專利名稱：一種韋伯靈芝漆酶及其編碼基因與工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用真菌基因工程領(lǐng)域中一種漆酶蛋白的編碼基因，特別涉及靈芝科靈芝屬韋伯靈芝(Ganoderma weberianum)漆酶的編碼基因及含該基因的工程菌。
背景技術(shù)：
漆酶(Laccase，ECl. 10. 3. 2)是一類(lèi)含銅的多酚氧化酶，漆酶多為單體酶，且酶分子中含有4個(gè)銅原子，所有銅原子都參與漆酶將底物氧化并同時(shí)伴隨著分子氧還原為水的催化過(guò)程，產(chǎn)生的副產(chǎn)物只有水，是“生態(tài)友善的”酶。絕大多數(shù)的真菌漆酶為分泌型糖蛋白，能促進(jìn)木質(zhì)素及其前體物質(zhì)分子或前體物質(zhì)分子類(lèi)似物等許多環(huán)境污染物的降解。漆酶在很多領(lǐng)域，如造紙工業(yè)中紙漿漂白、印染工業(yè)中廢水處理、醫(yī)藥領(lǐng)域中進(jìn)行生物檢測(cè)、以及食品工業(yè)、有機(jī)合成、有機(jī)農(nóng)藥降解等，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。要實(shí)現(xiàn)這些應(yīng)用價(jià)值，必須有質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的酶源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的酶源，能夠產(chǎn)生較強(qiáng)酶活力的菌株，同時(shí)還提供產(chǎn)酶活力更高的基因工程菌株，能促進(jìn)木質(zhì)素及其前體物質(zhì)分子或前體物質(zhì)分子類(lèi)似物等許多環(huán)境污染物的降解。本發(fā)明提供一種韋伯靈芝(Ganoderma weberianum TZC1)TZC1菌株，該菌株已于 2008年9月I日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為 CGMCC No 2648。本發(fā)明所提供的韋伯靈芝(Ganoderma weberianum TZC1) TZCl菌株漆酶基因，來(lái)源于韋伯靈芝TZCl (Ganoderma weberianum TZC1)菌，CGMCC Na 2648，其核苷酸序列為下列之一I)序列表中SEQ ID No. I的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No. 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID No. I限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；序列表中序列I的DNA序列由2734個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第559 位到第2651位堿基，包含2093個(gè)堿基對(duì)。該序列中含有11個(gè)內(nèi)含子，分別為5’端第110 位到第171位堿基，5’端第292位到第487位堿基，5’端第742位到第799位堿基，5’端第869位到第922位堿基，5’端第1044位到第1101位堿基，5’端第1216位到第1283位堿基，5’端第1348位到第1409位堿基，5’端第1509位到第1561位堿基，5’端第1719位到第1774位堿基，5’端第1973位到第2025位堿基，5’端第2289位到第2354位堿基。韋伯靈芝TZCl (Ganoderma weberianum TZC1)菌株漆酶基因的cDNA序列是序列表中的SEQ ID No. 3，由1949個(gè)堿基組成。韋伯靈芝TZCl (Ganoderma weberianum TZC1)菌株漆酶LACl是具有序列表中SEQID No. 2氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
序列表中SEQ ID No. 2由521個(gè)氨基酸殘基組成，自氮端第1_21位氨基酸殘基是 N-端信號(hào)肽(含有21個(gè)氨基酸殘基)；成熟酶為500個(gè)氨基酸殘基。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達(dá)載體，如重組表達(dá)載體pPICZB/Lacl (圖譜如圖I所示)。 重組表達(dá)載體pPICZB/Lacl，轉(zhuǎn)化巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115后得到的工程菌產(chǎn)漆酶巴氏畢赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl。本發(fā)明為了提高產(chǎn)酶活力，又克隆了漆酶的DNA(3005bp)和⑶S(1566bp)序列并構(gòu)建了一個(gè)含有漆酶⑶S的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化巴氏畢赤酵母菌(Pichia past0ris)GS115得到產(chǎn)漆酶工程菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl。工程菌產(chǎn)漆酶巴氏畢赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl,該菌為球形或橢球性，大小為(2. 0-4. 0) X (2. 2-5. 8) u m,為單生或?qū)ι錇槿槔疑泄鉂?。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為I)本發(fā)明所提供的產(chǎn)漆酶工程菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl,在最佳發(fā)酵條件下，酶活力可達(dá)4 5U/mL。該工程菌產(chǎn)酶的特征是分子量為56614，為單體酶。2)本發(fā)明的產(chǎn)漆酶工程菌的發(fā)酵方法簡(jiǎn)單可行，培養(yǎng)基便宜易得，產(chǎn)酶能力強(qiáng)，易于工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低。


圖I為重組表達(dá)載體pPICZB/Lacl的物理圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但并不對(duì)本發(fā)明造成任何限制。實(shí)施例I韋伯靈芝(Ganodermaweberianum) TZCl，CGMCC No 2648 來(lái)源漆酶的 cDNA 克隆韋伯靈芝(Ganodermaweberianum) TZCl，CGMCC Na 2648 來(lái)源漆酶的 cDNA 克隆具體包括以下步驟I、采用RNeasy Plant&Fungi Mini Kit試劑盒(QIAGEN公司產(chǎn)品)抽提韋伯靈芝 (Ganoderma weberianum)TZCl 菌絲的總 RNA。2、按照真菌漆酶中第I和第IV個(gè)Cu2+結(jié)合域氨基酸保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以步驟 I 中的總 RNA為模板，進(jìn)行一步法RT-PCR(Prime-Script One Step RT-PCR kit, TAKARA 公司產(chǎn)品)克隆漆酶部分cDNA中間序列，所得RT-PCR產(chǎn)物在I %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳， 得到漆酶cDNA的中間序列，大小約為I. 2kb。所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物序列如下Primer 1:5' -CA (CT) TGG CA (CT) GG (AGCT) TT (CT) TT (CT) CA-3’Primer IV :5' -TG (AG) AA (AG) TC (AGT) AT (AG) TG (AG) CA (AG) TG-3’3、根據(jù)步驟2中克隆得到的cDNA中間序列設(shè)計(jì)2條引物，按照SMART RACE cDNA Amplification試劑盒(Clontech公司產(chǎn)品)的方法,通過(guò)5' -RACE和3' -RACE的方法獲取漆酶cDNA的兩端序列。所設(shè)計(jì)的基因特異性引物如下
Primer 5' -R : 5' -GTGTGCCGCTCAGGACCTGGAGGAGGAC-3'Primer 3' -F :5' -CCGGTCTTCGGCGACATCGGATTCGAGG-3'4、根據(jù)步驟3中克隆得到的cDNA兩端序列設(shè)計(jì)引物，以步驟I中得到的總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR方法克隆到漆酶的全長(zhǎng)cDNA，其大小約為2. 0Kb。Primer-F 5' -CGCAGTCACCGTCCGGATACG-3'Primer-R 5' -TGCGTCTGGTCCCTGTGCGA-3'5、為構(gòu)建重組表達(dá)載體，在克隆引物的5'-端引入XhoI識(shí)別位點(diǎn)，在3'-端引物引入XbaI識(shí)別位點(diǎn)；這些位點(diǎn)與表達(dá)載體pPICZB上的酶切位點(diǎn)匹配。所設(shè)計(jì)的引物為Primer-N :5' -CTCGAGATGGCTGGACTTCGATCCTTACTCTC-3'Primer-C :5' -TCTAGATGGTCGTCGGGCGAGAGCGCATC-3'PCR產(chǎn)物經(jīng)Agarose gel DNA purification kit (TAKARA公司產(chǎn)品)回收純化、與測(cè)序載體連接、轉(zhuǎn)化并篩選得到重組子，送華大基因公司測(cè)序。測(cè)得的韋伯靈芝(Ganoderma weberianum)TZCl漆酶的Q)S序列如序列表中序列4,共1566bp。韋伯靈芝(Ganoderma weberianum)TZCl漆酶的氨基酸序列如序列表中序列2。該漆酶含有521個(gè)氨基酸殘基， N端1-21氨基酸殘基，是信號(hào)肽序列；成熟酶為500個(gè)氨基酸殘基。該酶具有漆酶的所有保守特征，包括銅離子結(jié)合域(N端30-152、163-306、366-495氨基酸殘基)等。利用 BLASTp搜索工具將該序列與已報(bào)道的幾種漆酶氨基酸序列進(jìn)行比較，其同源性與Ganderma fornicatum來(lái)源的漆酶LACl同源性為87%,與Ganderma tsugae來(lái)源的漆酶LACl同源性為84%,與Ganoderma Iucidum來(lái)源的漆酶同源性為81 與Ganoderma sp.En3來(lái)源的漆酶同源性為75%,與Flammulina velutipes來(lái)源的漆酶同源性為75%。實(shí)施例2韋伯靈芝(Ganodermaweberianum) TZCl，CGMCC No 2648 漆酶的基因克隆I、按照Xu F(1994)的方法提取韋伯靈芝(Ganoderma weberianum)TZCl的基因組DNA(Xu F,HJ Yoell,JB Anderson(1994),An efficient protocol for isolating DNA from higher fungi. Trends Genet 10 :226-227)。2、根據(jù)韋伯靈芝(Ganoderma weberianum) TZCl漆酶的cDNA兩端序列設(shè)計(jì)引物， 以基因組DNA為模板,按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到韋伯靈芝(Ganoderma weberianum) TZCl漆酶的基因序列，PCR產(chǎn)物大小約為3. 0Kb。所設(shè)計(jì)的引物序列為Primer-F 5' -CGCAGTCACCGTCCGGATACG-3'Primer-R 5' -TGCGTCTGGTCCCTGTGCGA-3'PCR產(chǎn)物經(jīng)Agarose gel DNA purification kit (TAKARA 公司產(chǎn)品)回收純化，與測(cè)序載體連接、轉(zhuǎn)化并篩選得到重組子，送華大基因公司測(cè)序。測(cè)得的韋伯靈芝(Ganoderma weberianum) TZCl漆酶的DNA序列如序列表中序列I ;該基因含有2734bp,與漆酶的cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)該序列中含有11個(gè)內(nèi)含子，分別為5’端第110位到第171位堿基，5’端第292 位到第487位堿基，5’端第742位到第799位堿基，5’端第869位到第922位堿基，5’端第 1044位到第1101位堿基，5’端第1216位到第1283位堿基，5’端第1348位到第1409位堿基，5’端第1509位到第1561位堿基，5’端第1719位到第1774位堿基，5’端第1973位到第2025位堿基，5’端第2289位到第2354位堿基。實(shí)施例3
工程菌的構(gòu)建I、構(gòu)建含韋伯靈芝(Ganoderma weberianum)TZCl漆酶⑶S的重組表達(dá)質(zhì)粒。韋伯靈芝(Ganoderma weberianum) TZCl漆酶經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切后與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶作用的PPICZB按常規(guī)方法連接。所構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPICZB/Lacl如圖I所示。2、重組表達(dá)載體經(jīng)Pme I線性化,按常規(guī)方法電激轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115, 利用Zeocin抗性篩選和PCR篩選陽(yáng)性重組子。陽(yáng)性重組子GS115_Lacl利用甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵， 取Iml發(fā)酵液，5000rpm離心5min，上清即為粗酶液。在含有100mM、pH4. 0的醋酸鹽緩沖溶液，0. 5mM ABTS和500 u L粗酶液的3ml反應(yīng)體系中，25 °C水浴保溫3min，測(cè)0D420，結(jié)果得到產(chǎn)漆酶工程菌產(chǎn)漆酶巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-Lacl。工程菌產(chǎn)漆酶巴氏畢赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115_Lacl,該菌為球形或橢球性，大小為(2. 0-4. 0) X (2. 2-5. 8) u m,為單生或?qū)ι?，菌落為乳酪色有光澤。?shí)施例4 工程菌的酶活力實(shí)施例3所構(gòu)建的產(chǎn)漆酶工程菌(Pichia pastoris) GSl 15-Lacl，利用BMGY (IOg/ L 酵母提取物，20g/L 蛋白胨，100ml/L 0. 2M 磷酸緩沖液 pH = 6. 0，13. 4g/L YNB，0. 00004% 生物素，10ml/L甘油，lml/L zeocin)液體培養(yǎng)基在29度，培養(yǎng)2天，收集菌體，將其轉(zhuǎn)移到 BMMY (10g/L 酵母提取物，30g/L 蛋白胨，100ml/L 磷酸緩沖液 pH = 6. 0，13. 4g/L YNB, 300ul
0.IM CuS04，8g/L 丙氨酸，0.00004%生物素，0.5% 甲醇，lml/L zeocin)液體培養(yǎng)基在 20 度，培養(yǎng)6天后，取Iml發(fā)酵液，14000rpm離心lOmin，上清液即為粗酶液。在含有100mM，pH = 5.0的醋酸鹽緩沖溶液，0. 5mM ABTS和IOOul粗酶液的Iml反應(yīng)體系中，室溫下3min，測(cè) OD徹。結(jié)果酶活力可達(dá)4 5U/mL，其中酶活力是指上述條件下，每分鐘催化liimol ABTS 氧化所需的酶量。該工程菌產(chǎn)酶的特征是分子量為56614，為單體酶。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.韋伯靈芝(Ganodermaweberianum TZCI) TZCl 菌株，CGMCC Na 2648。
2.韋伯靈芝(Ganodermaweberianum TZC1) TZCl菌株漆酶基因,其核苷酸序列為下列之一1)序列表中SEQID No. I的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No. 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQID No. I限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因,其特征在于,所述韋伯靈芝(Ganodermaweberianum TZCDTZC1菌株漆酶基因的cDNA序列是序列表中的SEQ ID No. 3。
4.韋伯靈芝(Ganodermaweberianum TZC1) TZCl 菌株漆酶,是序列表中 SEQ ID No. 2。
5.—種表達(dá)載體,其特征在于,該載體含有權(quán)利要求2所述的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種表達(dá)載體,其特征在于,所述載體為pPICZB/Lacl。
7.—種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于，該細(xì)胞系含有權(quán)利要求2所述的基因。
8.—種工程菌，其特征在于，該工程菌含有權(quán)利要求2所述的基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種工程酶，其特征在于，所述工程菌為巴氏畢赤酵母 (Pichia pastoris)GS115_lacl0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種韋伯靈芝漆酶及其編碼基因與工程菌。本發(fā)明所提供的韋伯靈芝[Ganoderma weberianum(Bres.&Henn.)]TZC1菌漆酶基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No.2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的工程菌在最佳發(fā)酵條件下，酶活力可達(dá)4-5單位/毫升，并且其發(fā)酵方法簡(jiǎn)單可行，培養(yǎng)基便宜易得，產(chǎn)酶能力強(qiáng)，易于工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102618450SQ201210098410
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月1日
發(fā)明者周玉萍, 田長(zhǎng)恩, 陳瓊?cè)A 申請(qǐng)人:廣州大學(xué)