一種靈芝酸高產(chǎn)工程菌株kmust-FPS的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和代謝工程領(lǐng)域，通過基因工程對(duì)靈芝酸代謝途徑中的法尼 基焦磷酸合成酶（FPS )基因過表達(dá)的方法，構(gòu)建了一個(gè)靈芝酸高產(chǎn)的工程菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈芝（Ganoderma lucidum )是擔(dān)子菌綱，多孔菌科，靈芝屬真菌。靈芝真菌在 我國有20多種，包括赤芝，黃芝，紫芝，黑芝，薄蓋靈芝，樹舌等。我國應(yīng)用靈芝作為藥物已有 兩千多年的歷史。靈芝對(duì)于增強(qiáng)人體免疫力，調(diào)節(jié)血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護(hù) 肝，促進(jìn)睡眠等方面均具有顯著療效。由于其特殊的要用價(jià)值，靈芝的有效成分分析和藥理 學(xué)研究已經(jīng)引起了國際上的廣泛關(guān)注，尤其在日本、美國、韓國等國家。目前，靈芝的研究已 經(jīng)深入到了分子水平，一些專著相繼出版，從不同的角度介紹了靈芝的生物學(xué)特性、栽培技 術(shù)、藥理學(xué)作用及臨床應(yīng)用等情況。
[0003]靈芝酸是一類分子結(jié)構(gòu)中含有羧基的三萜類物質(zhì)，從結(jié)構(gòu)來看它屬于高度氧化的 羊毛留烷衍生物。自1982年Kubota T等人首次分離得到靈芝酸以來，目前已有130多種靈芝 酸被分離出來。它們多為四環(huán)三萜類化合物，含有30個(gè)碳原子，結(jié)構(gòu)中一般都有羥基，在紅 外光譜中有較強(qiáng)的羥基吸收峰。在紫外光譜中也呈現(xiàn)多個(gè)波長的特征吸收，多數(shù)是在250 nm、237 nm、365 nm處有吸收峰。靈芝酸具有許多重要的藥理活性如:抗癌，抑制小鼠肝肉瘤 (HTC )細(xì)胞的增殖;護(hù)肝，靈芝中的靈芝酸提取物能加強(qiáng)其解毒作用;抗HIV;降血壓;抗 氧化;抑制血小板凝集，抑制組胺釋放，鎮(zhèn)痛，抑制真核細(xì)胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋 白轉(zhuǎn)移酶活性和促進(jìn)體液免疫功能等作用。
[0004]法尼基焦磷酸合成酶（FPS )基因是靈芝酸合成途徑中的一個(gè)重要的基因。靈 芝酸是通過甲羥戊酸途徑合成的，這條途徑普遍存在于動(dòng)物、植物、真菌。首先甲羥戊酸經(jīng) 甲羥戊酸激酶（MVK )、甲羥戊酸5-磷酸激酶（PMK )和焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶（MDD) 三步酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為異戊二稀焦磷酸（IPP)。IPP在法尼基焦磷酸合成酶farnesyl diphosphate synthase ( FPS )的催化下轉(zhuǎn)化成法尼基焦磷酸。法尼基焦磷酸在藍(lán)稀合 成酶（SQS )的催化下合成鯊烯，然后經(jīng)過鯊烯單加氧酶(SE)的作用產(chǎn)生鯊烯2, 3-氧化 物，再經(jīng)過羊毛留醇合酶（LS )的作用產(chǎn)生羊毛留醇；最后通過不同酶的修飾作用產(chǎn)生 不同結(jié)構(gòu)的靈芝酸;靈芝酸的合成途徑如下所示：
[0005] 由于野生靈芝生長周期長，受環(huán)境因素影響大且野生靈芝資源有限，靈芝菌絲培 養(yǎng)成為生產(chǎn)活性物質(zhì)的重要方法。隨著對(duì)靈芝活性物質(zhì)需求的不斷增加，如何提高靈芝酸 的產(chǎn)量和增加靈芝的有效成分越來越引起人們的關(guān)注。液體深層發(fā)酵技術(shù)是進(jìn)行快速工業(yè) 化生產(chǎn)的重要手段。現(xiàn)在市售的靈芝酸主要是從靈芝子實(shí)體和液體深層發(fā)酵得到的菌絲體 中獲得。由于野生靈芝液體深層發(fā)酵時(shí)靈芝酸在靈芝細(xì)胞中的含量較低，分離純化也較難， 限制了對(duì)靈芝酸的活性、作用機(jī)理的研究及其廣泛應(yīng)用。近年來，基因工程與代謝工程迅速 發(fā)展，成為了現(xiàn)代分子育種的重要手段。通過分子克隆和基因拼接等分子生物學(xué)方法來改 造菌株的基因組，從而提高活性成分的含量越來越受學(xué)者們的青睞。如何從分子水平上提 高靈芝酸的產(chǎn)量是目前急需解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是解決野生型靈芝菌株自身產(chǎn)靈芝酸較低的問題，提供一種靈芝酸 高產(chǎn)菌株，該菌株為高產(chǎn)靈芝酸的靈芝（Ganoderma lucidum )工程菌kmust-FPS，已于 2015年10月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.11402。
[0007] 本發(fā)明靈芝酸高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法如下： 以PMD19-T為起始載體并使用靈芝本身的強(qiáng)啟動(dòng)子P-gpd、終止子T-sdhB、cbx基因 ，cbx 基因（具有carboxin抗性）是來自靈芝本身的抗性基因，其特點(diǎn)是在蘑菇類擔(dān)子菌的轉(zhuǎn) 化體系中同源標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化效率更高，能夠穩(wěn)定遺傳，抗性強(qiáng)。
[0008] 1、將靈芝啟動(dòng)子p-gpd與終止子T-sdhB與PMD19-T連接，將靈芝cbx抗性基因插入 到Pst I酶切位點(diǎn)，從而構(gòu)建成pJW-EXP載體;其具有靈芝的強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子，并具有靈芝 本身的抗性。
[0009] 其中擴(kuò)增靈芝強(qiáng)啟動(dòng)子P-gpd的引物序列為： P-gpd-F:5，-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3,， P-gpd-R:5 '-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG- 3 '； 擴(kuò)增靈芝sdhB基因終止子的引物序列為： T-sdhB-F: 5，-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3，， T-sdhB-R : 5'-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3'； 擴(kuò)增靈芝cbx抗性基因的引物為： cbx-F:5 '-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3 '， cbx-R:5 '-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3 '； 2、 靈芝酸合成途徑中關(guān)鍵酶法尼基焦磷酸合酶（FPS )從靈芝基因組中克?。ㄋ?用的引物為FPS-Nhe-F和FPS-Sma-R )，并插入到pJW-EXP載體中，得到pJW-EXP-tFPS載體； 引物序列為： FPS-Nhe-F:5GCTAGCATGGCCGATGCAAAGGCTCAG- 3' FPS-Sma-R:5'_ CCCGGGTCACTTCTGCCGCTTGTAGATCTTGTC- 3'； 3、 通過PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法，將pJW-EXP-tFPS轉(zhuǎn)化到野生型靈芝細(xì)胞中，以 carboxin作為抗性來篩選靈芝轉(zhuǎn)化子，在含有carboxin抗性的CYM平板上篩選出轉(zhuǎn)化子； 4、 將轉(zhuǎn)化子在carboxin抗性的CYM平板中進(jìn)行傳代培養(yǎng)； 5、 靈芝細(xì)胞的液體培養(yǎng)： PDA培養(yǎng)基（g/L ):葡萄糖10、瓊脂20、硫酸鎂1.5、磷酸二氫鉀3、維生素 B1 0.05和 制備好的土豆汁。
[0010] 土豆汁的制備方法:將200 g去皮新鮮土豆切成小塊，加入去離子水1.0 L煮沸30 min，用八層紗布過濾，取濾液，用于PDA培養(yǎng)基的配制。
[0011]種子培養(yǎng)基（g/L ):葡萄糖35、蛋白胨5、酵母膏2.5、磷酸二氫鉀1、硫酸鎂0.5和 維生素 B1 0.05。
[0012]發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L ):蛋白胨5、酵母膏5、磷酸二氫鉀1.0、硫酸鎂0.5、維生素 B1 0.05,乳糖35,起始pH 5.5。
[0013] CYM培養(yǎng)基（g/L ):葡萄糖20、麥芽糖10、酵母粉2、蛋白胨2、MgS〇4 0·5、ΚΗ2Ρ〇4 4.6、瓊脂 10。
[0014]斜面培養(yǎng):接種菌絲于土豆汁-葡萄糖-瓊脂（PDA )斜面中28 °C培養(yǎng)5-7天。 [0015] 一級(jí)種子培養(yǎng):在250 mL搖瓶中添加40 mL培養(yǎng)基和10 mL菌絲體懸液（從一支 斜面中獲得），并在30 °C，120 rpm下培養(yǎng)5天。
[0016] 二級(jí)種子培養(yǎng):在250 mL搖瓶中加入45 mL培養(yǎng)基和5 mL-級(jí)種子培養(yǎng)液（大約 500 mg DW/L，一級(jí)培養(yǎng)物用玻璃珠打碎后接種），在30°C，120 rpm下培養(yǎng)2天。
[0017] 發(fā)酵培養(yǎng):在250 mL搖瓶中加入45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基和5 mL二級(jí)種子發(fā)酵液（大約 500~600 mg DW/L，二級(jí)培養(yǎng)物用玻璃珠打碎后接種），在30°C，120 rpm下培養(yǎng)。
[0018] 6、單體靈芝酸的分離和提取 準(zhǔn)確稱取干細(xì)胞粉末100 mg，加入3 mL 70%(v/v)乙醇浸泡過夜，超聲處理3次，每次30 min。10000 rpm離心5 min后獲得上清液。在50°C烘箱中烘干。用200 yL色譜級(jí)甲醇徹底溶 解，用0.22 μπι濾膜過濾，用HPLC檢測(cè)靈芝酸單體，HPLC檢測(cè)條件為:HPLC色譜柱為C18柱 (Agilent 1200 series，5 μπι Agilent Zorbax SB-C18 column，250X4.6 mm);進(jìn)樣量 20 μΜ流速1 mL/min;流動(dòng)相A為甲醇/乙酸（100:0.5(v/v))，流動(dòng)相B為超純水，0-20 min:A 相為80%-100%等梯度洗脫;20 11^11-30 11^114相為100%洗脫;30 11^11-35 11^114相為80 %洗脫；紫外檢測(cè)波長為245 nm;洗脫時(shí)間35 min，記錄相應(yīng)的峰面積和出峰時(shí)間，按照標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)靈芝酸單體的濃度和含量。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果:通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)PS轉(zhuǎn)化子菌株產(chǎn)單體靈芝酸 GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S的含量分別是WT菌株的1.1，2.0，1.54，1.9倍。在同等情況下，使用 本發(fā)明構(gòu)建的工程菌株可以節(jié)約勞動(dòng)力，縮短生產(chǎn)周期，降低成產(chǎn)成本。因此，本高產(chǎn)菌株 可以作為生產(chǎn)靈芝酸的工程菌株，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明中靈芝基因組；圖中：G為靈芝基因組，Μ為λ-Hind III digest DNA Marker； 圖2為本發(fā)明中pJW-EXP載體結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為本發(fā)明中擴(kuò)增FPS基因的電泳圖；圖中:Μ為500bp DNA Ladder(Dye Plus)的核酸 標(biāo)準(zhǔn)品（Takara ) ;F為FPS基因； 圖4為本發(fā)明中pJW-EXP-tFPS載體結(jié)構(gòu)示意圖； 圖5為本發(fā)明中驗(yàn)證FPS陽性轉(zhuǎn)化子的電泳圖；圖中：Μ為DL2000的核酸標(biāo)準(zhǔn)品（ Takara )，Ρ為陽性對(duì)照，F(xiàn)PS為轉(zhuǎn)FPS基因的陽性轉(zhuǎn)化子，WT為野生型菌株，Ν為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本 實(shí)施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0022] 實(shí)施例1: pJW-EXP載體的構(gòu)建 1、靈芝基因組DNA的提取 稱取約0.2 g凍干野生型靈芝（CCGMC 5.0616 )的菌絲體在液氮中研磨成粉末，將 粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL經(jīng)65°C預(yù)熱的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨）抽取緩沖液中，65°C保 溫30 min，然后在4°C下，10000 g離心20 min，取上清液加等體積的氯仿：異戊醇（24:1 )的混合物，輕輕搖勾30 min以上，4 °C下、10000 g離心20 min;將上清液移入1.5 mL離心 管后，加入2/3體積經(jīng)-20 °C預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動(dòng)5 min，用玻璃棒撈出DNA后，用75%的 乙醇洗滌2-3次，