專利名稱：一種重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶q10的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO的方法。
背景技術(shù)：
還原性輔酶QlO是ー種有效的抗氧化劑，其用途十分廣泛，發(fā)達(dá)國(guó)家除藥品外已廣泛用于食品添加、日化產(chǎn)品、保健品、化妝品等領(lǐng)域。它的藥效眾多，臨床已證實(shí)具有消除疲勞、增強(qiáng)體力、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用、緩節(jié)帕金森氏癥、治療和緩解神經(jīng)性 頭痛以及降低阿霉素或他汀類藥物副作用等之功效。還原性輔酶QlO和氧化性輔酶QlO是人體細(xì)胞中的線粒體電子傳導(dǎo)系統(tǒng)的構(gòu)成因子，在氧化磷酸化反應(yīng)中起到搬運(yùn)電子的功能，參與ATP的生成。以往大多數(shù)人都把氧化性輔酶QlO和還原性輔酶QlO混為ー談，其實(shí)還原性輔酶QlO才是真正具有生物活性的抗氧化體。氧化性必需轉(zhuǎn)換成還原性的CoQlO后才具有抗氧化能力。還原性輔酶QlO可以直接被人體利用，與氧化性輔酶QlO相比在人的新陳代謝中具有更高的生物利用率。近年來對(duì)還原性輔酶QlO的研究逐漸增多，目前其制作方法大致如下通過在DMEM-I培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得含有還原性輔酶QlO的細(xì)胞液[1]，此方法生產(chǎn)的輔酶QlO成本較高，含量也相對(duì)較低。采用化學(xué)合成法，但其合成過程煩雜、危險(xiǎn)，生產(chǎn)成本高，而且可靠性不高-必須最大限度地降低產(chǎn)生或混入異構(gòu)體[2]。使用天然生物酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。有專利報(bào)道，利用生物還原酶將氧化性輔酶QlO還原成還原性輔酶Q10，但這種方法要求使用純度大于99%的氧化性輔酶Q10[3]。另有報(bào)道，將輔酶QlO先磷酸化，再通過生物還原酶還原磷酸化的氧化性輔酶Q10，從而得到還原性輔SIqiom0在抗氧化條件下生產(chǎn)。采用氯化鈣-鎂-水(醇)還原體系，將氧化性輔酶QlO快速制備成還原性輔酶Q10[5]。在還原過程中使用至少ー種選自烴、脂肪酸酷、醚和腈的溶劑保護(hù)還原性輔酶QlO免受氧化作用[6]。這些方法效率低，含有較多的氧化性輔酶Q10，用已知的方法分離，回收還原輔酶QlO的成本很高。另外還有利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)還原性輔酶QlO的有關(guān)報(bào)道，篩選產(chǎn)還原性輔酶QlO微生物，得到含有70%以上摩爾含量的還原性菌株，然后利用化學(xué)誘變方法提高其產(chǎn)量。但是化學(xué)誘變法提高產(chǎn)量有限，且多次誘變才能達(dá)到一定效果，耗費(fèi)大量時(shí)間和精力利用基因工程理論改變細(xì)胞內(nèi)代謝調(diào)節(jié)機(jī)制也是獲得高產(chǎn)菌種的ー個(gè)重要方法。通過基因重組提高氧化性輔酶QlO產(chǎn)量的成功例子不在少數(shù)。Cheong等M將聚十異戊ニ烯焦磷酸(DPS)基因和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因一起插入載體pGPRXll中，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Agrobacterium tumefaciensBNQ-pGPRXlI- (KCCM-10554)中表達(dá)，得到氧化性輔酶QlO的高產(chǎn)菌，通過發(fā)酵エ藝優(yōu)化后產(chǎn)率達(dá)到6. 69mg/g，エ業(yè)化生產(chǎn)前景較好。
如上所述，目前尚無通過基因重組得到還原性輔酶QlO高產(chǎn)菌株的例子，更無利用重組還原性菌株進(jìn)行エ業(yè)規(guī)模發(fā)酵還原性輔酶QlO的報(bào)道。如果篩選到還原性輔酶QlO菌株，采用基因重組技術(shù)提高其生產(chǎn)能力，無疑對(duì)生產(chǎn)還原性輔酶Qio是非常有利的。本發(fā)明利用分子生物學(xué)技術(shù)找到還原性輔酶QlO生產(chǎn)菌株的關(guān)鍵酶基因，通過重組DNA技術(shù)篩選帶有目標(biāo)基因的細(xì)胞，將目的基因引入生產(chǎn)菌株(如酵母菌等)，增強(qiáng)合成目的產(chǎn)物的能力，構(gòu)建還原性輔酶QlO發(fā)酵重組菌株。利用重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶Q10，在從發(fā)酵物中回收還原性輔酶Q10，從而安全、高效地獲得エ業(yè)規(guī)模生產(chǎn)還原性性輔酶QlO的方法。本發(fā)明利用高比例還原性菌株(還原性輔酶QlO占70% (摩爾含量)以上)，如Rhodotorula glutinis IF01125、Saitoella complicate IF010748 擴(kuò)增生產(chǎn)還原性輔酶QlO的關(guān)鍵基因如2，3_ ニ甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因、聚十異戊ニ烯 焦磷酸(DPS)基因、I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，通過將帶有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至突變株中，隨著細(xì)胞中合成酶基因拷貝數(shù)的増加，可積累較大量的產(chǎn)物。即找出輔酶QlO合成過程中的關(guān)鍵酶基因，通過其強(qiáng)化表達(dá)就有可能提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO的方法，提高發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO的產(chǎn)量。本發(fā)明的目的還在于提供ー種生產(chǎn)還原性輔酶QlO的重組菌株。ー種重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO的方法，將生產(chǎn)還原性輔酶QlO的基因轉(zhuǎn)入還原性輔酶QlO比率達(dá)到70%以上的菌株，然后采用誘變技木，篩選還原性輔酶QlO比率達(dá)到90%以上的菌株，以還原性輔酶QlO比率達(dá)到90%以上的菌株為菌種，發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO ;所述還原性輔酶QlO比率是指還原性輔酶QlO占氧化性輔酶QlO和還原性輔酶QlO總和的摩爾百分比。所述生產(chǎn)還原性輔酶QlO的基因?yàn)?，3- ニ甲氧基-5-甲基_6_癸異戊烯基苯醌合成酶基因、聚十異戊ニ烯焦磷酸基因、I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因中的ー種或一種以上。所述還原性輔酶QlO比率達(dá)到70 %以上的菌株為Saitoellacomplicata (IF010748)> Rhodotorula glutinis(IF0 1125)、Agrobacteriumtumefacience (IFO 13263) > Agrobacterium radiobacter (ATCC47 I 8)、Aspergillus clavatus(JCM1718)、Acetobacter xylinum(IF015237)、Aminobacteraganouensis(JCM7854)、Agromonas oligotrophica(JCM1494)、Acidiphiliummultivorum(JCM8867)>Bulleromyces albus(IF01192)或Bullera armeniaca(IF010112)。所述誘變技術(shù)為化學(xué)試劑誘變、紫外線照射或離子光束照射。所述化學(xué)試劑誘變中的化學(xué)試劑為亞硝基胍、甲基磺酸こ酷、硫酸ニこ酯或6-溴尿嘧啶。ー種生產(chǎn)還原性輔酶QlO的重組菌株，該菌株的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 5668。本發(fā)明的重組菌株Rhodotorula glutinis已于2011年12月29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO. 5668保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是微生物發(fā)酵法，與其它制備方法相比，生產(chǎn)輔酶QlO具有不受原料限制，原料成本低，分離過程相對(duì)簡(jiǎn)単，不存在手性問題，易控制及可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，另外，隨著生活水平的提高，人們對(duì)純天然產(chǎn)品的崇尚日益増加，化學(xué)合成藥物已越來越不受歡迎。本發(fā)明的誘變技術(shù)可以提高輔酶QlO產(chǎn)量，但單次誘變提高的產(chǎn)量有限，且誘變不確定因素較多，使得篩選工作量巨大，多次誘變能達(dá)到一定效果，這樣更是耗費(fèi)大量時(shí)間和精力，基因重組是高產(chǎn)菌株的定向突變途徑，通過基因工程組建的高產(chǎn)菌株，再結(jié)合誘變進(jìn)ー步提高基因重組菌株的產(chǎn)能，能滿足エ業(yè)化生產(chǎn)的要求。


圖I為輔酶QlO的峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為還原性輔酶QlO和氧化性輔酶QlO的HPLC檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步說明。實(shí)施例II、Rhodotorula glutinis (IF0 1125)的基因重組操作步驟如下(I)克隆 Rhodotorula glutinis (IF0 1125) l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (dxslI)gene 和 decaprenyl diphosphate synthase (dps44)gene。(2)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物加入酶切位點(diǎn) BamHI 和 XhoI DXS up :5’-TTTGGATCCTTGACCGGAATGCCACAG-3，， DXSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGCCGGCGAAACCGAC-3’，DPSup : 5 ’-TTTGGATCCTTGCCGCGCAAGGCGTCA-3， DPSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGTTGAGACGCTCGAT-3，。(3)抽提 Rhodotorula glutinis (IFO 1125)基因組 DNA，通過 PCR 的方法擴(kuò)增出DXS和DPS基因。(4) DXS和DPS基因末端加A后與T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5a，挑克隆搖菌抽提質(zhì)粒獲得正確的重組質(zhì)粒，再用BamHI和XhoI酶切回收以上兩個(gè)基因片段。(5)用同樣的限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切原核表達(dá)載體PET_24_a和PGEX-6P-1，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶將DXS和DPS兩個(gè)基因片段分別與載體連接。(6)將連接產(chǎn)物分兩次轉(zhuǎn)化Rhodotorula glutinis (IFO 1125),通過氨節(jié)青霉素和卡那霉素抗性篩選后獲得DXS和DPS表達(dá)的重組菌株。2、重組高產(chǎn)菌株的誘變改良采用亞硝基胍(NTG)化學(xué)誘變劑，菌種在28°C，有氧培養(yǎng)48h，離心得到菌體，添加PH7. O磷酸緩沖液，再加入NTG并使其濃度達(dá)到200ug/mL，25°C靜置lh。再次離心后，將菌體用O. 9%的生理鹽水沖洗5次，再用O. 9%的生理鹽水懸浮。稀釋懸浮液，涂布于抗性平板和對(duì)照平板上，培養(yǎng)3d-5d。誘變之后，為快速篩選高產(chǎn)突變株，采用抗阿霉素和維生素K3的突變株，篩選具有較高還原性輔酶QlO生產(chǎn)能力的菌株(還原性輔酶QlO比率90%以上)。采用如下所述培養(yǎng)方法和測(cè)定方法來評(píng)價(jià)生產(chǎn)還原性輔酶QlO的能力
菌體培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g、胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g/L，ρΗ6· O)。發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、KH2P040. 5g、K2HP040. 5g、MgSO4. 7H20 0. 3g/L, pH6. 0)培養(yǎng)方法為將I環(huán)生長(zhǎng)良好的斜面種子接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28V，200r/min往復(fù)搖床培養(yǎng)24h (細(xì)菌)或48h (酵母)，然后取8mL種子液加入裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于28°C，200r/min往復(fù)搖床培養(yǎng)96h。提取檢測(cè)4500r/min離心30min,收集菌體,將得到的菌體用constant system的高壓細(xì)胞破碎儀(TSO. 75KW)，在80Mpa的破碎壓カ下破碎2次，調(diào)制菌體破碎液。加入異丙 醇和η-己烷，在40°C溫度下攪拌30分鐘，提取完后，靜置10分鐘，將上層分離，然后取上清液，旋蒸至干，5ml無水こ醇溶解，放置4°C過夜，過濾后待測(cè)。HPLC檢測(cè)含量淘析柱YMC-Pack4.6 X 250mm移動(dòng)相甲醇/こ醇=I I流速lml/min檢出UV275nm柱溫35°C進(jìn)樣20μ I持續(xù)時(shí)間還原性輔酶QlO 17. 5分鐘氧化性輔酶QlO 27. 91分鐘上述方法中輔酶QlO的峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖I所示，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得一株高輔酶QlO產(chǎn)量和高還原性輔酶QlO比率的菌株，該菌株酶QlO產(chǎn)量為33. 71mg/g菌液，還原性輔酶QlO比率為93%，還原性輔酶QlO和氧化性輔酶QlO的HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖2所
/Jn ο本實(shí)施例的重組菌株Rhodotorula glutinis已于2011年12月29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO. 5668保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。實(shí)施例2I、Agrobacterium radiobacter(ATCC4718)的基因重組操作步驟如下(I)克隆 Agrobacterium radiobacter (ATCC4718) l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase(dxs)gene 和 l-Deoxy-D-xylulose-D-phospnate reductoisomerase(dxr)gene o(2)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物加入酶切位點(diǎn) BamHI 和 XhoI DXSup :5’-TTTGGATCCTTGACCGGAATGCCACAG-3，, DXSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGCCGGCGAAACCGAC-3，, DXRup 5，-TTTGGATCCATGACGAATGCCAGTGAA-3， DXRdown 5，-TTTCTCGAGTCACGCGGCCTTTTCTTT-3，。(3)抽提 Agrobacterium radiobacter (ATCC4718)基因組 DNA,通過 PCR 的方法擴(kuò)增出DXS和DXR基因。(4) DXS和DXR基因末端加A后與T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5a，挑克隆搖菌抽提質(zhì)粒獲得正確的重組質(zhì)粒，再用BamHI和XhoI酶切回收以上兩個(gè)基因片段。
(5)用同樣的限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切原核表達(dá)載體PET_24_a和PGEX-6P-1，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶將DXS和DXR兩個(gè)基因片段分別與載體連接。(6)將連接產(chǎn)物分兩次轉(zhuǎn)化Agrobacterium radiobacter (ATCC4718),通過氨節(jié)青霉素和卡那霉素抗性篩選后獲得DSX和DPS表達(dá)的重組菌株。2、重組高產(chǎn)菌株的誘變改良采用亞硝基胍(NTG)化學(xué)誘變劑，菌種在28°C，有氧培養(yǎng)48h，離心得到菌體，添加PH7. O磷酸緩沖液，再加入NTG并使其濃度達(dá)到200ug/mL，25°C靜置lh。再次離心后，將菌體用O. 9%的生理鹽水沖洗5次，再用O. 9%的生理鹽水懸浮。稀釋懸浮液，涂布于抗性平板和對(duì)照平板上，培養(yǎng)3d-5d。誘變之后，為快速篩選高產(chǎn)突變株，采用抗阿 霉素和維生素K3的突變株，篩選具有較高還原性輔酶QlO生產(chǎn)能力的菌株(還原性輔酶QlO比率90%以上)。采用如下所述培養(yǎng)方法和測(cè)定方法來評(píng)價(jià)生產(chǎn)還原性輔酶QlO的能力菌體培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g、胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g/L，ρΗ6· O)。發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖1如、蛋白胨10g、酵母提取物5g、KH2P040. 5g、K2HP040. 5g,MgSO4. 7H20 0. 3g/L, pH6. 0)培養(yǎng)方法為將I環(huán)生長(zhǎng)良好的斜面種子接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28V，200r/min往復(fù)搖床培養(yǎng)24h (細(xì)菌)或48h (酵母)，然后取8mL種子液加入裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于28°C，200r/min往復(fù)搖床培養(yǎng)96h。提取檢測(cè)4500r/min離心30min,收集菌體,將得到的菌體用constant system的高壓細(xì)胞破碎儀(TSO. 75KW)，在80Mpa的破碎壓カ下破碎2次，調(diào)制菌體破碎液。加入異丙醇和η-己烷，在40°C溫度下攪拌30分鐘，提取完后，靜置10分鐘，將上層分離，然后取上清液，旋蒸至干，5ml無水こ醇溶解，放置4°C過夜，過濾后待測(cè)。HPLC檢測(cè)含量淘析柱YMC-Pack4.6 X 250mm移動(dòng)相甲醇/こ醇=I I流速lml/min檢出UV275nm柱溫35°C進(jìn)樣20μ I持續(xù)時(shí)間還原性輔酶QlO 17. 5分鐘氧化性輔酶QlO 27. 91分鐘上述方法中輔酶QlO的峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖I所示，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得一株高輔酶QlO產(chǎn)量和高還原性輔酶QlO比率的菌株，該菌株酶QlO產(chǎn)量為30. llmg/g菌液，還原性輔酶QlO比率為91%。實(shí)施例3I、Rhodotorula glutinis (IFO 1125)的基因重組操作步驟如下(I)克隆 Rhodotorula glutinis(IFO 1125)l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase(dxs)gene、 decaprenyl diphosphate synthase(dps)gene 和l-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase(dxr)gene。(2)設(shè)計(jì)三對(duì)引物加入酶切位點(diǎn) BamHI 和 XhoI DXS up :5’-TTTGGATCCTTGACCGGAATGCCACAG-3，， DXSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGCCGGCGAAACCGAC-3’，DPSup : 5 ’-TTTGGATCCTTGCCGCGCAAGGCGTCA-3， DPSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGTTGAGACGCTCGAT-3，, DXRup 5，-TTTGGATCCATGACGAATGCCAGTGAA-3， DXRdown 5，-TTTCTCGAGTCACGCGGCCTTTTCTTT-3，
o(3)抽提 Rhodotorula glutinis (IFO 1125)基因組 DNA，通過 PCR 的方法擴(kuò)增出DXS、DPS 和 DXR 基因。(4) DXS、DPS和DXR基因末端加A后與T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5a，挑克隆搖菌抽提質(zhì)粒獲得正確的重組質(zhì)粒，再用BamHI和XhoI酶切回收以上兩個(gè)基因片段。(5)用同樣的限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切原核表達(dá)載體PET_24_a和PGEX-6P-1，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶將DXS和DXR兩個(gè)基因片段連入載體PET_24_a，DPS基因片段與載體PGEX-6P-1連接。(6)將連接產(chǎn)物分三次轉(zhuǎn)化Rhodotorula glutinis (IFO 1125),通過氨節(jié)青霉素和卡那霉素抗性篩選后獲得DXS、DXR和DPS表達(dá)的重組菌株。2、重組高產(chǎn)菌株的誘變改良采用亞硝基胍(NTG)化學(xué)誘變劑，菌種在28°C，有氧培養(yǎng)48h，離心得到菌體，添加PH7. O磷酸緩沖液，再加入NTG并使其濃度達(dá)到200ug/mL，25°C靜置lh。再次離心后，將菌體用O. 9%的生理鹽水沖洗5次，再用O. 9%的生理鹽水懸浮。稀釋懸浮液，涂布于抗性平板和對(duì)照平板上，培養(yǎng)3d-5d。誘變之后，為快速篩選高產(chǎn)突變株，采用抗阿霉素和維生素K3的突變株，篩選具有較高還原性輔酶QlO生產(chǎn)能力的菌株(還原性輔酶QlO比率90%以上)。采用如下所述培養(yǎng)方法和測(cè)定方法來評(píng)價(jià)生產(chǎn)還原性輔酶QlO的能力菌體培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g、胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g/L，ρΗ6· O)。發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖1如、蛋白胨10g、酵母提取物5g、KH2P040. 5g、K2HP040. 5g,MgSO4. 7H20 0. 3g/L, pH6. 0)培養(yǎng)方法為將I環(huán)生長(zhǎng)良好的斜面種子接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28V，200r/min往復(fù)搖床培養(yǎng)24h (細(xì)菌)或48h (酵母)，然后取8mL種子液加入裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于28°C，200r/min往復(fù)搖床培養(yǎng)96h。提取檢測(cè)4500r/min離心30min,收集菌體,將得到的菌體用constant system的高壓細(xì)胞破碎儀(TSO. 75KW)，在80Mpa的破碎壓カ下破碎2次，調(diào)制菌體破碎液。加入異丙醇和η-己烷，在40°C溫度下攪拌30分鐘，提取完后，靜置10分鐘，將上層分離，然后取上清液，旋蒸至干，5ml無水こ醇溶解，放置4°C過夜，過濾后待測(cè)。HPLC檢測(cè)含量淘析柱YMC-Pack4.6 X 250mm移動(dòng)相甲醇/こ醇=I I流速lml/min
檢出UV275nm柱溫35°C進(jìn)樣20μ I持續(xù)時(shí)間還原性輔酶QlO 17. 5分鐘氧化性輔酶QlO 27. 91分鐘上述方法中輔酶QlO的峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖I所示，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得一株高輔酶QlO產(chǎn)量和高還原性輔酶QlO比率的菌株，該菌株酶QlO產(chǎn)量為38. 51mg/g菌液，還原性輔酶QlO比率為95%，
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權(quán)利要求
1.ー種重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO的方法，其特征在于，將生產(chǎn)還原性輔酶QlO的基因轉(zhuǎn)入還原性輔酶QlO比率達(dá)到70%以上的菌株，然后采用誘變技木，篩選還原性輔酶QlO比率達(dá)到90%以上的菌株，以還原性輔酶QlO比率達(dá)到90%以上的菌株為菌種，發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO ;所述還原性輔酶QlO比率是指還原性輔酶QlO占氧化性輔酶QlO和還原性輔酶QlO總和的摩爾百分比。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種重組菌株發(fā)酵 生產(chǎn)還原性輔酶QlO的方法，其特征在于，所述生產(chǎn)還原性輔酶QlO的基因?yàn)?，3- ニ甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因、聚十異戊ニ烯焦磷酸基因、I-脫氧D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因中的ー種或ー種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO的方法，其特征在干，所述還原性輔酶QlO比率達(dá)到70%以上的菌株為Saitoella complicata、Rhodotorulaglutinis、Agrobacterium tumefacience、Agrobacterium radiobacter、Aspergillusclavatus、Acetobacter xylinum、Aminobacter aganouensis、Agromonas oligotrophica、Acidiphilium multivorum、Bulleromyces albus 或 Bullera armeniaca。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO的方法，其特征在于，所述誘變技術(shù)為化學(xué)試劑誘變、紫外線照射或離子光束照射。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述ー種重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶QlO的方法，其特征在于，所述化學(xué)試劑誘變中的化學(xué)試劑為亞硝基胍、甲基磺酸こ酷、硫酸ニこ酯或6-溴尿嘧啶。
6.ー種生產(chǎn)還原性輔酶QlO的重組菌株，其特征在于，該菌株的保藏編號(hào)為CGMCCNO. 5668。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的一種重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶Q10的方法。該方法是將生產(chǎn)還原性輔酶Q10的基因轉(zhuǎn)入還原性輔酶Q10比率達(dá)到70％以上的菌株，然后采用誘變技術(shù)，篩選還原性輔酶Q10比率達(dá)到90％以上的菌株，以還原性輔酶Q10比率達(dá)到90％以上的菌株為菌種，發(fā)酵生產(chǎn)還原性輔酶Q10。本發(fā)明通過基因工程組建的高產(chǎn)菌株，再結(jié)合誘變進(jìn)一步提高基因重組菌株的產(chǎn)能，能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102676595SQ20121006732
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者黨珍, 李明, 糜軍 申請(qǐng)人:蘇州海吉亞生物科技有限公司