專利名稱：一種利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)epa的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微藻領域，確切地說是指ー種利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)EPA的方法。
背景技術：
二十碳五烯酸(ΕΡΑ，ω-3)是ー種多不飽和脂肪酸，它具有諸多的生物學活性，受到人們的廣泛關注。最早發(fā)現(xiàn)EPA對人類健康有益的學者是丹麥的Bang和Dyerbery (1978)，隨后，眾多科學家對EPA在營養(yǎng)學和醫(yī)學上的功能展開了深入的研究，發(fā)現(xiàn)EPA是前列腺素及衍生物前列環(huán)素、凝血烷、白三烯等激素類化合物的前體，具有抗血栓、降血脂、防止血小板聚結、舒張血管等功能，并對人類心腦血疾病、關節(jié)炎、腎炎等疾病有良好的防治作用，此外，EPA還能促進腦細胞的生長發(fā)育改善大腦機能，但陸生生物中EPA含量較少，天然EPA通常在海洋生物中較為豐富，如藻類、海生魚類、某些海洋軟體動物、棘皮動物等。目前，市場上的EPA產(chǎn)品主要來源于深海魚油，然而其產(chǎn)量僅能滿足世界需求量的60%，并且從魚油中提取EPA的エ藝復雜且收率低，獲得的EPA具有明顯的魚腥味，難以滿足人們對產(chǎn)品的要求。微藻是ー類系統(tǒng)發(fā)生各異、個體較小、通常為單細胞或群體的、能進行光合作用的水生(或陸生、氣生、共生)低等植物，是自然界起源最早、分布最廣、種類和數(shù)量最多的生物質資源。在已分離的產(chǎn)油的微藻中，金藻綱(Chrysophyceae)、黃藻綱(Xanthophyceae)、娃藻綱(Centricae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、綠藻綱(Chlorophyceae)和隱藻綱(Cryptophyceae)中都有富含EPA的藻類，如紫球藻(Porphyridium cruentum)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、眼點擬微綠球藻(Nannochloropsis oculata)、蒜頭藻(Monodus subterraneus)等。目前世界上許多學者已經(jīng)對微藻生產(chǎn)EPA進行了大量的研究工作，主要涉及藻株篩選、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化、規(guī)?；a(chǎn)等，然而目前大部分研究工作僅關注微藻是否具有較高的EPA含量，卻忽略了該藻株的生物量產(chǎn)量，如將其用于EPA的商業(yè)化生產(chǎn)，很難獲得成功。國內利用微生物進行EPA生產(chǎn)的發(fā)明專利共四項，它們分別是1)產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的腐霉及該油脂的發(fā)酵制備方法(余龍江，CN101434908A)，該專利公開了ー種利用腐霉(Pythium sp.)HUST-RBB12菌種進行EPA生產(chǎn)的方式，其EPA產(chǎn)量可達2. lg/L ；2)從緑色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯的方法(劉志禮，CN1544413A)，該專利主要保護由緑色巴夫藻中提取EPA的化學工藝；3) —種高產(chǎn)二十碳五烯酸(EPA)的希瓦氏菌基因工程菌(王風平，CN101942409A) ；4)用于高水平生產(chǎn)二十碳五烯酸的優(yōu)化解脂耶氏酵母菌株(納幕爾杜邦公司，CN101970638A)。國外對于微藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸(PUFAs)同樣進行了大量的研究工作，目前也有幾家公司已經(jīng)實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，如Martek公司利用Nitzschia alba 進行 EPA 的生產(chǎn)，Omega Tech 公司利用 Thtanstochytrids sp.進行 PUFAs的生產(chǎn)，Nilssin Oilssin Oil mills 公司利用 Crythecodinium cohnii 進行 DHA 的生產(chǎn)。從深海魚油中提取或通過微生物厭氧發(fā)酵的方式生產(chǎn)EPA，雖然已經(jīng)實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，然而就技木本身而言，仍然存在下述缺點
I)魚油的質量會受魚的種類、捕魚季節(jié)和地點影響；環(huán)境污染、非目的脂肪酸及魚腥味也會影響魚油的質量；另外，魚油還具有加工成本高、易氧化等缺點，隨著漁業(yè)資源的日益緊張，魚油將很難滿 足人們對EPA的市場需求；2)目前已分離的富含EPA的厭氧微生物種類較少，厭氧微生物生長需要豐富的培養(yǎng)基，且培養(yǎng)過程中容易受到細菌的污染，需要嚴格控制無菌化操作，増加了培養(yǎng)成本，新發(fā)現(xiàn)的生產(chǎn)EPA的厭氧微生物需要進行詳細安全性評價；國外雖然有部分企業(yè)利用微藻進行EPA的生產(chǎn),但其所用藻株(Nitzschia alba)需要進行異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)エ藝復雜。

發(fā)明內容
針對上述缺陷，本發(fā)明解決的技術問題在于提供ー種利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)EPA的方法，可以實現(xiàn)EPA的高效生產(chǎn)。為了解決以上的技術問題，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)EPA的方法，其中類波氏真眼點藻的營養(yǎng)條件(I)NaNO3300-1500mg/L 或 NH2-CO-NH2 150-750mg/L ； (2) K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ； (3) MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ； (4) CaCl2 · 2H20 30_50mg/L ； (5)NaCO3 10-30mg/L ； (6)FeCl3 · 6H20 2_6mg/L ； (7)Citric acid 4_8mg/L ； (8)EDTANa22-5mg/L ； (9) H3BO3 2_4mg/L ; (IO)MnCl2 · 4H20 ト2mg/L ; (I I) ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ；Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ； (13) Co (NO3)2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ； (H)CuSO4 · 5H200.06-0. 09mg/L ；類波氏真眼點藻的生長溫度為15-30°C，光照強度為30-600yE/m2s，類波氏真眼點藻擴大培養(yǎng)過程如下I)由藻種保藏室獲得藻種后，將獲得的藻種置于500mL培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)3-5天，然后轉移至IOOOml的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)靜置培養(yǎng)3-5天，待藻液光密度OD75tl達到I. 5后，進行第二步操作；2)轉移“步驟I”中的藻株至柱狀光生物反應器中通氣培養(yǎng)，通入氣體中ニ氧化碳濃度為1_5%，培養(yǎng)光強為150-200 μ E/m2s。3)在“步驟2”的基礎上將藻株繼續(xù)進行放大培養(yǎng)，并按接種比例20-30%，計算所
需藻液的量；4)待藻液光密度OD75tl達到2. 5后,轉入室外光生物反應器中進行規(guī)?；B(yǎng)埴；5)規(guī)?；B(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2_6mM，控制培養(yǎng)光強為100-600 μ E/m2s,培養(yǎng)周期 8-12 天。優(yōu)選地，在“步驟I”中，由藻種保藏室獲得藻種后，先利用顯微鏡觀察藻株是否被其他微藻、原生動物或真菌污染，再進行培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)EPA的方法具有以下優(yōu)點首先，類波氏真眼點藻在正常培養(yǎng)條件下的生物量可達8. Og/L以上，對它進行脅迫培養(yǎng)后，其總脂含量可占細胞干重的66% (大多為三酰甘油TAG)，脂肪酸組成分析發(fā)現(xiàn)，類波氏真眼點藻含有占細胞總脂肪酸含量8. 6%的EPA ；
其次，類波氏真眼點藻細胞結構簡單，可以通過改變環(huán)境條件或進行相關基因的定向改造實現(xiàn)EPA的高產(chǎn)第三，利用光生物反應器可以實現(xiàn)類波氏真眼點藻的規(guī)?；B(yǎng)殖，可以減少季節(jié)和地域限制；第四，從類波氏真眼點藻中提取EPA的エ藝較魚油中提取更為簡單，并且EPA產(chǎn)品
無臭腥味。


圖I類波氏真眼點藻的細胞形態(tài)；圖2為類波氏真眼點藻的生長曲線；圖3類波氏真眼點藻細胞中性脂、糖脂和磷脂含量的時相變化；圖4為類波氏真眼點藻細胞中脂肪酸組成和各組分百分含量。
具體實施例方式為了本領域的技術人員能夠更好地理解本發(fā)明所提供的技術方案，下面結合具體實施例進行闡述。本發(fā)明提供了ー種利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)EPA的方法，該微藻拉丁名稱為類波氏真眼點藻(Eustigmatoscf. polyphem),已于2011年9月13日在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”保藏成功；地址中國科學院微生物研究所菌種保藏中心；菌種保藏號CGMCCNo. 5247。類波氏真眼點藻屬于真眼點藻綱(Eustigmatophyceae)、真眼點藻目(Eustigmatales)、真眼點藻科(Eustigmataceae)、真眼點藻屬(Eustigmatos),細胞為球形或近球形，大小通常在10-11 μ m,培養(yǎng)過程中一些細胞會達到20-35 μ m,細胞中具有一個相對較大的、近球形的液泡，其中含有能振動的顆粒物和ー個直徑在3-5 μ m的色素體，它的顏色從灰黃-褐色到紅褐色變化，隨著培養(yǎng)時間的延長會變大變暗；細胞中有一周生深裂狀葉綠體；繁殖方式通常形成2個D形或4個四方體的似親孢子，或形成8到16個球形細胞，藻細胞主要色素組成為葉綠素a、堇菜黃素、無隔藻黃素、β-類胡蘿卜素。圖I為類波氏真眼點藻(Eustigmatoscf. polyphem)細胞形態(tài),其中A為對數(shù)前期的營養(yǎng)細胞為個體較大的細胞，具分裂葉的邊緣葉綠體，細胞中具明顯的紅色色素區(qū)及可振動的顆粒；C為個體較大的細胞，色素區(qū)變?yōu)榘导t；D為個體較大的細胞，葉綠體片段化，細胞中積累較多的類胡蘿卜素；E為個體較大的細胞，暗紅色素分布整個細胞，并有油體形成；F為個體較大的細胞，細胞形成了許多的油體。類波氏真眼點藻在正常培養(yǎng)條件下的生物量可達8. Og/L以上(圖2)，對其進行脅迫培養(yǎng)后，其總脂含量可占細胞干重的66%(大多為三酰甘油TAG)(圖3)，進行脂肪酸組成分析發(fā)現(xiàn)細胞內EPA含量可占總脂肪酸的8.6% (圖4)，是ー株非常有潛力的EPA生產(chǎn)藻株。通過大量的研究工作，我們提出一種通過氮源及氮濃度的調控方式，實現(xiàn)類波氏真眼點藻高產(chǎn)EPA的培養(yǎng)技木。類波氏真眼點藻可以利用的氮源形式有多種，如尿素、硝酸鈉/硝酸鉀、氯化銨等，在這些氮源形式中，尿素對類波氏真眼點藻的生長最有利，隨后的尿素濃度優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn)，低尿素濃度可以獲得較高的EPA產(chǎn)率，因此我們提出一種較優(yōu)的類波氏真眼點藻培養(yǎng)方案，選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強為 100-600 μ E/m2s，培養(yǎng)周期 8-12 天。本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點藻 生產(chǎn)EPA的方法，其中類波氏真眼點藻的營養(yǎng)條件(I)NaNO3300-1500mg/L 或 NH2-CO-NH2 150_750mg/L ； (2) K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ； (3) MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ； (4) CaCl2 · 2H20 30_50mg/L ； (5)NaCO3 10-30mg/L ； (6)FeCl3 · 6H20 2_6mg/L ； (7)Citric acid 4_8mg/L ； (8)EDTANa22-5mg/L ； (9) H3BO3 2_4mg/L ; (IO)MnCl2 · 4H20 ト2mg/L ; (I I) ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ；(12) Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ； (13) Co (NO3)2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ； (H)CuSO4 · 5H200.06-0. 09mg/L ；類波氏真眼點藻的生長溫度為15-30°C，光照強度為30-600yE/m2s，類波氏真眼點藻擴大培養(yǎng)過程如下I)由藻種保藏室獲得藻種后，將獲得的藻種置于500mL培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)3-5天，然后轉移至IOOOml的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)靜置培養(yǎng)3-5天，待藻液光密度OD75tl達到I. 5后，進行第二步操作；2)轉移“步驟I”中的藻株至柱狀光生物反應器中通氣培養(yǎng)，通入氣體中ニ氧化碳濃度為1_5%，培養(yǎng)光強為150-200 μ E/m2s。3)在“步驟2”的基礎上將藻株繼續(xù)進行放大培養(yǎng)，并按接種比例20-30 %，計算所
需藻液的量；4)待藻液光密度OD75tl達到2. 5后，轉入室外光生物反應器中進行規(guī)模化養(yǎng)殖；5)選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2_6mM，控制培養(yǎng)光強為100-600 μ E/m2s，培養(yǎng)周期8-12天。在“步驟I”中，由藻種保藏室獲得藻種后，先利用顯微鏡觀察藻株是否被其他微藻、原生動物或真菌污染，再進行培養(yǎng)。通過優(yōu)化培養(yǎng)體系中氮源濃度和光照強度可以實現(xiàn)EPA的高產(chǎn)，設置高、低兩種光照強度和三種氮源濃度進行試驗，試驗結果如下表所示不同光強及氮濃度條件下類波氏真眼點藻細胞的脂肪酸組成表
權利要求
1.ー種利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)EPA的方法，其特征在于，其中 類波氏真眼點藻的營養(yǎng)條件(I)NaNO3 300-1500mg/L 或 NH2-CO-NH2 150-750mg/L ；(2) K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ； (3) MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ； (4) CaCl2 · 2H20 30_50mg/L ；(5)NaCO3 10-30mg/L ； (6)FeCl3· 6H20 2_6mg/L ； (7)Citric acid 4_8mg/L ； (8)EDTANa22-5mg/L ； (9) H3BO3 2_4mg/L ; (IO)MnCl2 · 4H20 ト2mg/L ; (I I) ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ；(12) Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ； (13) Co (NO3)2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ； (H)CuSO4 · 5H200.06-0. 09mg/L ； 類波氏真眼點藻的生長溫度為15-30°C，光照強度為30-600yE/m2s，類波氏真眼點藻擴大培養(yǎng)過程如下 1)由藻種保藏室獲得藻種后，將獲得的藻種置于500mL培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)3-5天，然后轉移至IOOOml的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)靜置培養(yǎng)3-5天，待藻液光密度OD75tl達到I. 5后，進行第二步操作； 2)轉移“步驟I”中的藻株至柱狀光生物反應器中通氣培養(yǎng)，通入氣體中ニ氧化碳濃度為 1_5%，培養(yǎng)光強為 150-200 μ E/m2s。
3)在“步驟2”的基礎上將藻株繼續(xù)進行放大培養(yǎng)，并按接種比例20-30%，計算所需藻液的量； 4)待藻液光密度OD75tl達到2.5時,轉入戶外光生物反應器中進行規(guī)?；B(yǎng)埴； 5)規(guī)?；B(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強為100-600 μ E/m2s,培養(yǎng)周期 8-12 天。
2.根據(jù)權利要求I所述的利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)EPA的方法，其特征在于，在“步驟I”中，由藻種保藏室獲得藻種后，先利用顯微鏡觀察藻株是否被其他微藻、原生動物或真菌污染，再進行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)EPA的方法，藻株逐步放大培養(yǎng)后，并按接種比例20-30％，計算所需藻液的量；待藻液光密度OD750達到2.5時，轉入戶外光生物反應器中進行規(guī)?；B(yǎng)殖；規(guī)?；B(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強為100-600μE/m2s，培養(yǎng)周期8-12天。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點藻生產(chǎn)EPA的方法，可以實現(xiàn)EPA的高效生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/89GK102618592SQ201210109898
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權日2012年4月13日
發(fā)明者萬凌琳, 吳洪, 張成武, 李濤, 李愛芬 申請人:暨南大學