專利名稱：一種基于pcr技術(shù)的花椰菜遺傳純度快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于PCR技術(shù)的花椰菜遺傳純度快速檢測方法，利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行花椰菜品種東方白雪100天種子遺傳純度的檢測。
背景技術(shù)：
花椰菜即Brasica oleraceae . var. botyris L.又稱花菜、菜花，是十字花科蕓薹屬的一種重要蔬菜，在中國、印度、意大利、歐洲、美國等世界各地有廣泛種植?；ㄒ说氖秤貌糠质怯蔁o數(shù)短縮肥壯的花枝和花蕾聚合而成，稱為“花球”?；ㄒ藸I養(yǎng)豐富，除含有蛋白質(zhì)、纖維素和各種礦物質(zhì)外，還含有多種吲哚衍生物，具有抗癌作用，近年已被列為抗癌蔬菜。近年來我國花椰菜的生產(chǎn)發(fā)展迅速，我國不僅是世界上花椰菜種植面積最大、總產(chǎn)最高的國家，也是花椰菜種植面積增長最快的國家之一，在蔬菜周年供應(yīng)中占有越來越重要的地位。目前，現(xiàn)有的許多蔬菜新品種無需審定即可推廣應(yīng)用，并且由于經(jīng)營種子的單位越來越多，種子質(zhì)量參差不齊。由于一些客觀原因，如親本不是純系、制種區(qū)生態(tài)條件復(fù)雜等，以及一些人為因素，例如假冒偽劣、坑農(nóng)害農(nóng)事件、銷售純度不合格的種子等，造成了很多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)事故與群體事件，給蔬菜生產(chǎn)者與種子銷售企業(yè)帶來嚴(yán)重的損失與極大的負(fù)面影響。在花椰菜Fl代雜種制種過程中，母本系自交的種子、外來花粉竄粉以及機(jī)械混雜產(chǎn)生的假雜種?；祀s于Fl中，嚴(yán)重影響種子的質(zhì)量和純度，給農(nóng)戶帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，給種子生產(chǎn)者、經(jīng)營者帶來索賠風(fēng)險(xiǎn)。因此，花椰菜產(chǎn)業(yè)與種業(yè)良性健康發(fā)展需要準(zhǔn)確、高效的種子遺傳純度檢測技術(shù)?！畺|方白雪100天’花椰菜是瑞安南方蔬菜種苗有限公司采用歐洲耐寒白花菜親本，利用自交不親和方法育成的雜交種品種。該品種的花椰菜具有中晚熟、抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、耐寒、植株直立、生長勢強(qiáng)，蠟粉中等、花球結(jié)白緊密、內(nèi)葉自覆性好、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，是花椰菜的理想品種。為保證優(yōu)良品種產(chǎn)生最大的經(jīng)濟(jì)效益，需要一種準(zhǔn)確、快速檢測雜交種品種的遺傳純度的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種檢測準(zhǔn)確快速、不受環(huán)境影響、多態(tài)性高的基于PCR技術(shù)的花椰菜遺傳純度快速檢測方法，這種方法可以彌補(bǔ)現(xiàn)有純度檢測工作的不足，從而為種子質(zhì)量高效控制提供重要的技術(shù)手段。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
一種基于PCR技術(shù)的花椰菜遺傳純度快速檢測方法，其特征在在于包括以下步驟
(1)提取花椰菜雜交種“東方白雪100天”幼苗葉片的基因組DNA；
(2)采用特異引物組合SREM8-1/SRodd58
正向引物 SREM8-1 GACTGCGTACGAATTCAC 和 反向引物 SRodd58 TTCTAGGTAATCCAACAACA,以基因組DNA為模板，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增；
(3)將擴(kuò)增后的DNA片段，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；
(4)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，將同時(shí)具有母本特異性標(biāo)記條帶和父本特異性標(biāo)記條帶的單株判定為真正的雜交種，缺少其中任意一個(gè)條帶記為假雜種，計(jì)算種子遺傳純度，其中
特異引物組合SREM8-1/ SRodd58產(chǎn)生大小為IlObp母本特異性標(biāo)記條帶，產(chǎn)生大小為80bp父本特異性標(biāo)記條帶。作為優(yōu)選，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)包括以下步驟
SRAP-PCR 反應(yīng)體系含基因組 10ngDNA，2. 5mmol · L^1Mg2+, O. 15mmol · L_1dNTPs,
0.5ymol · L-1 SRAP 正向引物 SREM8-1 與反向引物 SRodd58，0. 75U Taq DNA 聚合酶；
PCR擴(kuò)增程序90°C 3min ；94°C lmin，35°C lmin，72°C I. 5min，5 個(gè)循環(huán)；94°C lmin,50°C lmin，72°C I. 5min, 33 個(gè)循環(huán)；72°C 7min 延伸，10°C保存。作為優(yōu)選，所述的凝膠電泳檢測方法包括以下步驟
所述的非變性聚丙烯酰胺凝膠中含有Arc :Bis 6. 65ml、5XTBE 5ml、TEMED 20μ1、10%AP 0. 3ml，其中，Arc Bis 的質(zhì)量比為 29:1 ；
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為6. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上分離。在50 60V預(yù)電泳30min后上樣，在120V穩(wěn)壓下電泳2. 5 3. O h，電泳結(jié)束后，凝膠采用O. 5%冰醋酸、10%乙醇固定液固定12 20min ;用O. 2% AgN03溶液染色10 15 min ;洗漆后于顯影液中顯影，拍照，所述的顯影液中包括I. 5%Na0H、0. 4%甲醛和O. 002%Na2S203。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明從大量的引物中篩選出能夠在一代雜種中同時(shí)產(chǎn)生具有父、母特異標(biāo)記條帶的，而且條帶清晰、重復(fù)性好的引物特異引物組合SREM8-1與SRodd58，作為‘東方白雪100天’的遺傳純度鑒定的特征引物。本發(fā)明引物的應(yīng)用，具有準(zhǔn)確性高、結(jié)果穩(wěn)定、不受環(huán)境條件及發(fā)育時(shí)期的影響、統(tǒng)計(jì)簡便等優(yōu)點(diǎn)，可以簡單、快速、準(zhǔn)確地檢測花椰菜雜交品種‘東方白雪100天’的種子遺傳純度，有利于花椰菜種子高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制，加快了花椰菜商品種子的質(zhì)量檢測進(jìn)程。


圖I為花椰菜雜交品種‘東方白雪100天’種子遺傳純度檢測特征引物組合SREM8-l/SRodd58 的 SRAP-PCR 電泳圖譜
泳道F ‘東方白雪100天’母本；泳道厘‘東方白雪100天’父本；泳道1-22 ‘東方白雪100天’ Fl雜交種；泳道L IOObp分子量標(biāo)準(zhǔn)；箭頭表示特異性標(biāo)記條帶。
具體實(shí)施例方式一種基于PCR技術(shù)的花椰菜遺傳純度快速檢測方法，其特征在在于包括以下步驟
I、花椰菜基因組DNA的提取
(I)提取花椰菜雜交種‘東方白雪100天’幼苗的幼嫩葉片約O. 5g，經(jīng)過液氮研磨，力口Λ 500 μ I CTAB裂解液，轉(zhuǎn)入I. 5ml的離心管中，在65°C的水浴下30 50min。其中，CTAB裂解液中含有 2% 的 CTAB，2mol · L-1NaCl, 20_1 · L-1EDTA, IOOmmol · L^1Tris-HCl 與 O. 2%的β -巰基乙醇，V/V, TriS-HCl的pH值為8. O。(2)取出離心管，將離心管在16°C、12000rpm的條件下離心lOmin，取上清液，轉(zhuǎn)入新滅菌的I. 5ml的離心管中，加入與上清液等體積的氯仿異戊醇混合液，其中氯仿與異戊醇的體積比為24 :1，輕輕搖晃,在室溫、12000rmp的條件下離心lOmin。(3)取離心后的上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管中，重復(fù)步驟(2) I次，加入上清液的O. I體積的醋酸鈉，和與上清液等體積的預(yù)冷的異丙醇，緩慢翻轉(zhuǎn)5 10次，放置于冰箱內(nèi)，在_20°C下放置至少30min。(4)在4°C、12000rmp的條件下離心IOmin,倒掉上清液,用70%預(yù)冷乙醇洗漆DNA 沉積物；
(5)在4°C、12000rmp的條件下離心2 4min，倒掉上清液，干燥后加入80 μ L滅菌TE緩沖液溶解DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA后保存于4°C或_20°C備用。2、篩選純度鑒定的特征引物
(O合成用于PCR擴(kuò)增所需的SRAP引物，篩選出能夠檢測親本與雜交種之間穩(wěn)定差異位點(diǎn)的引物；即篩選出能夠在一代雜種中同時(shí)產(chǎn)生母本特異標(biāo)記條帶和父本特異標(biāo)記條帶，且?guī)颓逦?、重?fù)性好、可靠性強(qiáng)的特異引物組合SREM8-1/ SRodd58。3、PCR擴(kuò)增及分子標(biāo)記分析
利用獲得的有效特征引物對(duì)花椰菜‘東方白雪100天’幼苗基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SRAP標(biāo)記擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序?yàn)?br> SRAP-PCR 反應(yīng)體系含基因組 10ngDNA，2. 5mmol · L^1Mg2+, O. 15mmol · L_1dNTPs,
0.5ymol · L-1 SRAP 正向引物 SREM8-1 與反向引物 SRodd58，0. 75U Taq DNA 聚合酶；
PCR 擴(kuò)增程序90°C 3min ；94°C lmin, 35 °C lmin, 72 °C I. 5min，5 個(gè)循環(huán)；94 °C lmin,50°C lmin，72°C I. 5min, 33 個(gè)循環(huán)；72°C 7min 延伸，10°C保存。4、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測
擴(kuò)增產(chǎn)物采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，即PAGE。25ml凝膠中含有Arc Bis
6.65ml, 5 X TBE 5ml, TEMED 20μ1、10%ΑΡ 0.3ml ;其中 Arc 與 Bis 的質(zhì)量比為 29 :1。將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為6. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上分離。在50 60V預(yù)電泳30min后上樣，在120V穩(wěn)壓下電泳2. 5 3. O h，電泳結(jié)束后，凝膠采用O. 5%冰醋酸、10%乙醇固定液固定12 20min ;用O. 2% AgNO3溶液染色10 15 min ;洗漆后于顯影液中顯影,拍照,顯影液中包括 I. 5%Na0H、0. 4% 甲醛和 O. 002%Na2S203。5、種子遺傳純度鑒定
對(duì)花椰菜品種‘東方白雪100天’ Fl雜種幼苗基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。只有同時(shí)具有父、母本特異性標(biāo)記條帶的幼苗單株判定為真正的雜交種，只要缺失其中任何一個(gè)特異標(biāo)記的幼苗單株均判定為假雜種。如圖I所示，利用SRAP引物組合SREM8-l/SRodd58進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在雜交種中產(chǎn)生大小為IlObp的母本特異性標(biāo)記條帶和80bp父本特異性標(biāo)記條帶的幼苗單株判定為真正的雜交種。根據(jù)SRAP分子標(biāo)記特異性引物分析結(jié)果，計(jì)算種子遺傳純度(％)
供檢種子遺傳純度(％)=[(供檢種子粒數(shù)-假雜種粒數(shù))/供檢種子粒數(shù)X100%。其中，供檢種子粒數(shù)、假雜種粒數(shù)和供檢種子粒數(shù)可以通過檢測幼苗數(shù)。
其中SRAP引物代號(hào)SREM8-l/SRodd5，其含義為；“SR”代表SRAP引物，“EM8-1/ odd58”代表實(shí)驗(yàn)室SRAP引物編號(hào)。
權(quán)利要求
1.一種基于PCR技術(shù)的花椰菜遺傳純度快速檢測方法，其特征在在于包括以下步驟 (1)提取花椰菜雜交種“東方白雪100天”幼苗葉片的基因組DNA； (2)采用特異引物組合SREM8-1/SRodd58 正向引物 SREM8-1 GACTGCGTACGAATTCAC 和 反向引物 SRodd58 TTCTAGGTAATCCAACAACA, 以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)將擴(kuò)增后的DNA片段，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測； (4)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，將同時(shí)具有母本特異性標(biāo)記條帶和父本特異性標(biāo)記條帶的單株判定為真正的雜交種，缺少其中任意一個(gè)條帶記為假雜種，計(jì)算種子遺傳純度，其中 特異引物組合SREM8-1/ SRodd58產(chǎn)生大小為IlObp母本特異性標(biāo)記條帶，產(chǎn)生大小為80bp父本特異性標(biāo)記條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于PCR技術(shù)的花椰菜遺傳純度快速檢測方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)包括以下步驟 SRAP-PCR 反應(yīng)體系含基因組 10ngDNA，2. 5mmol · L^1Mg2+, O. 15mmol · L_1dNTPs,0. 5ymol · L-1 SRAP 正向引物 SREM8-1 與反向引物 SRodd58，0. 75U Taq DNA 聚合酶； PCR擴(kuò)增程序90°C 3min ；94°C lmin，35°C lmin，72°C I. 5min，5 個(gè)循環(huán)；94°C lmin,50°C lmin，72°C I. 5min, 33 個(gè)循環(huán)；72°C 7min 延伸，10°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于PCR技術(shù)的花椰菜遺傳純度快速檢測方法，其特征在于所述的凝膠電泳檢測方法包括以下步驟 所述的非變性聚丙烯酰胺凝膠中含有Arc :Bis 6. 65ml、5XTBE 5ml、TEMED 20μ1、10%AP 0.3ml ； 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為6. 0%的聚丙烯酰胺凝膠上分離，在50 60V預(yù)電泳30min后上樣，在120V穩(wěn)壓下電泳2. 5 3. O h，電泳結(jié)束后，凝膠采用O. 5%冰醋酸、10%乙醇固定液固定12 20min ;用O. 2% AgNO3溶液染色10 15 min ;洗漆后于顯影液中顯影,拍照，所述的顯影液中包括I. 5%Na0H、0. 4%甲醛和O. 002%Na2S203。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于PCR技術(shù)的花椰菜遺傳純度快速檢測方法，本發(fā)明以花椰菜雜交種‘東方白雪100天“為研究對(duì)象，開展分子標(biāo)記的篩選，鑒定出雜種中能夠同時(shí)產(chǎn)生父、母本特異條帶標(biāo)記的特異引物組合SREM8-1/SRodd58，幼苗葉片的基因組DNA。本發(fā)明引物的應(yīng)用，具有準(zhǔn)確性高、結(jié)果穩(wěn)定、不受環(huán)境條件及發(fā)育時(shí)期的影響、統(tǒng)計(jì)簡便等優(yōu)點(diǎn)，可以簡單、快速、準(zhǔn)確地檢測花椰菜雜交品種‘東方白雪100天’的種子遺傳純度，有利于花椰菜種子高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制，加快了花椰菜商品種子的質(zhì)量檢測進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102643913SQ201210110250
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者徐堅(jiān), 王燕, 許園園, 鄭岳忠 申請(qǐng)人:溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院