一種高產(chǎn)蛋白酶k的黑曲霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種黑曲霉，其保藏編號為CCTCC NO:M2014677。本發(fā)明通過紫外誘變方法獲得的黑曲霉突變菌mk37能夠高效表達來源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K，其發(fā)酵酶活高達7772.9U/mL，比出發(fā)菌株提高了42％。與出發(fā)菌株相比，突變菌株mk37的菌落較小、較密實，產(chǎn)孢子數(shù)量多，且菌絲分支多、短，菌絲生長更密集，更適合高密度發(fā)酵，能有效降低蛋白酶K的生產(chǎn)成本。此外，本發(fā)明所述黑曲霉突變菌mk37重組表達的蛋白酶K可廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。CCTCC NO:M20146772014.12.30
【專利說明】一種高產(chǎn)蛋白酶K的黑曲霉菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶基因工程技術(shù)和微生物誘變篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高產(chǎn)蛋白 酶K的黑曲霉菌株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶K(E.C. 3.4. 21.64)是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，是由真菌林伯 氏白色念球菌（Tritirachium album Limber)合成的胞外內(nèi)肽酶，它是具有典型催化三元 組Asp39-His69-Ser 224的絲氨酸蛋白酶類中的一員。蛋白酶K具有高于30U/mg的特異活性， 是已知的內(nèi)肽酶中最有活性的之一，并且非特異性水解天然的和變性的蛋白質(zhì)。
[0003] 蛋白酶K具有非常重要的生物學意義，具有極高的酶活性和廣泛的底物特異性， 能優(yōu)先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端鄰接的酯鍵和肽鍵，常被用 于降解蛋白生產(chǎn)短肽。成熟蛋白酶K由279個氨基酸組成，兩個二硫橋和兩個鍵合的鈣離子 使得緊密結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。所以，與其他枯草桿菌蛋白酶相比，蛋白酶K對極端pH值、高溫、離液 劑和去污劑具有高得多的穩(wěn)定性，蛋白酶K在高溫（達65°C )和寬pH范圍（ρΗ7· 5 -12. 0) 具有高穩(wěn)定性。在變性劑例如脲或SDS存在下其活性得以提高。上述性質(zhì)使得蛋白酶K在 要求非特異性蛋白質(zhì)降解的生物【技術(shù)領(lǐng)域】中具有很好的應(yīng)用，特別是從粗提取液中分離核 酸（DNA或RNA)以及在DNA分析中預(yù)制備樣品，另外蛋白酶K也可應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域， 例如結(jié)構(gòu)釋析。
[0004] 但因為林伯氏白色念球菌生長緩慢，不適合大規(guī)模發(fā)酵，而且菌體在產(chǎn)生蛋白酶K 的同時還會分泌表達其他蛋白酶，加之對林伯氏白色念球菌的基因操作比大腸桿菌、酵母 菌和枯草芽孢桿菌等常用基因工程菌困難許多，這些都給蛋白酶K的高效大規(guī)模生產(chǎn)帶來 困難。因此利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)蛋白酶K的異源重組表達是目前研宄的重點和發(fā)展趨 勢。很多科研學者對改變蛋白酶K宿主菌做了多次嘗試。Gunkel F.A.等將蛋白酶K轉(zhuǎn)入 大腸桿菌體內(nèi)，實現(xiàn)了蛋白酶K的胞內(nèi)表達，然而表達量極低，Muelle R.等構(gòu)建了蛋白酶 K的表達載體并將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母體內(nèi)，證明了蛋白酶K可以在酵母體內(nèi)表達；但還存在著 表達量難以滿足生產(chǎn)要求的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)蛋白酶K的黑曲霉菌株及其應(yīng)用，從而彌補現(xiàn)有技 術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種黑曲霉mk37 (Aspergillus niger mk37)，已于2014年 12月30日被保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2014677〇
[0007] 上述的黑曲霉mk37用于代謝合成蛋白酶K ;
[0008] 所述蛋白酶K的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。
[0009] 編碼上述蛋白酶K的基因，其一種編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
[0010] 本發(fā)明通過紫外誘變方法獲得的黑曲霉突變菌mk37能夠高效表達來源于林伯氏 白色念球菌的蛋白酶K，其發(fā)酵酶活高達7772. 9U/mL，比出發(fā)菌株提高了 42%。與出發(fā)菌 株相比，突變菌株mk37的菌落較小、較密實，產(chǎn)孢子數(shù)量多，且菌絲分支多、短，菌絲生長更 密集，更適合高密度發(fā)酵，能有效降低蛋白酶K的生產(chǎn)成本。此外，本發(fā)明所述黑曲霉突變 菌mk37重組表達的蛋白酶K可廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，經(jīng)蛋白酶K嫩化后的牦牛肉在色 澤、口感方面表現(xiàn)均優(yōu)于對照組，且肉的平均剪切力、失水率、肌纖維直徑，分別比對照組低 49. 12N/cm2、6. 21%、8. 56ym，從而說明本發(fā)明所述蛋白酶K對冷卻牦牛肉的嫩化效果顯 著。除了食品加工領(lǐng)域外，本發(fā)明所述蛋白酶K還可廣泛應(yīng)用于皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、釀 造等領(lǐng)域，均具有很好的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為突變株黑曲霉mk37與出發(fā)菌株菌落形態(tài)對比圖；
[0012] 圖2為突變株黑曲霉mk37與出發(fā)菌株菌絲形態(tài)對比圖；
[0013] 圖3為突變株黑曲霉mk37發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，箭頭所指處即為重 組表達的蛋白酶K。

【具體實施方式】
[0014] 下面結(jié)合實例對本發(fā)明的方法做進一步說明。但實例僅限于說明，并不限于此。下 列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook) 等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。
[0015] 實施例1、蛋白酶K基因的合成
[0016] 來源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K的氨基酸序列為SEQ ID NO :1，將此序列按 照黑曲霉的密碼子偏愛性翻譯成相應(yīng)的核酸序列，使其不被Xho I和Xba I兩個酶切位 點切斷，得到的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。在蛋白酶K的核苷酸序列兩端加 Xho I和Xba I酶切位點，交由上海生工生物工程有限公司進行合成，合成的蛋白酶K核苷酸序列被連 接在載體PSG-TS上，插入位點為t-a克隆，受體菌為大腸桿菌DH5a菌株。
[0017] 實施例2、蛋白酶K基因重組載體的構(gòu)建
[0018] 將連在PSG-TS載體上的蛋白酶K基因用Xho I和Xba I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠 電泳，切膠回收酶切產(chǎn)物片段，與同樣用Xho I和Xba I雙酶切并切膠回收的質(zhì)粒pGm連 接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌（E. coli)DH5a后，用氨芐青霉素進行選擇。為確保準確，對若干 克隆進行測序（Invitrogen)。
[0019] 使用質(zhì)粒小量制備試劑盒（Axygen)從測序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì) 粒。獲得1個重組質(zhì)粒，測序結(jié)果顯示獲得的DNA序列為SEQ ID NO: 2,其編碼的蛋白序列 為SEQ ID N0:1。從而說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pGm-ProK。
[0020] 其中的酶切及連接反應(yīng)均參照表1。
[0021] 表1酶切體系及連接體系
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉的保藏編號為CCTCC N0:M2014677。
2. 如權(quán)利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉是通過誘變篩選獲得的。
3. 權(quán)利要求1所述的黑曲霉在代謝合成蛋白酶K中的應(yīng)用。
4. 一種蛋白酶K，其特征在于，所述的蛋白酶K是由權(quán)利要求1所述的黑曲霉發(fā)酵制備 的。
5. 如權(quán)利要求4所述的蛋白酶K，其特征在于，所述的蛋白酶K的氨基酸序列為SEQ ID NO:1〇
6. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求5所述的蛋白酶K。
7. 如權(quán)利要求6所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
【文檔編號】C12N1/14GK104480027SQ201510003396
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2015年1月4日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月4日
【發(fā)明者】王華明, 林艷梅 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司, 中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所