專利名稱：一種檢測人壽命的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及SNP領域，特別涉及與人類壽命相關的SNP。
背景技術：
SNP,單核苷酸多態(tài)性，是指染色體DNA序列的某個位點上的單個堿基(A，T，C或者G)發(fā)生的變異，是繼限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和微衛(wèi)星多態(tài)性這兩種遺傳標記之后出現了第三代遺傳標記。SNP分布廣泛、數目多且相對穩(wěn)定地存在人類染色體上，與許多生物性狀的改變直接相關?，F有的許多調查顯示，人類基因組中存在與人壽命相關的SNP。在動物試驗模型中，很多單基因的變異都能夠導致動物模型壽命的改變；然而自然界中人類和動物的壽命則表現出非常復雜的特性。近年來，有關長壽基因的研究是生命科學領域的熱點之一，候選基因篩查和全基因組掃描分析都被用于長壽基因及位點的鑒定。目前公認的與長壽相關的位點區(qū)域有三個AP0E、F0X03A和AKT1，這三個位點在多個獨立人群試驗中均得到了證實。全基因組掃描分析也鑒定了一些與長壽相關的位點區(qū)域4q25、3p24-22、9q31-34、12q24等，但這些位點在多個獨立人群中沒有得到驗證。由于基因存在一定程度上的遺傳異質性，國外報道的與人壽命有關的SNP不一定存在于中國人的基因組中。因此，對我國的長壽人群進行深入研究，以發(fā)現中國人的長壽基因，對于提升國民身體素質、改善國民生活質量具有重大意義。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了檢測人類壽命長短的方法。本發(fā)明提供了一種檢測人壽命的試劑盒，它包括任選的用于檢測T0MM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異的相關試劑。所述的試劑盒，包括檢測T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑；所述的試劑盒還包括任選的用于擴增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的試劑。上述檢測T0MM40 基因 rs2075650G — A 變異和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A變異的試劑為Snapshot試劑。上述檢測T0MM40 基因 rs2075650G — A 變異和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A變異的試劑為測序用試劑、限制性片段長度多態(tài)方法用試劑或者單鏈構象多態(tài)性分析用試劑。本發(fā)明還提供T0MM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異在制備用于檢測人壽命的試劑中的用途。所述的試劑包括檢測T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基 因rs4713607G — A變異的試劑；所述的試劑還包括任選的用于擴增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的試劑。
上述檢測T0MM40 基因 rs2075650G — A 變異和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A變異的試劑為Snapshot試劑。上述檢測T0MM40 基因 rs2075650G — A 變異和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A變異的試劑為測序用試劑、限制性片段長度多態(tài)方法用試劑或者單鏈構象多態(tài)性分析用試劑。本發(fā)明的測定方法測定來源于人的基因組DNA，樣品沒有限制，如體液(如血液、腹水和尿液)、組織細胞(如肝組織)等，通過提取和純化這些樣品均可制備基因組DNA。本發(fā)明首次闡明了 T0MM40基因rs2075650位點和HLA-DPB2基因rs4713607位點多態(tài)性與長壽的相關性。使用本發(fā)明提供的試劑盒，可以預測待檢人群壽命長短的傾向，對控制人類衰老的進程有重要作用。待檢人群的T0MM40基因rs2075650位點若為A等位基因，他們長壽的可能性增加2. 12，HLA-DPB2基因rs4713607位點若為A等位基因，他們長壽的可能性增加I. 30倍。染色體DNA同一位置上的每個堿基類型叫做一個等位位點，SNP在人群中只有兩種等位型，故亦稱為雙等位標記，其檢測是一種或“全/無”的檢測方式。SNP的檢測方法多種多樣，可分為測序法、雜交法、溶解法、電泳法、化學法、酶學法、物理法以及它們的組合方法，這些方法均是檢測核苷酸變異的常規(guī)實驗手段。這些方法中，測序法可以確定SNP位點的堿基類型，其他方法均僅能判斷SNP的有無。本發(fā)明公開了 T0MM40基因rs2075650位點變異和HLA-DPB2基因rs4713607位點變異的堿基類型，且T0MM40基因和HLA-DPB2基因的序列已知，用現有檢測核苷酸變異的方法均可以檢測上述兩個位點的多態(tài)性。


圖I是Snapshot檢測SNP rs2075650位點的基因分型圖譜圖2是Snapshot檢測SNP rs4713607位點的基因分型圖譜
圖3是通過PCR擴增含有所檢測的SNP位點的DNA片段的反應條件 圖4單堿基引物延伸反應的反應條件
具體實施例方式以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現的技術均屬于本發(fā)明的范圍。用于下列實施例中表示試劑均為市售品，其英文縮寫如下。需要時，用高壓鍋(120°C，20分鐘)滅菌EDTA 乙二胺四乙酸二鈉SDS :十_■燒基硫酸納TE IOmM Tris-HCl (pH7. 5)、ImM EDTA (pH8. 0)dNTP :脫氧核苷三磷酸實施例I樣本收集和基因組DNA的提取樣本是由四川省醫(yī)學科學院 四川省人民醫(yī)院人類疾病基因研究四川省重點實驗室收集。共計收集95歲以上長壽樣本233例，平均年齡99. 7±6. I歲，其中男性占41. 2%；對照樣本669例，平均年齡53. 2±9. 2歲，其中男性占42. 9%。所有受檢者均為漢族，且簽署知情同意書，這一研究也得到了倫理委員會批準。 根據下列方法，用人外周血制備基因組DNA。在抗凝劑EDTA存在下，將收集的5ml人外周血在3000rpm離心分離30分鐘除去血清。接著加入0. 2% NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放置于冰上15分鐘。此后，在3000rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物。用0.2%的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進行洗滌。在如此獲得的沉淀物中，加入IOmM Tris-HCl (pH8. 0)和IOmM EDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物。將10%SDS, 25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16 y I和20 yl，接著上下顛倒懸液輕輕混合。然后，在37°C過夜溫育懸液。過夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm離心分離10分鐘除去水層。將水層和4ml酹/氯仿溶液混合,接著逆混合并以3000rpm離心分離10分鐘，除去水層。最后,用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10，3M NaAC (pH5. 2)，兩倍量的冷無水乙醇，使DNA沉淀。用70%的乙醇洗滌以獲得基因組DNA。最后將所得的基因組DNA溶解于TE中，然后定量測定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液濃度校正至50ng/yl，置_20°C冰箱保存。實施例2 T0MM40基因rs2075650位點和HLA-DPB2基因rs4713607位點多態(tài)性的分析T0MM40基因rs2075650和HLA-DPB2基因rs4713607單核苷酸多態(tài)性的基因型分析可以用現有的SNP檢測手段進行檢測，如，測序方法、限制性片段長度多態(tài)性分析方法、單鏈構象多態(tài)性分析方法，Snapshot檢測方法等。本發(fā)明采用Snapshot基因分型技術對rs2075650和rs4713607兩個位點的單核苷酸多態(tài)性進行檢測。實驗步驟如下I、PCR :95°C變性5分鐘；95°C 30秒、55°C退火30秒、72°C延伸45秒，35個循環(huán)；72°C延伸7分鐘，4°C保溫。2、純化I =PCR產物各取3 ill (另加3 U I ddH20補足9 U I),加入混合液3 U I (SAP2 iil，I 10Exo I 酶 I ill)。I : IOExol 酶的配制方法I 體積 Exol 酶，I 體積 SAP IOXbuffer,8 體積 ddH20。程序37°C Ih, 75°C 15min。3、Snapshot 反應Snapshot Multiplex I U I, PCR 純化產物 I U I, Snapshot 引物每個為 0. 2u I, ddH20 補足 I。程序96°C I 分鐘，96°C 10 秒，50°C 5 秒，60°C 30 秒，25個循環(huán)，4°C保溫。4、純化2 :每個反應加SAP 0. 5-l.OiU，程序:37°C I小時，75°C 15分鐘，4°C保溫。5、liU上述產物加9iU HD。程序95°C，5分鐘，迅速置于冰上，冷卻后上機檢測。PCR 引物對 A(rs2075650)F:5，-GTGGCAGTGAGATTTGAGCA-3’R:5， -TGGGTAAGGACACCAGGAAG-3，PCR 引物對 B (rs4713607)F:5，-TTCTCAGATGGTTCCCTTGG-3’R:5， -TGAAAGAATGGGGACGAAAG-3，
所得到的擴增序列如下序列I (rs2075650) 282bp GGCAGTGAGATTTGAGCAagcaaaggccctggccctgtctaactaggctgtactgcctctttacaggtggaatcctttgtgagatgttctgctgtgggtctctggagagagctgggggtggtagggaaggaagagatgagagtt
ggtgtggggttgg ；|G/^ gtggagtgtgacagcgtttctcttctccagagctgtttcccattcagatggagggtgt
caagctcacagtcaacaaagggttgagtaaccattttcaggtgagcCTTCCTGGTGTCCTTACCCA
序列2 (rs4713607) 297bp TTCTCAGATGGTTCCCTTGGaaattgcctttctaattctgggggattattttctataggcctacctgatatgcctatttaaaaagctgggctgatcttaca IG/N tgcttgcaaaggtttagtaaaaaagccatgcccttgtgcaaaagaaaatgagtcacttttctcttcaaagtcctgaggttaaaggagttccagtgtttcagagtgcactccagaggggtgcaag ctgaagctggtctgtcacccatctagaaaaagaagtgagaataaaagtatcCTTTCGTCCCCATTCTTTCASnapshot 引物 ICrs2O7565O)5， -GAGAGTTGGTGTGGGGTTGG-3’Snapshot 引物 II (rs4713607)5’ -ACCTGATATGCCTATTTAAAAAGCTGGGCTGATCTTACA-3’圖I 圖2為Snapshot檢測rs2075650和rs4713607的基因型圖。實施例3 T0MM40基因rs2075650位點和HLA-DPB2基因rs4713607位點多態(tài)性與長壽的相關性統計方法利用SPSS 13. 0軟件進行分析,檢驗Hardy-Weinberg平衡檢測,數量變量采用t檢驗，質量變量采用卡方檢驗。雙側P <0.05認為統計學的差異顯著。結果如下I)入選樣本基本臨床資料
臨床資料對照__長壽人群
人數169" 233
~^齡53.2±9.2 99.7±6.1**注**，P<0.01。2) SNP位點多態(tài)性與長壽密切相關rs2075650
/Utr 基因型等位基因頻率出 分組---G A -- P 值 OR 值(95%CI)
GG AG AA____G__A___
對照 12 125 532 149 1189 0.111 0.889
--------0.00048 2.12 (1.38-3.26)
長壽 0 丨 26 丨 207 丨 26 丨 440 0.056 0.944 __rs2075650的A等位基因可使長壽的可能性顯著增加(0R = 2. 12，95 % Cl =I. 38-3. 26)，即長壽可能性增加2. 12倍。見圖I。rs4713607
權利要求
1.一種檢測人壽命的試劑盒，其特征在于它包括任選的用于檢測T0MM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異的相關試劑。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于它包括檢測T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑；還包括任選的用于擴增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的試劑。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為Snapshot試劑。
4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為測序用試劑。
5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為限制性片段長度多態(tài)性方法用試劑或者單鏈構象多態(tài)性分析用試劑。
6.T0MM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異在制備用于檢測人壽命的試劑中的用途。
7.根據權利要求6所述的用途，其特征在于所述的試劑包括檢測T0MM40基因rs2075650G — A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑；所述試劑還包括任選的用于擴增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的試劑。
8.根據權利要求7所述的用途，其特征在于所述的檢測T0MM40基因rs2075650G— A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為Snapshot試劑。
9.根據權利要求7所述的用途，其特征在于所述的檢測T0MM40基因rs2075650G— A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為測序用試劑。
10.根據權利要求7所述的用途，其特征在于所述的檢測T0MM40基因rs2075650G—A變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A變異的試劑為限制性片段長度多態(tài)性方法用試劑或者單鏈構象多態(tài)性分析用試劑。
全文摘要
一種檢測人壽命的試劑盒，本發(fā)明涉及SNP領域。本發(fā)明提供了一種檢測人壽命的試劑盒，它包括任選的用于檢測TOMM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異的相關試劑。本發(fā)明還提供了TOMM40基因rs2075650變異和/或HLA-DPB2基因rs4713607變異在制備用于檢測人類壽命的試劑中的用途。本發(fā)明首次闡明了TOMM40基因rs2075650位點和HLA-DPB2基因rs4713607位點多態(tài)性與長壽的相關性。使用本發(fā)明提供的試劑盒，可以預測待檢人群壽命，對控制人類衰老的進程有重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK102618650SQ20121009853
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月5日 優(yōu)先權日2011年4月6日
發(fā)明者劉小琦, 楊正林, 石毅, 魯芳 申請人:四川省醫(yī)學科學院(四川省人民醫(yī)院)