序化自動控制過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法。本發(fā)明是在微全分析系統(tǒng)上使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)包括樣本處理在內(nèi)的全分析過程，如病毒裂解、核酸提取純化、等溫?cái)U(kuò)增等步驟的全部自動化，具有敏感度高、特異性好和快速等特點(diǎn)，且價(jià)格低廉，適用于現(xiàn)場快速檢測禽流感病毒，從而克服了目前核酸分析方法操作繁雜、費(fèi)時(shí)、易于污染且須在幾個(gè)獨(dú)立的分區(qū)實(shí)驗(yàn)室完成等問題。本發(fā)明的目的是提供一種自動化、快速、簡便、靈敏且經(jīng)濟(jì)的用于檢測人或動物的分泌物、血清、尿液、氣管試子、泄腹腔試子、糞便或者組織浸提液中禽流感病毒的核酸分子等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法。本發(fā)明利用自動化程序控制的微全分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，從待測試樣中提取核酸，利用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，采用三種檢測方式(一)直接熒光目視法，在可見光下直接觀察反應(yīng)管中是否有明顯的熒光來判斷待測試樣是否含有禽流感病毒；(二)紫外光照射熒光目視法，在紫外光激發(fā)下觀察反應(yīng)管的熒光來判斷待測試樣是否含有禽流感病毒；(三)凝膠電泳法，檢測反應(yīng)產(chǎn)物是否含有特異性的梯狀條帶。本發(fā)明以人或動物的分泌物、血清、尿液、氣管試子、泄腹腔試子、糞便或者組織浸提液中核酸提取物為模板，選擇H5亞型禽流感病毒HA基因的一段高度保守片段作為靶序列，所使用的特異性6條特異性引物如表I。其中，LF和LB分別是位于FlC和F2之間，BIC和B2之間的環(huán)引物，其作用是提高擴(kuò)增效率，加快反應(yīng)速率。表I H5亞型禽流感病毒RT-LAMP弓I物序列
權(quán)利要求
1.H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法所使用的特異性6條特異性引物，LF和LB分別是位于FlC和F2之間，BIC和B2之間的環(huán)引物，其引物序列為引物名稱引物序列 Primer nameSequence (5'-3') H5-F3GGGAATTTAATACTTAGAAAGGAGA H5-B3CTTCGAAAACAGCGTACC H5-FIPATGAGAACCAGAAGTTCAGCATTAT-TAGAGAATTTAAACAGAAGATGGGA H5-BIPTAGACTTTCATGACTCAATTGTCCA-TGGCATATCCTAAGGCGTA H5-LFGTCAGACATCTAGGAATCCGTCTH5-LB_GAACTTTACGACAGGTCCGAC_
2.如權(quán)利要求I所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法,其特征在于，待測人或動物的分泌物、血清、尿液、氣管試子、泄腹腔試子、糞便或者組織浸提液等試樣的預(yù)處理，包括細(xì)胞裂解、核酸提取純化、等溫?cái)U(kuò)增均集成在微全分析系統(tǒng)(見圖I)上自動完成，該微全分析系統(tǒng)由微膜片泵(閥)驅(qū)動，通過程序控制微膜片泵(閥)的開啟與閉合實(shí)現(xiàn)微流體樣品的驅(qū)動控制。
3.如權(quán)利要求2所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法，其特征在于，檢測方法包括1)直接熒光目視法，在擴(kuò)增反應(yīng)前向體系中加入IU L鈣黃綠素作為熒光指示劑，可直接通過肉眼觀測結(jié)果，呈綠色的為陽性結(jié)果，呈較淺桔紅色的為陰性結(jié)果；2)紫外光照射熒光目視法，在紫外光下照射下，呈紅色熒光的為陽性結(jié)果，不顯色的為陰性結(jié)果；3)凝膠電泳法，有明顯梯形條帶者為陽性結(jié)果，反之為陰性結(jié)果。
4.如權(quán)利要求3所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法，其特征在于，擴(kuò)增反應(yīng)的適宜時(shí)間為30-60min,優(yōu)選時(shí)間為60min。
5.如權(quán)利要求4所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法，其特征在于，擴(kuò)增反應(yīng)的適宜溫度為60-65°C，優(yōu)選溫度為64°C。
6.如權(quán)利要求5所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法，其特征在于，擴(kuò)增反應(yīng)所使用的甜菜堿濃度為甜菜堿濃度為5-15mmol/L，優(yōu)選濃度為lOmmol/L。
7.如權(quán)利要求6所述H5亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法，其特征在于，擴(kuò)增反應(yīng)所使用的MgSO4溶液濃度為10-1 OOmmoI/L,優(yōu)選濃度為50mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測H5亞型禽流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微全分析方法，在微膜片泵(閥)驅(qū)動的微全分析系統(tǒng)(見

圖1)上，對試樣中H5亞型禽流感病毒進(jìn)行自動化預(yù)處理和核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，步驟如下1)裂解；2)核酸提取及洗脫；3)核酸擴(kuò)增。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞裂解、核酸提取純化、等溫?cái)U(kuò)增等步驟均集成在微全分析系統(tǒng)上自動完成。可用直接熒光目視法、紫外光照射熒光目視法及凝膠電泳法等進(jìn)行結(jié)果判定。與傳統(tǒng)的RT-PCR方法相比，本發(fā)明的方法檢測靈敏度可提高約103倍，檢測時(shí)間從4-5小時(shí)縮短至約1小時(shí)內(nèi)。
文檔編號C12Q1/68GK102618670SQ20121011373
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者薛強(qiáng), 鄒明強(qiáng) 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院