專利名稱：瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴(kuò)增檢測用引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明“瓜類果斑病菌交叉弓I物恒溫擴(kuò)增檢測用弓I物及方法”，專用于檢測瓜類果斑病菌,屬于植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域,涉及生物檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
瓜類果斑病自1989年在美國的西瓜種植區(qū)被發(fā)現(xiàn)后，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。瓜類果斑病病原為Acidovorax citrulli,是我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物，可通過種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。其主要寄主包括西瓜、甜瓜、哈密瓜、西葫蘆等葫蘆科作物，染菌種子是疫情爆發(fā)的主要原因?？刂撇『Πl(fā)生的最佳途徑是種植健康的種子。該病菌的檢測方法主要有種植觀察、分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附法、實(shí)時熒光PCR等。但以上檢測手段存在著操作過程耗時長、儀器配置昂貴等不利于在基層單位推廣的制 約因素。根據(jù)瓜類果斑病菌16S rDNA序列設(shè)計(jì)了 5條引物，建立了瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)，反應(yīng)結(jié)束后利用封閉式的膠體金標(biāo)記DNA檢測裝置進(jìn)行結(jié)果判定。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供用于瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴(kuò)增檢測用引物序列及方法，以達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢測瓜類果斑病菌的目的。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明通過分析已報道的瓜類果斑病菌16S rDNA序列(GenBankAY702093. I)分別設(shè)計(jì)了 5條引物。經(jīng)過一步恒溫擴(kuò)增后,擴(kuò)增產(chǎn)物通過商品化一次性全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置進(jìn)行結(jié)果判讀，即可判斷檢測樣品中是否含有瓜類果斑病菌。技術(shù)方案本發(fā)明涉的瓜類果斑病菌交叉引物恒溫擴(kuò)增檢測方法包括如下步驟I)用于檢測瓜類果斑病菌的樣品制備利用商業(yè)化植物DNA提取試劑盒提取樣品總DNA或通過分離得到細(xì)菌菌液為模板。2)用于檢測瓜類果斑病菌的一套交叉擴(kuò)增引物本發(fā)明通過分析已報道瓜類果斑病菌16S rDNA序列，分別設(shè)計(jì)了 5條引物，其核苷酸序列如下ACLF3 :5’ -GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB3 :5， -ACGCATTTCACTGCTACA-3’ACLBIP :5’ -CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’ACDF5bl :5’ -GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f2 5，-CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3，
其中引物ACDF5bI的5端生物素標(biāo)記，引物ACDF5f2的5端FITC標(biāo)記。3)恒溫擴(kuò)增的反應(yīng)體系20 u I的反應(yīng)體系中包含0. 8iimol/L交叉引物ACLBIP ；0. lymol/L正向檢測弓I物ACDF5bl (5端生物素標(biāo)記),0. 3 u mol/L反向檢測弓I物ACDF5f2 (5端FITC標(biāo)記)，各
0.liimol/L 的兩條置換引物 ACLF3 和 ACLB3，0.4mmol/L dNTP,2u I IOX 反應(yīng)緩沖液；8 個單位的Bst DNA聚合酶，2mmol/L MgSO4,以及4 yl的目標(biāo)DNA。4)恒溫擴(kuò)增程序擴(kuò)增反應(yīng)為63 °C，60min。5)擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果判讀擴(kuò)增產(chǎn)物通過商品化一次性全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置進(jìn)行結(jié)果判讀。通過觀察試紙條的檢測條帶和質(zhì)控條帶的顯色與否進(jìn)行結(jié)果判讀。


圖I運(yùn)用交叉引物恒溫擴(kuò)增檢測瓜類果斑病菌靈敏度的測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(I :3. 7X105cfu/ml,2 :3. 7X 104cfu/ml, 3 :3. 7X 103cfu/ml,4 :空白對照)。圖2運(yùn)用交叉引物恒溫擴(kuò)增技術(shù)對西瓜種子中瓜類果斑病菌檢測的代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1-6為帶菌西瓜種子檢測結(jié)果，7為空白對照)。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)瓜類果斑病病菌16S rDNA序列設(shè)計(jì)了 5條引物，引物序列為ACLF3 :5’ -GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB3 :5’ -ACGCATTTCACTGCTACA-3’ACLBIP :5，-CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3，ACDF5bl :5’ -GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f2 :5， -CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3，其中ACLF3和ACLB3為置換引物，ACLBIP為交叉引物，ACDF5bl為正向檢測引物，5端生物素標(biāo)記，A⑶F5f2為反向檢測引物，5端FITC標(biāo)記。實(shí)施例2交叉引物擴(kuò)增方法的建立以商業(yè)化植物DNA提取試劑盒提取的樣品總DNA或分離得到細(xì)菌菌液為模板，20iil的反應(yīng)體系中包含0. 8 ii mol/L交叉引物ACLBIP ；0. I U mol/L正向檢測引物ACDF5bl，0. 3iimol/L反向檢測引物ACDF5f2，各0. I u mol/L的兩條置換引物ACLF3和ACLB3,0. 4mmol/L dNTP,2u I 10 X 反應(yīng)緩沖液；8 個單位的 Bst DNA 聚合酶，2mmol/LMgSO4,以及4iil的目標(biāo)DNA。擴(kuò)增反應(yīng)為63V，60min,隨后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物通過商品化一次性全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置進(jìn)行結(jié)果判讀。通過觀察試紙條的檢測條帶和質(zhì)控條帶的顯色與否進(jìn)行結(jié)果判讀。如果檢測條帶和質(zhì)控條帶均顯色，結(jié)果為陽性；只有質(zhì)控條帶沒有檢測條帶，結(jié)果為陰性。當(dāng)質(zhì)控條帶沒有顯色時，判斷檢測過程有誤。
實(shí)施例3交叉引物擴(kuò)增方法靈敏度確定經(jīng)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)定量的瓜類果斑病菌菌懸液進(jìn)行十倍梯度稀釋，取2 Ul各梯度的細(xì)菌純培養(yǎng)物作為反應(yīng)模板，對該方法的檢測靈敏度進(jìn)行測試，經(jīng)測試，所測試的3. 7X 102cfu/ml濃度以上菌液可以觀察到檢測條帶及質(zhì)控條帶,而3. 7X 102cfu/ml濃度以下只有質(zhì)控條，故判定該方法的靈敏度為3. 7 X 102CfU/ml，因每個反應(yīng)中加入2 yl，經(jīng)換算最低靈敏度為7. 4個細(xì)菌。 實(shí)施例4特異性檢測對18株瓜類果斑病菌進(jìn)行檢測，所有菌株均為陽性結(jié)果，以下列10株其他種屬的植物病原菌為對照菌，測試該方法的特異性。包括魔芋細(xì)菌性葉斑病菌(Acidovoraxkonjaci)、番石槽歐文氏菌(Erwinia psidii)、亞洲梨火疫病菌(Erwinia pyrifoliae)、楊樹枯萎病菌(Bnterobacter cancerogenus)、洋蔥腐爛病菌(Burkholderia gladiolipv. alliicola)、核果樹細(xì)菌性潰瘍病菌(Pseudomonas syringae pv. morsprunorum)、辣 椒斑點(diǎn)病菌(Xanthomonas vesicatoria)、放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、玉米細(xì)菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp. stewartii)、番爺潰瘍病菌(Clavibactermichiganense subsp. michiganense),所有上述對照細(xì)菌檢測結(jié)果均為陰性。說明該方法對瓜類果斑病菌具有較好的特異性。實(shí)施例5西瓜種子帶菌檢測利用該方法對西瓜種子進(jìn)行檢測,取西瓜種子經(jīng)無菌水浸泡30mim, 12000g離心，取沉淀。以商業(yè)化植物DNA提取試劑盒提取的樣品總DNA為模板進(jìn)行恒溫擴(kuò)增檢測。對12份陽性及5份健康種子檢測，結(jié)果表明陽性樣品均為陽性，健康樣品均為陰性。
權(quán)利要求
1.一組用于交叉引物恒溫擴(kuò)增檢測瓜類果斑病菌的引物，其核苷酸序列為ACLF3 :5’ -GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB3 :5’ -ACGCATTTCACTGCTACA-3’ ACLBIP :5’ -CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’ACDF5bl :5’ -GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f2 :5’ -CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3’ 其中引物A⑶F5bl5端生物素標(biāo)記，引物A⑶F5f25端FITC標(biāo)記。
2.一種用于檢測瓜類果斑病菌的交叉引物恒溫擴(kuò)增方法，該方法以樣品總DNA或菌液為模板，利用權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行恒溫擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的恒溫擴(kuò)增條件為63°C恒溫擴(kuò)增60min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種運(yùn)用交叉引物恒溫擴(kuò)增檢測瓜類果斑病菌的引物及其檢測方法，其核苷酸序列為ACLF35’-GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB35’-ACGCATTTCACTGCTACA-3’ACLBIP5’-CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’ACDF5b15’-GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f25’-CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3’其中引物ACDF5b15端生物素標(biāo)記，引物ACDF5f2的5端FITC標(biāo)記。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測瓜類果斑病菌的交叉引物恒溫擴(kuò)增技術(shù)，以樣品總DNA或菌液為模板，利用上述引物進(jìn)行恒溫擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后利用封閉式的膠體金標(biāo)記DNA檢測裝置即可直接進(jìn)行結(jié)果判定。本發(fā)明特異性好，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，操作簡便快速，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/04GK102758005SQ201210109529
公開日2012年10月31日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者商明清, 尤其敏, 張靚, 朱水芳, 田茜, 趙文軍 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司