專利名稱：一種ems誘變花椰菜小孢子獲得抗寒dh突變體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種EMS誘變花椰菜小孢子獲得抗寒 DH (雙單倍體)突變體的方法。
背景技術(shù)：
花椰菜由于其營養(yǎng)豐富、質(zhì)地柔嫩、味道鮮美深受廣大消費者的喜愛。近年來栽培面 積和消費量增長迅速，目前花椰菜己成為國內(nèi)外蔬菜市場的重要蔬菜種類之一。我國不僅 是世界上花椰菜種植面積最大、總產(chǎn)量最高，而且也是種植面積增長最快的國家，但我國 花椰菜平均單產(chǎn)在世界上僅居第23位。我國遠離花椰菜起源中心，資源匱乏在很大程度上 限制了我國花椰菜育種研究水平的提高。因此利用高新育種技術(shù)，創(chuàng)造優(yōu)異的花椰菜種質(zhì) 資源，拓寬我國花椰菜種質(zhì)資源遺傳背景，選育出多樣性的花椰菜系列優(yōu)良品種尤為重要。
遺傳育種單位和科學家，紛紛把種質(zhì)資源創(chuàng)新作為育種工作的核心，探索先進、高效 的種質(zhì)資源創(chuàng)新技術(shù)，在短時間內(nèi)創(chuàng)造大量的優(yōu)異育種材料一直是植物遺傳育種家努力求 索的目標。游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)使植物育種學家多年的夢想成為現(xiàn)實。隨著游離小 孢子培養(yǎng)技術(shù)的日益成熟，誘變技術(shù)與游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，是近年來新興的一項
很有應用前景的研究項目。誘變技術(shù)與游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合有許多優(yōu)點游離小孢
子數(shù)量大、體積小(20pm)、誘變劑容易吸收；突變類型豐富，提高了變異頻率和擴大了 變異譜；隱性基因能于DH (雙單倍體)植株直接表達，Mi世代就可以進行性狀選擇，縮 短育種時間；篩選程序易于操作，提高選擇效率。目前使用的誘變劑主要分為物理誘變劑 和化學誘變劑兩類，化學誘變劑中EMS(甲基磺酸乙酯)的應用最為廣泛，效果最好。與其 他誘變劑相比，EMS誘變后產(chǎn)生的突變頻率高，且多為顯性突變體，易于進行突變體的篩 選。EMS誘導突變的原理是使G不再與C配對而與T配對，從而造成G : C-A : T轉(zhuǎn)換， 造成點突變。目前這種誘變劑已被廣泛應用于農(nóng)作物誘變育種當中，現(xiàn)已育成2,250個品 種。
Swanson (1989)用乙基亞硝基脈誘導甘藍型油菜小孢子，分別獲得耐Chlrosulfuron (CS， 一種除草齊IJ)株"M-37"和"P-26"，其自交后代仍保持較高水平的CS耐性，比對 照品種高10-1000倍；Barro(2001)用EMS誘變埃塞俄比亞芥小孢子，使芥酸含量發(fā)生了 廣泛變異；和江明(2003 )用EMS誘變甘藍型油菜小孢子獲得高油酸突變體。陸柳英(2007) 以EMS為誘變劑獲得了木薯抗寒突變體。
花椰菜屬于喜溫性蔬菜，抗寒能力較弱，培育抗寒能力強的花椰菜新品種，可以推遲 花椰菜的采收時間，實現(xiàn)花椰菜的周年供應。本研究利用花椰菜游離小孢子為試驗材料， 利用EMS誘變劑進行誘變，篩選抗寒性突變體，為花椰菜種質(zhì)資源創(chuàng)新和抗寒性新品種選 育提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種EMS誘變花椰菜小孢子獲得抗寒DH突變體的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下-
一種EMS誘變花椰菜小孢子獲得抗寒DH突變體的方法，包括如下步驟-
(1) 分離和純化花椰菜游離小孢子
選取長度為2.5mm 3.0mm花椰菜花蕾，水沖洗20 40 min，用體積百分濃度為60% 80%的乙醇水溶液消毒20 40 sec，再用質(zhì)量百分濃度為0.1 % HgCl2水溶液滅菌8 10min， 無菌水洗滌3 4次，瀝干水分后，加入所述花椰菜花蕾質(zhì)量2 4倍的改良B5培養(yǎng)基，碾 壓10 20sec，過50nm的篩，收集濾液，在700 1500 rpm下離心2 3 min， 棄上清液， 按lg與2.5 10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，400 700 rpm下離心2 5 min， 再按lg與2.5 10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，400 700rpm下離心2 5 min，棄上清液，沉淀物即為純凈花椰菜游離小孢子；
(2) 花椰菜游離小孢子誘變-
將所述花椰菜游離小孢子添加到改良NLN培養(yǎng)基中，再加入曱基磺酸乙酯，使甲基磺 酸乙酯在所述改良NLN培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分濃度為0. 25% 0. 5 %，在30 34'C暗處理4 10h， 800 1200 rpm，離心2 4min，用改良NLN培養(yǎng)基洗滌2 4次，棄上清，所述甲基 磺酸乙酯簡寫為EMS;
(3) 秋水仙素進行花椰菜小孢子加倍
將經(jīng)步驟(2)處理的花椰菜游離小孢子懸浮在添加有秋水仙堿的改良NLN培養(yǎng)基中， 使花椰菜游離小孢子濃度為lX106 2Xl()6個/m1, 30 34。C暗培養(yǎng)10 12h，進行小孢子 加倍，所述秋水仙堿在所述改良NLN培養(yǎng)基中的濃度為200 500mg/L;
(4) 加倍花椰菜游離小孢子培養(yǎng)和胚誘導-
將經(jīng)歩驟(3)處理的加倍花椰菜游離小孢子離心棄上清，放入添加有活性炭的改良 NLN培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，使加倍花椰菜游離小孢子濃度為IX 105 2X 1(f個/ml,密封 后置于25 32'C暗培養(yǎng)16 30h,移至20 30'C黑暗條件下靜止培養(yǎng)，當肉眼可見胚狀 體時，轉(zhuǎn)移至20 30°C， 30 70rpm振蕩暗培養(yǎng)，當胚狀體3 4mm時停止震蕩，將獲 得的胚狀體轉(zhuǎn)移至5000 100001x，16h (!—i光照下進行培養(yǎng)，胚轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中 誘導不定芽的形成，培養(yǎng)至真葉形成時，轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基上生根，當植株幼苗真葉完全 展開時，進行抗寒性篩選，所述活性炭在改良NLN培養(yǎng)基中的濃度為250-600mg/L;
(5) 抗寒性篩選-
在3'C， 72h條件篩選出花椰菜抗寒DH突變體。 .
所述改良B5培養(yǎng)基的組份為NaH2P04'H20 150mg/L ， KN03 2500 mg/L， CaCl2.2H20 150mg/L， MgS04'7H20 250 mg/L， (NH4)2S04 130 mg/L， KI 0.9 mg/L, H3B04 3.0 mg/L， MnS04.4H20 10 mg/L， ZnS04'7H20 2.0 mg/L， Na2Mo04.2H20 0.25 mg/L， CoCL2'6H20 0.025 mg/L， CuS04'5H20 0.025 mg/L， Na2-EDTA40 mg/L， FeS04.7H20 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L， 煙酸1.0mg/L，鹽酸吡哆醇1.0mg/L，鹽酸硫銨10mg/L， 110mg/L蔗糖，余量為水。
所述改良NLN培養(yǎng)基的組份為KN03 1 25mg / L， MgS04 7H20 125mg / L， KH2P04 125rag / L， Ca ( N 03 )24H20 500mg / L， Na2 EDTA 37 , 3mg / L， FeS04 . 7H20 0. 3mg/ L ， MnS04 . 4H20 25mg / L ， KI 8. 3mg / L ， H3B03 10mg / L ， ZnS044H20 10mg / L , Na2 Mo04 2H20 0 . 25rag / L ， CoCI26H20 0. 025mg / L ， CuS045H20 0 025mg / L ，肌醇lOOmg / L ，煙酸5.0mg / L，維生素B!O . 5mg / L,維生素B60 . 5mg/L， 葉酸0 . 5mg/L，生物素0 . 05mg/ L ，甘氨酸2. Omg/L，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酞胺600mg / L ，絲氨酸lOOmg / L脯氨酸200mg/L;蔗糖130mg / L，余量為水。
本發(fā)明的優(yōu)點
1本發(fā)明利用EMS誘變花椰菜小孢子獲得抗寒性突變體，豐富了花椰菜育種資源； 2本發(fā)明建立的花椰菜游離小孢子誘變和抗寒突變體篩選技術(shù)，可以明顯縮短獲得新 種質(zhì)資源的年限；
3本發(fā)明建立的花椰菜游離小孢子誘變和抗寒突變體篩選技術(shù)，同樣適用于十字花科 其他蔬菜的小孢子誘變和抗寒性突變體篩選；
4通過添加誘變劑EMS，可以明顯提高小孢子突變頻率和突變譜；
5為培育花椰菜抗寒新品種提供物質(zhì)基礎(chǔ)。


圖1為加倍花椰菜游離小孢子培養(yǎng)獲得的胚狀體。 圖2用本發(fā)明的方法獲得的抗寒DH突變體的植株。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明 實施例1
(1) 分離和純化花椰菜游離小孢子
選取長度為2.5mm 3.0mm花椰菜花蕾，此時小孢子多數(shù)處于單核靠邊期，水沖洗30 min，用體積百分濃度為70。/。的乙醇水溶液消毒30sec，再用質(zhì)量百分濃度為0.1 % HgCl2 水溶液滅菌8min ，無菌水洗滌3次，瀝干水分后，加入所述花椰菜花蕾質(zhì)量3倍的改良 Bs培養(yǎng)基，在研缽中用玻棒碾壓10sec擠出小孢子，過5(Him的篩，收集濾液，在1000rpm 下離心3min，棄上清液，按lg與5ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，500 rpm 下離心3 min，再按lg與5ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，500 rpm下離心3min， 棄上清液，沉淀物即為純凈花椰菜游離小孢子；
(2) 花椰菜游離小孢子誘變
將步驟(1)制備的花椰菜游離小孢子添加到改良NLN培養(yǎng)基中，再加入甲基磺酸乙 酯(簡寫為EMS)，使甲基磺酸乙酯在所述改良NLN培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分濃度為0.35。/D，在 32。C暗處理8h， 1000 rpm，離心3min,用改良NLN培養(yǎng)基洗滌3次，棄上清；
(3) 秋水仙素進行花椰菜小孢子加倍
將經(jīng)步驟(2)處理的花椰菜游離小孢子懸浮在添加有秋水仙堿的改良NLN培養(yǎng)基中， 使花椰菜游離小孢子濃度為1.5Xl()6個/ml，32T:暗培養(yǎng)llh,進行小孢子加倍，所述秋水仙 堿在所述改良NLN培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L;
(4) 加倍花椰菜游離小孢子培養(yǎng)和胚誘導將經(jīng)步驟(3)處理的加倍花椰菜游離小孢子離心棄上清，放入添加有活性炭的改良 NLN培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，使加倍花椰菜游離小孢子濃度為1.5Xl()5個/nil，密封后置于 3(TC暗培養(yǎng)24h，移至25'C黑暗條件下靜止培養(yǎng)，當肉眼可見胚狀體時，轉(zhuǎn)移至25'C， 50 rpm振蕩暗培養(yǎng)，當胚狀體3 4mm時停止震蕩，將獲得的胚狀體轉(zhuǎn)移至8000bc,16h d—1 光照下進行培養(yǎng)，胚轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中誘導不定芽的形成，培養(yǎng)至真葉形成時， 轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基上生根，當植株幼苗真葉完全展開時，進行抗寒性篩選，所述活性炭在 改良NLN培養(yǎng)基中的濃度為400mg/L; (5)抗寒性篩選
在3 °C ， 72h條件篩選出花椰菜抗寒DH突變體。
實施例2
(1) 分離和純化花椰菜游離小孢子
選取長度為2.5mm 3.0mm花椰菜花蕾，此時小孢子多數(shù)處于單核靠邊期，水沖洗20 min，用體積百分濃度為80%的乙醇水溶液消毒20sec，再用質(zhì)量百分濃度為0.1 % HgCl2 水溶液滅菌9min，無菌水洗滌4次，瀝干水分后，加入所述花椰菜花蕾質(zhì)量2倍的改良 Bs培養(yǎng)基，在研缽中用玻棒碾壓15sec擠出小孢子，過50pm的篩，收集濾液，在700rpm 下離心3min，棄上清液，按lg與2.5ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，400rpm 下離心5 min，再按lg與2.5ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，400 rpm下離心 5min，棄上清液，沉淀物即為純凈花椰菜游離小孢子；
(2) 將步驟(1)制備的花椰菜游離小孢子添加到改良NLN培養(yǎng)基中，再加入甲基磺 酸乙酯，使甲基磺酸乙酯在所述改良NLN培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分濃度為0. 25%，在3(TC暗處 理10h， 800 rpm，離心4min，用改良NLN培養(yǎng)基洗滌4次，棄上清；
(3) 秋水仙素進行花椰菜小孢子加倍
將經(jīng)步驟(2)處理的花椰菜游離小孢子懸浮在添加有秋水仙堿的改良NLN培養(yǎng)基中， 使花椰菜游離小孢子濃度為1Xl()6個/nil,3(rC暗培養(yǎng)12h，進行小孢子加倍，所述秋水仙 堿在所述改良NLN培養(yǎng)基中的濃度為200mg/L;
(4) 加倍花椰菜游離小孢子培養(yǎng)和胚誘導
將經(jīng)步驟(3)處理的加倍花椰菜游離小孢子離心棄上清，放入添加有活性炭的改良 NLN培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，使加倍花椰菜游離小孢子濃度為1X K)5個/ml，密封后置于32 'C暗培養(yǎng)16h，移至30 'C黑暗條件下靜止培養(yǎng)，當肉眼可見胚狀體時，轉(zhuǎn)移至3(TC，30rpm 振蕩暗培養(yǎng)，當胚狀體3 4mm時停止震蕩，將獲得的胚狀體轉(zhuǎn)移至50001x,16h cT1光照 下進行培養(yǎng)，胚轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中誘導不定芽的形成，培養(yǎng)至真葉形成時，轉(zhuǎn)移 至MS培養(yǎng)基上生根，當植株幼苗真葉完全展開時，進行抗寒性篩選，所述活性炭在改良 NLN培養(yǎng)基中的濃度為600mg/L;
(5) 抗寒性篩選
在3t:， 72h條件篩選出花椰菜抗寒DH突變體。 實施例3(1) 分離和純化花椰菜游離小孢子 選取長度為2.5mm 3.0mm花椰菜花蕾，此時小孢子多數(shù)處于單核靠邊期，水沖洗40
min，用體積百分濃度為60%的乙醇水溶液消毒40 sec，再用質(zhì)量百分濃度為0.1 % HgCl2 水溶液滅菌10min,無菌水洗滌3次，瀝干水分后，加入所述花椰菜花蕾質(zhì)量4倍的改良 Bs培養(yǎng)基，在研缽中用玻棒碾壓20sec擠出小孢子，過5(Hmi的篩，收集濾液，在1500rpm 下離心2min，棄上清液，按lg與10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，700 rpm 下離心2 min，再按lg與10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，700 rpm下離心 2min，棄上清液，沉淀物即為純凈花椰菜游離小孢子；
(2) 花椰菜游離小孢子誘變
將步驟(1)制備的花椰菜游離小孢子添加到改良NLN培養(yǎng)基中，再加入甲基磺酸乙 酯，使甲基磺酸乙酯在所述改良NLN培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分濃度為0.5y。，在34'C暗處理4h， 1200 rpm，離心2min，用改良NLN培養(yǎng)基洗滌2次，棄上清，所述甲.基磺酸乙酯簡寫為EMS;
(3) 秋水仙素進行花椰菜小孢子加倍
將經(jīng)步驟(2)處理的花椰菜游離小孢子懸浮在添加有秋水仙堿的改良NLN培養(yǎng)基中， 使花椰菜游離小孢子濃度為2Xl()6個/ml，34t:暗培養(yǎng)10h，進行小孢子加倍，所述秋水仙 堿在所述改良NLN培養(yǎng)基中的濃度為500mg/L;
(4) 加倍花椰菜游離小孢子培養(yǎng)和胚誘導
將經(jīng)步驟(3)處理的加倍花椰菜游離小孢子離心棄上清，放入添加有活性炭的改良 NLN培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，使加倍花椰菜游離小孢子濃度為2X 1(f個/ml，密封后置于25 'C暗培養(yǎng)30h，移至2(TC黑暗條件下靜止培養(yǎng)，當肉眼可見胚狀體時，轉(zhuǎn)移至2(TC， 70 rpm振蕩暗培養(yǎng)，當胚狀體3 4mm時停止震蕩，將獲得的胚狀體轉(zhuǎn)移至10000k,16h d—1 光照下進行培養(yǎng)，胚轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中誘導不定芽的形成，培養(yǎng)至真葉形成時， 轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基上生根，當植株幼苗真葉完全展開時，進行抗寒性篩選，所述活性炭在 改良NLN培養(yǎng)基中的濃度為250mg/L;
(5) 抗寒性篩選
在3i:， 72h條件篩選出花椰菜抗寒DH突變體。 抗寒性篩選和游離脯氨酸含量測定
依據(jù)花椰菜在低于5"C氣候條件下受凍害的特點，以3'C， 72d低溫條件篩選經(jīng)誘變劑 處理而獲得的DH植株，共篩選出4份抗寒DH突變體。對篩選到的DH抗寒突變植株采 用酸性茚三酮法測定游離脯氨酸含量，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體游離脯氨酸的含量介于 20-33%之間，
與不抗寒花椰菜資源游離脯氨酸含量差異顯著。
實施例4
改良B5培養(yǎng)基的組份為NaH2P04'H20 150mg/L ， KN03 2500 mg/L， CaCl2'2H20 150 mg/L， MgS047H20 250 mg/L， (NH4)2S04 130 mg/L, KI 0.9 mg/L， H3B04 3.0 mg/L， MnS04.4H20 10 mg/L, ZnS04.7H20 2.0 mg/L， Na2Mo04.2H20 0.25 mg/L， CoCL26H20 0.025mg/L， CuS04.5H20 0.025 mg/L， Na2-EDTA40 mg/L， FeS04-7H20 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L， 煙酸1.0mg/L，鹽酸吡哆醇1.0mg/L，鹽酸硫銨10mg/L， 110mg/L蔗糖，余量為水。
實施例5
改良NLN培養(yǎng)基的組份為KN03 1 25mg / L， MgS04 7H力125mg / L， KH2P04 125呢 / L， Ca ( N 03 )2 4H20 5 00mg / L， Na2 EDTA 37 . 3mg / L, FeS04 . 7H20 0. 3mg / L ， MnS04 . 4H20 25mg / L , KI 8. 3mg / L , H3B03 10mg / L , ZnS04 4H20 10mg / L , Na2 Mo04 2H20 0 . 25mg / L ， CoCI2 6H20 0 . 02 5mg / L ， CuS04 5H20 0 . 02 5mg / L ， 肌醇lOOmg / L ，煙酸5. Omg / L，維生素B,O . 5mg / L，維生素B60 . 5mg/L，葉酸0 . 5呢/L，生物素0 05mg/ L ，甘氨酸2. Omg/L，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酞胺600mg / L ， 絲氨酸lOOmg / L脯氨酸200mg/L;蔗糖130mg / L，余量為水。
權(quán)利要求
1. 一種EMS誘變花椰菜小孢子獲得抗寒DH突變體的方法，其特征是包括如下步驟(1)分離和純化花椰菜游離小孢子選取長度為2. 5mm～3.0mm花椰菜花蕾，水沖洗20～40min，用體積百分濃度為60％～80％的乙醇水溶液消毒20～40sec，再用質(zhì)量百分濃度為0.1％HgCl2水溶液滅菌8～10min，無菌水洗滌3～4次，瀝干水分后，加入所述花椰菜花蕾質(zhì)量2～4倍的改良B5培養(yǎng)基，碾壓10～20sec，過50μm的篩，收集濾液，在700～1500rpm下離心2～3min，棄上清液，按1g與2.5～10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，400～700rpm下離心2～5min，再按1g與2.5～10ml的比例，向沉淀物中加入改良B5培養(yǎng)基，400～700rpm下離心2～5min，棄上清液，沉淀物即為純凈花椰菜游離小孢子；(2)花椰菜游離小孢子誘變將所述花椰菜游離小孢子添加到改良NLN培養(yǎng)基中，再加入甲基磺酸乙酯，使甲基磺酸乙酯在所述改良NLN培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分濃度為0.25％～0.5％，在30～34℃暗處理4～10h，800～1200rpm，離心2～4min，用改良NLN培養(yǎng)基洗滌2～4次，棄上清，所述甲基磺酸乙酯簡寫為EMS；(3)秋水仙素進行花椰菜小孢子加倍將經(jīng)步驟(2)處理的花椰菜游離小孢子懸浮在添加有秋水仙堿的改良NLN培養(yǎng)基中，使花椰菜游離小孢子濃度為1×106～2×106個/ml，30～34℃暗培養(yǎng)10～12h，進行小孢子加倍，所述秋水仙堿在所述改良NLN培養(yǎng)基中的濃度為200～500mg/L；(4)加倍花椰菜游離小孢子培養(yǎng)和胚誘導將經(jīng)步驟(3)處理的加倍花椰菜游離小孢子離心棄上清，放入添加有活性炭的改良NLN培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，使加倍花椰菜游離小孢子濃度為1×105～2×105個/ml，密封后置于25～32℃暗培養(yǎng)16～30h，移至20～30℃黑暗條件下靜止培養(yǎng)，當肉眼可見胚狀體時，轉(zhuǎn)移至20～30℃，30～70rpm振蕩暗培養(yǎng)，當胚狀體3～4mm時停止震蕩，將獲得的胚狀體轉(zhuǎn)移至5000～100001x，16h·d-1光照下進行培養(yǎng)，胚轉(zhuǎn)綠后轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中誘導不定芽的形成，培養(yǎng)至真葉形成時，轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基上生根，當植株幼苗真葉完全展開時，進行抗寒性篩選，所述活性炭在改良NLN培養(yǎng)基中的濃度為250-600mg/L；(5)抗寒性篩選在3℃，72h條件篩選出花椰菜抗寒DH突變體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種EMS誘變花椰菜小孢子獲得抗寒DH突變體的方法，其特征 是所述改良B5培養(yǎng)基的組份為NaH2P(VH20 150mg/L ，KN03 2500mg/L，CaClr2H20 150 mg/L， MgS04.7H20 250 mg/L, (NH4)2S。4 130 mg/L, KI 0.9 mg/L， H3B04 3.0 mg/L， MnS04'4H20 10 mg/L， ZnS04'7H20 2.0 mg/L， Na2Mo04'2H20 0.25 mg/L， CoCL2'6H20 0.025 mg/L， CuS04'5H20 0.025 mg/L， Na2-EDTA40 mg/L， FeS04'7H20 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L， 煙酸1.0mg/L，鹽酸吡哆醇1.0mg/L，鹽酸硫銨10mg/L， 110mg/L蔗糖，余量為水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種EMS誘變花椰菜小孢子獲得抗寒DH突變體的方法，其特征 是所述改良NLN培養(yǎng)基的組份為KN03 1 25mg/L， MgS04 , 7H20 125mg/L， KH2PCU25mg / L， Ca ( N 03 )2 4H20 5 00mg / L， Na2 EDTA 37 . 3mg / L， FeS04 . 7H20 0. 3mg / L ，MnS04 . 4H20 25mg / L , KI 8. 3mg / L , H3B03 10mg / L ， ZnS04 4H20 10mg / L , Na2 Mo04 2H20 0 . 25mg / L ， CoCI2 6H20 0. 02 5mg / L , CuS04 5H20 0 025mg / L ， 肌醇lOOmg / L ，煙酸5. Omg / L ，維生素. 5mg / L ，維生素B60 . 5mg/L，葉 酸0 . 5mg/L，生物素0 . 05mg/ L ，甘氨酸2. Omg/L，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酞胺600mg / L ，絲氨酸lOOmg / L脯氨酸200mg/L;蔗糖130mg / L，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種EMS誘變花椰菜小孢子獲得抗寒DH突變體的方法，包括如下步驟(1)分離和純化花椰菜游離小孢子；(2)花椰菜游離小孢子誘變；(3)秋水仙素進行花椰菜小孢子加倍；(4)加倍花椰菜游離小孢子培養(yǎng)和胚誘導；(5)抗寒性篩選；本發(fā)明利用EMS誘變花椰菜小孢子獲得抗寒性突變體，豐富了花椰菜育種資源；建立的花椰菜游離小孢子誘變和抗寒突變體篩選技術(shù)，可以明顯縮短獲得新種質(zhì)資源的年限；本發(fā)明同樣適用于十字花科其他蔬菜的小孢子誘變和抗寒性突變體篩選；通過添加誘變劑EMS，可以明顯提高小孢子突變頻率和突變譜；為培育花椰菜抗寒新品種提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號A01H1/06GK101449657SQ20081015470
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者佟志強, 劉莉莉, 姚星偉, 孫德嶺, 張寶珍, 文正華 申請人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司