專利名稱：用于生產(chǎn)脂肪酶的方法、能產(chǎn)生所述脂肪酶的轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母細(xì)胞以及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過使用產(chǎn)生耐酸的重組體脂肪酶的解脂耶氏酵母(YairowiaIipolytica)細(xì)胞來生產(chǎn)脂肪酶的方法，該方法允許生產(chǎn)能用作藥物的脂肪酶；本發(fā)明還涉及一種過度產(chǎn)生耐酸重組體脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類每日攝取的食品主要由脂類、蛋白質(zhì)和糖組成。在它們被吸收之前，所有這些組成要經(jīng)受消化道內(nèi)的酶的催化水解。這些酶中任何一種的缺乏可以因此引起消化紊亂， 并且導(dǎo)致相當(dāng)嚴(yán)重的營養(yǎng)不良。即，例如，在一些病態(tài)情況的病例中，比如囊性纖維化或外分泌胰腺的不足與胰脂酶缺乏有關(guān)。為校正這些缺乏，通常建議口服給藥胰腺提取物。然而，這些療法的效率受限于如下事實(shí)這些提取物中所含的酶(脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)會(huì)因胃介質(zhì)的酸性而快速失活。因此，有人建議使用抗胃環(huán)境的脂肪酶制劑，比如，其例子有通過基因工程生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物胃脂肪酶制劑，比如申請人為于文尼爾研究股份公司(INSTITUT DE RECHERCHEJOUVENIAL SA)的法國專利申請公開2699179描述的制劑、或者在酸性介質(zhì)中具有適當(dāng)活性的微生物脂肪酶制劑[ZENTLER-M0NR0 等，Pancreas, 7，311-319 (1992)]。在酸性介質(zhì)中有活性的微生物脂肪酶中，可能會(huì)尤其提到真菌脂肪酶，比如來自歐諾比假絲酵母(Candida ernobii) [Y0SHIDA 等,Biochim. Biophys. Acta. ； 154,586-588(1968)]、來自星狀絲孢酵母(Trichosporon asteroid)[DHARMSTHITI 等，Biotechnol. Appl. Biochem.，26,111-116 (1997)]、來自爪睡根霉(Rhizopus javanicus)[UYTTENBR0ECK 等，Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)]、或來自解脂耶氏酵母[HADEBALL，Acta Biotechnol.，2，159-167(1991) ;NOVOTNY 等，J. Basic Microbiol. 28,221-227(1988)]的那些真菌脂肪酶。除了它們在酸性pH下的活性之外，這些脂肪酶當(dāng)它們的底物存在時(shí)，具有通常的抗蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶)消化的特性，并且具有抵抗膽鹽作用的特性(當(dāng)存在IOmM?；悄懰徕c時(shí)它們的活性可保持)。已經(jīng)有人描述了解脂耶氏酵母用于生產(chǎn)所研究基因的應(yīng)用。因此，申請人為INRA和CNRS的專利申請EP 1108043描述了包含所研究基因的表達(dá)盒和Zeta序列(zetasequences)的整合載體的應(yīng)用，該整合載體對(duì)應(yīng)于解脂耶氏酵母Ylt逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的LTR序列。這樣的表達(dá)載體允許將插入所研究基因的數(shù)個(gè)拷貝非同源地并且分散地整合入缺乏Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株的基因組DNA中。該系統(tǒng)尤其已經(jīng)用于將編碼脂肪酶的LIP2基因整合入解脂耶氏酵母DNA，并且已經(jīng)允許在培養(yǎng)基條件(未詳述)下，與未轉(zhuǎn)化的菌株相比，轉(zhuǎn)化菌株分泌的脂肪酶量高出10至15倍。
其他研究描述了如專利申請EP 1108043所述的相同表達(dá)載體用于在解脂耶氏酵母中產(chǎn)生重組體脂肪酶的應(yīng)用(國際申請WO 01/83773 ;PIGNEDE等，Journal ofBacteriology, vol. 182，No. 10，p. 2802-2810(2000)以及 PIGNEDE 等，Applied andEnvironmental Microbiology, vol. 66, No. 8, p. 3283-3289 (2000))。具體為-國際申請TO01/83773，申請人為法國米奧里大藥廠(Laboratoires MAYOLYSPINDLER)，描述了解脂耶氏酵母MS4克隆(CNCM 1-2294)的產(chǎn)生，該MS4克隆包含被整合入其DNA的10個(gè)拷貝的LIP2基因表達(dá)盒、并且描述了其用于生產(chǎn)脂肪酶的應(yīng)用，產(chǎn)率為每升培養(yǎng)液上清液含有0. 5g左右的脂肪酶、以及使用橄欖油作為底物測得的12，000U/ml的催化活性，其中一個(gè)活性單位對(duì)應(yīng)于每分鐘能夠催化釋放I U mol脂肪酸的酶量，即，超過原始菌株200倍。然而，該申請所述的產(chǎn)生脂肪酶的方法的主要缺點(diǎn)在于其使用了含有細(xì)菌用蛋白胨(bactopeptone)或細(xì)菌用胰胨(bactotryptone)的培養(yǎng)基。這些未被表征并且含有各種蛋白質(zhì)水解物的產(chǎn)物通常用作氮源和碳源。因此，該申請所述的方法不可能得到可以直接用作藥物的脂肪酶。
-PIGNEDE 等(Journal of Bacteriology, 2000)更具體地表征了被解脂耶氏酵母(POld菌株)LIP2基因編碼的胞外脂肪酶。在本文中描述了下面的研究內(nèi)容 從各種野生型菌株(缺乏Yltl的POld和含有Yltl的E150)以及從包括JMY184(P01d-6-15)和JMY279(P01d-6-17)在內(nèi)的各種重組菌株分泌脂肪酶的情況，以及 轉(zhuǎn)化體JMY184的脂肪酶過度產(chǎn)生情況。PIGNEDE等的文章比較了被野生型菌株、突變株和根據(jù)如上所述方法(國際申請W001/83773)得到的重組菌株的脂肪酶生產(chǎn)情況。野生型菌株分泌的脂肪酶為30 50U/mL，而在N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NNNG)的作用下得到的突變株在優(yōu)化培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的脂肪酶多出25倍，即1200U/mL的脂肪酶，該優(yōu)化的培養(yǎng)條件涉及含有蛋白胨的培養(yǎng)基(預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基)和含有乳清的培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)(也請參見DESTAIN等，1997)。借助于該表達(dá)盒中的包含受P0X2啟動(dòng)子和非同源整合調(diào)節(jié)的LIP2基因的呈多拷貝和呈分散方式的構(gòu)造，得到了重組菌株。PIGNEDE等得到了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體(例如菌株JMY184)，其在未優(yōu)化的條件下，即在YPDH培養(yǎng)基(包含10g/L酵母浸膏、10g/L細(xì)菌用蛋白胨、10g/L的葡萄糖和10g/L的橄欖油)中產(chǎn)生2000U/mL的脂肪酶，相當(dāng)于約0. 5g脂肪酶/L上清液。以如上所述相同的方式，PIGNEDE等和DESTAIN等描述的脂肪酶制劑不適用于醫(yī)療用途，并且尤其不適合于臨床批量的制備，因?yàn)樗鼈兊纳a(chǎn)需要使用含有蛋白胨或乳清的培養(yǎng)基。-在其文獻(xiàn)中，PIGNEDE的研究小組(Applied and Environmental Microbiology,2000)研究了用包含LIP2基因表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母菌株。該作者發(fā)現(xiàn)，對(duì)于8種這樣的轉(zhuǎn)化體，LIP2基因表達(dá)盒的拷貝數(shù)在6和16之間(平均10個(gè)拷貝)，這導(dǎo)致在不同的基因座處所述表達(dá)盒發(fā)生2至15次整合。該JMY184菌株因此包含12個(gè)拷貝的在4個(gè)不同的基因座處整合的LIP2基因表達(dá)盒。此外，該作者更具體地研究了該JMY184轉(zhuǎn)化體。他們確認(rèn)，JMY184菌株在豐富的YPDH培養(yǎng)基(含有細(xì)菌用蛋白胨)上培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生0. 5g脂肪酶/L上清液，使用橄欖油作為底物進(jìn)行測量時(shí)，該上清液的活性為1500U/mL (相對(duì)地，野生型菌株P(guān)Old為50U/mL)。根據(jù)這些數(shù)值可以推定脂肪酶的比活性為約3000U/mg。該作者另外報(bào)告到，優(yōu)化JMY184菌株在發(fā)酵罐中的脂肪酶生產(chǎn)可以得到活性高達(dá)10，000U/mL的制品。然而，作者未公開得到該結(jié)果的培養(yǎng)條件。在該文獻(xiàn)中，作者另外研究了這些轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性，尤其是JMY184克隆的穩(wěn)定性，并且顯示它們的穩(wěn)定性為120代。PIGNEDE等認(rèn)為，為了優(yōu)化脂肪酶的生產(chǎn)，待考慮的因素是轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性和培養(yǎng)條件。此外，他們顯示，在整合的LIP2基因的拷貝數(shù)和脂肪酶的過度產(chǎn)生之間有強(qiáng)相關(guān)性。然而，對(duì)于脂肪酶的生產(chǎn)，在該文獻(xiàn)中公開的僅有的培養(yǎng)基是含有蛋白胨的培養(yǎng)基，比如豐富的YPDH培養(yǎng)基。生產(chǎn)脂肪酶的現(xiàn)有技術(shù)方法，即使它們使得到提高的脂肪酶產(chǎn)率成為可能，也不適用于適合醫(yī)療目的的脂肪酶的生產(chǎn)。實(shí)際上，通常使用的培養(yǎng)基全部含有未被表征的動(dòng)物來源的混合物和/或產(chǎn)物，比如蛋白胨、胰胨或乳清。因此需要開發(fā)允許生產(chǎn)適合醫(yī)療使用的重組體脂肪酶制品的體系。

發(fā)明內(nèi)容
·
為了解決該問題，本發(fā)明人開發(fā)了用于生產(chǎn)脂肪酶的方法，其與現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的方法相比能更好地滿足這些需要。更具體地講，本發(fā)明人開發(fā)了一種用于生產(chǎn)脂肪酶的方法，其中使用的培養(yǎng)基不含上述產(chǎn)物，即，培養(yǎng)基不包含動(dòng)物來源的產(chǎn)物并且不包含未被表征的混合物比如蛋白胨、胰胨或乳清。本發(fā)明人另外還篩選出一種新穎的用于生產(chǎn)脂肪酶Lip2的重組體解脂耶氏酵母菌株，該菌株與所述方法相結(jié)合可以顯著地提高脂肪酶的產(chǎn)率。因此，本發(fā)明的主題是一種使用被載體轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母菌株用于生產(chǎn)脂肪酶的方法，該載體包含用于表達(dá)酵母耐酸脂肪酶的表達(dá)盒，其特征在于，使用的培養(yǎng)基不包含動(dòng)物來源的產(chǎn)物或未被表征的混合物，比如蛋白胨、胰胨或者乳清。更具體地說，本發(fā)明的主題是一種用于生產(chǎn)脂肪酶的方法，該方法包括a)在允許脂肪酶產(chǎn)生的條件下用于培養(yǎng)使用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母細(xì)胞的步驟，所述載體包含用于表達(dá)酵母耐酸脂肪酶的表達(dá)盒；b)用于回收由所述培養(yǎng)基的上清液產(chǎn)生的脂肪酶的步驟；該方法的特征在于，用于培養(yǎng)的步驟a)是在不含由動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)材料(例如乳清)或它們的酶消化產(chǎn)物(例如胰胨或蛋白胨)所組成的動(dòng)物來源的產(chǎn)物或未被表征的混合物的培養(yǎng)基中進(jìn)行。根據(jù)所述方法的優(yōu)選實(shí)施方式，根據(jù)步驟a)的所述培養(yǎng)基包含-作為氮源的無機(jī)氮，并且優(yōu)選硫酸銨；-碳源，其選自于碳水化合物來源的碳源，多元醇例如甘油、以及脂類來源的碳源例如脂肪酸和甘油酯；以及-無機(jī)鹽、微量元素和維生素。根據(jù)所述方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟a)包括al)用于在含有碳水化合物來源的碳源的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)如上限定的轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母細(xì)胞的步驟；以及a2)所述細(xì)胞的發(fā)酵步驟，包括在含有碳水化合物來源的碳源的培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長期，以及在含有選自短鏈、中鏈或長鏈三酸甘油酯的脂肪酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中的脂肪酶合成期。于是，發(fā)酵在允許細(xì)胞生長的第一種情況下進(jìn)行，例如在存在碳水化合物來源的碳源時(shí)進(jìn)行，以及在允許生物合成所述脂肪酶的條件下的第二種情況下進(jìn)行，例如在存在脂肪酸型的化學(xué)誘導(dǎo)劑作為唯一碳源時(shí)進(jìn)行，該化學(xué)誘導(dǎo)劑包括比如短鏈三酸甘油酯(例如三丁酸甘油酯)、中鏈三酸甘油酯(比如三辛酸甘油酯)或長鏈三酸甘油酯(例如橄欖油或者三油酸甘油酯)。優(yōu)選進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，常數(shù)p02為15% 25%，并且優(yōu)選pH小于6. 5。例如發(fā)酵可以在下述條件下進(jìn)行空氣流量約為Ivvm,其中一個(gè)vvm單位是每液體體積每分鐘I體積的空氣(例如，對(duì)于一個(gè)30升的發(fā)酵罐，Ivvm等于301/min ;而對(duì)于一個(gè)5升的發(fā)酵罐，Ivvm等于 51/min)。根據(jù)本實(shí)施方式的優(yōu)越特征，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)步驟al)直至OD6tltlnm值為3 10每lmL，并且在發(fā)酵步驟a2)中，當(dāng)培養(yǎng)液的OD6tltlnm值達(dá)到60 70每ImL時(shí)開始所述脂肪酶合成期。、根據(jù)本實(shí)施方式的另一個(gè)優(yōu)越特征，當(dāng)OD6tltlnm值達(dá)到300 350每毫升時(shí)啟動(dòng)步驟b)。另外步驟b)可以包括bl)從所述培養(yǎng)液上清液中分離脂肪酶；b2)在步驟bl)中得到的脂肪酶的純化。這兩個(gè)步驟按本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法進(jìn)行物理分離(過濾、層析、離心法)或者物理化學(xué)分離法(沉淀法)。從上清液中分離脂肪酶可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行，例如通過選自中空纖維切向過濾、正面過濾以及連續(xù)式或分批式離心法的技術(shù)進(jìn)行。脂肪酶的純化尤其包括降低生物載荷(bioload)，S卩，微生物的存在，并且可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的任何合適的純化技術(shù)進(jìn)行，例如選自過濾、分級(jí)沉淀、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾層析的技術(shù)。任選地，用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的脂肪酶的方法也可以包括濃縮或富集步驟，該步驟包括提高制品中脂肪酶的濃度。這樣的步驟例如可以在提純步驟之后進(jìn)行。也可以與該提純步驟同時(shí)進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法尤其有可能以約I至3g的純化脂肪酶每升培養(yǎng)液上清液的量生產(chǎn)出重組體脂肪酶。在特別優(yōu)越的方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法允許生產(chǎn)催化活性大于培養(yǎng)液上清液的15，000U/mL的重組體脂肪酶制品。優(yōu)選所述制品的活性大于培養(yǎng)液上清液的20，000U/mL。在pH 6時(shí)通過使用三辛酸甘油酯作為底物測定這些數(shù)值。脂肪酶制品的該活性值對(duì)于本申請上下文的藥劑開發(fā)尤其重要。實(shí)際上現(xiàn)在可以給藥劑量降低的根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的脂肪酶，同時(shí)保持足夠的效力以得到欲期的治療效果，例如可以是與脂肪酶缺乏有關(guān)的胰腺不足相關(guān)的脂肪吸收障礙的矯正?，F(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明的方法，在無需動(dòng)物來源的產(chǎn)物的情況下通過使用重組體解脂耶氏酵母菌株可以生產(chǎn)出脂肪酶Lip2，該事實(shí)成為重要的優(yōu)勢，并且大大地促進(jìn)了脂肪酶用于醫(yī)療目的的應(yīng)用。用于獲得在本發(fā)明的方法中使用的重組體解脂耶氏酵母細(xì)胞的表達(dá)載體是一整合載體，其具有至少一個(gè)拷貝的LIP2基因和用于調(diào)節(jié)表達(dá)的元件。然后該載體可以被整合入質(zhì)粒DNA或者整合入酵母的基因組DNA。整合載體的一個(gè)尤其優(yōu)選的例子是如國際申請WO 01/83773所述的載體JMP6或載體JMP10。載體JMP6包含有LIP2基因的表達(dá)盒，其編碼解脂耶氏酵母Lip2脂肪酶的Lip2p前體，其上游設(shè)置用于?；鵆oA氧化酶AC02的稱為P0X2的解脂耶氏酵母啟動(dòng)子。載體JMPlO也包含LIP2基因，其上游是用于Lip2脂肪酶的解脂耶氏酵母啟動(dòng)子。這兩種啟動(dòng)子可被三酸甘油酯和脂肪酸誘導(dǎo)。在這些載體中的各個(gè)中，表達(dá)盒和啟動(dòng)子被設(shè)置在如上所述Zeta序列之間。該整合可以是靶向整合，即針對(duì)某位點(diǎn)，或者是隨機(jī)的整合。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母菌株不含Zeta序列時(shí)(例如，POld菌株的情形)，表達(dá)盒的整合分散于所述菌株基因組DNA中。另一方面，當(dāng)解脂耶氏酵母菌株包含Zeta序列(例如，E150菌株的情形)時(shí)，整合主要針對(duì)這些序列。根據(jù)所述方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母菌株優(yōu)選是稱為YL-LIP2-6C的菌株，該菌株于2005年12月15日保藏在法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,C. N. C. M.,法國巴黎道可圖羅斯大街28號(hào)，企業(yè)郵遞特投15，郵編75724)，保藏編號(hào)為1-3542。該YL-LIP2-6C菌株遺傳學(xué)穩(wěn)定。 為本發(fā)明的目的，在此使用的術(shù)語“穩(wěn)定”、“遺傳學(xué)穩(wěn)定”、“基因穩(wěn)定”及其變化表述是指，對(duì)于將所研究的核酸整合入克隆的DNA而言相同數(shù)量的基因座至少保持30代。選用30代這一數(shù)量作為計(jì)算遺傳穩(wěn)定性的基礎(chǔ)，是因?yàn)楸景l(fā)明人注意到該數(shù)量對(duì)應(yīng)于細(xì)胞群的許多次復(fù)制，足以允許使用一方法進(jìn)行脂肪酶的生產(chǎn)，所述方法包含至少一個(gè)預(yù)培養(yǎng)重組體解脂耶氏酵母細(xì)胞的步驟和一個(gè)在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下生產(chǎn)脂肪酶的步驟。為本發(fā)明的目的，世代被定義為細(xì)胞群的復(fù)制，并且可以根據(jù)公式Y(jié) = XX 2g計(jì)算，其中Y是在時(shí)間t時(shí)的細(xì)胞群(例如，表示為細(xì)胞密度)；X是在時(shí)間h時(shí)的啟始細(xì)胞群，并且g代表細(xì)胞群從數(shù)值X至數(shù)值Y所必需經(jīng)過的傳代數(shù)。優(yōu)選在至少30代以后，當(dāng)至少90%的被分析菌落含有與起始克隆相同數(shù)量的所研究基因的基因座時(shí)，克隆被認(rèn)為是遺傳學(xué)穩(wěn)定的。因此，作為明顯的例子，克隆YL-LIP2-6C被認(rèn)為是穩(wěn)定的，這是因?yàn)樵?00代后，幾乎100%的被分析菌落含有6個(gè)LIP2基因的基因座(一個(gè)基因座對(duì)應(yīng)于用于整合LIP2基因的表達(dá)盒的內(nèi)源性LIP2基因+5個(gè)基因座)。令人驚訝的是，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法使用這一特殊的菌株時(shí)，本發(fā)明人成功地大量地生產(chǎn)出重組體脂肪酶，并且在整個(gè)所述生產(chǎn)期間進(jìn)行較好的控制。本發(fā)明人的確成功地提高了脂肪酶的產(chǎn)率，并且尤其能夠得到I 3g純脂肪酶每升培養(yǎng)液上清液的產(chǎn)率。他們也能得到活性接近20，000U/mL的脂肪酶制品。為本發(fā)明的目的，脂肪酶的活性對(duì)應(yīng)于其酶催化活性。脂肪酶溶液的催化活性表示為單位(U)每毫升分析溶液。比活力表示為單位(U)每毫克純化蛋白質(zhì)(脂肪酶)。一個(gè)單位相當(dāng)于每分鐘能夠催化釋放I y mol脂肪酸的酶量。脂肪酶的比活力根據(jù)用作底物的三酸甘油酯的性質(zhì)變化。除提高脂肪酶的產(chǎn)率之外，本發(fā)明人也能提供生產(chǎn)方法較好的再現(xiàn)性，提高最終產(chǎn)品的均一性，并且改善用于純化脂肪酶的條件。因此，這些各種改進(jìn)可以獲得滿足醫(yī)療用途所需條件的脂肪酶。事實(shí)上，在他們的研究的上下文中，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)觀察到，Lip2脂肪酶在pH值大于3并且直至pH值接近8的范圍內(nèi)具有活性，最優(yōu)的活性在pH 5 6之間。另一方面，其在pH 3或者pH 8.5下保溫2小時(shí)會(huì)不可逆地失活。經(jīng)分析，Lip2脂肪酶的比活力也與不同的底物有關(guān)，并且本發(fā)明人因此測定在pH 4下純化脂肪酶對(duì)于短鏈三酸甘油酯(三丁酸甘油酯)、中鏈三酸甘油酯(三辛酸甘油酯)和長鏈三酸甘油酯(橄欖油)的比活力值分別為約10，760U/mg、約16，920U/mg和約12，260U/mg。最后，本發(fā)明人驚訝地觀察到，Lip2脂肪酶在膽鹽存在時(shí)具有活性，并且該活性隨著膽鹽的濃度而增加。直到現(xiàn)在，僅僅發(fā)現(xiàn)與輔助脂肪酶相結(jié)合的胃脂肪酶和胰脂酶在膽鹽存在時(shí)具有這種活性。因此，具有較高比活性的Lip2脂肪酶的應(yīng)用不需要輔助脂肪酶的存在?？寺L-LIP2-6C含有數(shù)個(gè)拷貝的該Lip2脂肪酶的表達(dá)盒，導(dǎo)致在不同的基因座處產(chǎn)生5次LIP2基因的整合。當(dāng)置于適合產(chǎn)生脂肪酶的條件下時(shí)，相比現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株，克隆YL-LIP2-6C生產(chǎn)出更多的脂肪酶。脂肪酶的產(chǎn)率大于lg/L培養(yǎng)液上清液，即，大于如上所述觀察到的現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域克隆的產(chǎn)率。
本發(fā)明的主題還涉及脂肪酶制品，其可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法而得到。根據(jù)所述脂肪酶制品的優(yōu)選實(shí)施方式，當(dāng)按如上所指出的方法測定時(shí)，其活性至少等于 15，000U/ml，優(yōu)選大于 20，000U/ml。另外，本發(fā)明的主題還涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪酶制品用于制備藥物的應(yīng)用，其目的在于治療與脂肪(例如短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸)吸收失調(diào)有關(guān)的疾病，尤其是與胰腺不足、特別是外分泌胰腺不足相關(guān)的疾病。本發(fā)明的主題還涉及一種藥物，其特征在于，其包含如上限定的脂肪酶制品。本發(fā)明的主題還涉及一種用載體轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母菌株，所述載體用于表達(dá)酵母耐酸脂肪酶，其特征在于，該菌株是稱為YL-LIP2-6C的克隆，其于2005年12月15日保藏在法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心(C. N. C. M.，法國巴黎道可圖羅斯大街28號(hào)，企業(yè)郵遞特投15，郵編75724)，保藏編號(hào)為1-3542。另外，本發(fā)明的主題還涉及如上限定的細(xì)胞用于生產(chǎn)酵母耐酸脂肪酶的應(yīng)用。


除前述特征外，本發(fā)明還包括如下說明書中出現(xiàn)的其他特征，下面參照實(shí)施本發(fā)明方法的實(shí)施例和下述附圖，對(duì)這些特征進(jìn)行描述-圖I顯示了用于在生產(chǎn)脂肪酶的方法期間控制YL-LIP2-6C克隆的遺傳穩(wěn)定性的總體方法。-圖2顯示了在發(fā)酵工藝期間，在600nm下光密度(OD6tltol，左側(cè)Y軸)的變化(- -)和生長速率0T1，右側(cè)Y軸)的變化(-■-)與時(shí)間(小時(shí)，X軸)的關(guān)系。箭頭顯示了誘導(dǎo)脂肪酶的產(chǎn)生。-圖3顯示了在不同的基因座處將LIP2基因整合入23個(gè)菌落的基因組(車道24至43)的整合次數(shù)的Southern blot分析,菌落收集時(shí)間點(diǎn)T33對(duì)應(yīng)于發(fā)酵結(jié)束，即在發(fā)酵開始后約100小時(shí)?？截悢?shù)I 6 :6個(gè)LIP2基因的基因座(5個(gè)用于整合LIP2基因表達(dá)盒的基因座+1個(gè)用于內(nèi)源性LIP2基因的基因座)。M :大小標(biāo)記。-圖4顯示了在T16至T33的生產(chǎn)期間YL-LIP2-6C克隆產(chǎn)生重組體脂肪酶的SDS-PAGE監(jiān)測情況。箭頭顯示了誘導(dǎo)產(chǎn)生脂肪酶(T17，發(fā)酵48小時(shí))。M :分子量梯度；右手部分凝膠中的五個(gè)泳道對(duì)應(yīng)于已知量(2. 5 g至20 g)的純化Lip2脂肪酶。-圖5顯示了在時(shí)間點(diǎn)T33(發(fā)酵工藝終點(diǎn))處上清液中脂肪酶純度的SDS-PAGE分析情況。MW :分子量梯度；參照Lip2F5 :Lip2脂肪酶范圍I至IOii g ;YL_LIP2_6C上清液被分析的上清夜的體積為U L0-圖6顯示了通過MALDI-T0F型質(zhì)譜分析法測定的YL-LIP2-6C克隆生產(chǎn)的重組體脂肪酶的質(zhì)譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I—材料和方法I)使用的培養(yǎng)基顯示的最終濃度是母液中的濃度。未富集的基礎(chǔ)培養(yǎng)基02130S
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)重組體脂肪酶的方法，其包括 a)培養(yǎng)用載體轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母細(xì)胞的步驟，所述載體包含用于表達(dá)酵母耐酸脂肪酶的表達(dá)盒，所得到的解脂耶氏酵母細(xì)胞是名為YL-LIP2-6C的克隆，所述克隆于2005年12月15日保藏在法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏編號(hào)為1-3542 ;以及 b)從培養(yǎng)液上清液中回收用所述YL-LIP2-6C細(xì)胞生產(chǎn)的所述重組體脂肪酶的步驟， 該方法的特征在于， 用于培養(yǎng)的步驟a)是在不含由動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)材料或它們的酶消化產(chǎn)物所組成的動(dòng)物來源的產(chǎn)物或未被表征的混合物的培養(yǎng)基中進(jìn)行的；并且所述培養(yǎng)基包含 -作為氮源的無機(jī)氮； -碳源，其選自于碳水化合物來源的碳源、多元醇、以及脂類來源的碳源；以及 -無機(jī)鹽和維生素；并且 所述步驟a)包括 al)在含有碳水化合物來源的碳源的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)所述YL-LIP2-6C細(xì)胞；a2)發(fā)酵步驟，包括在含有碳水化合物來源的碳源的培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長期，以及在含有脂肪酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中的脂肪酶生產(chǎn)期。
2.如權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述無機(jī)氮是硫酸銨。
3.如權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述脂肪酸是油酸。
4.如權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述發(fā)酵在15% 25%的恒定p02和PH小于6. 5的條件下進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，進(jìn)行用于預(yù)培養(yǎng)的步驟al)直至OD6tltol值為3 10每lmL，在用于發(fā)酵的步驟a2)中，當(dāng)所述培養(yǎng)液的OD6tltol值達(dá)到60 80每ImL時(shí)，開始所述脂肪酶生產(chǎn)期。
6.如權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，當(dāng)所述OD6tltlnm值達(dá)到300 350每ImL時(shí)，進(jìn)行收集所述脂肪酶的步驟b)。
7.如權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟b)包括 bl)從所述培養(yǎng)液上清液中分離所述脂肪酶；以及 b2)純化步驟bl)中得到的脂肪酶。
8.如權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，采用從中空纖維切向過濾、正面過濾、和連續(xù)式或分批式離心中選出的技術(shù)來進(jìn)行所述分離，采用從過濾、分級(jí)沉淀、離子交換層析、疏水交互作用層析、和凝膠過濾層析中選出的技術(shù)來進(jìn)行所述純化。
9.一種被載體轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母細(xì)胞，所述載體包含酵母耐酸胞外脂肪酶的表達(dá)盒 其特征在于，所述細(xì)胞是名為YL-LIP2-6C的克隆，所述克隆于2005年12月15日保藏在法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心(C. N. C. M.)，保藏編號(hào)為1-3542。
10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞用于生產(chǎn)所述酵母耐酸脂肪酶的應(yīng)用。
全文摘要
用于生產(chǎn)解脂耶氏酵母耐酸重組體脂肪酶的方法，該方法利用的培養(yǎng)基除其使用的物質(zhì)外不含任何動(dòng)物來源的產(chǎn)物或未表征的混合物比如胰胨、蛋白胨或抗乳血清。可以生產(chǎn)過多量的脂肪酶Lip2的解脂耶氏酵母的重組菌株被稱作YL-LIP2-6C，該菌株于2005年12月15日保藏在法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏編號(hào)為I-3542，本文還涉及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/20GK102703404SQ20121006738
公開日2012年10月3日 申請日期2006年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月15日
發(fā)明者伊夫·勒布隆, 尼古拉斯·穆茲, 讓·路易·烏里韋拉雷亞, 阿蘭·馬蒂 申請人:法國米奧里大藥廠