專(zhuān)利名稱(chēng)：一種通過(guò)dl-氨基酸去消旋化制備d-氨基酸的生物催化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及生物催化制備D-氨基酸的新工藝。特別是利用糞產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞催化DL-氨基酸去消旋化制備D-氨基酸的生物催化方法。
背景技術(shù)：
在自然界中，D-氨基酸是稀有的非蛋白源氨基酸，其數(shù)量約占已發(fā)現(xiàn)的300多種氨基酸的10%左右。隨著醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)D-氨基酸與某些疾病如白內(nèi)障、早年癡呆、腎臟病等密切相關(guān)。此外，D-氨基酸已越來(lái)越多地作為手性中間體用于手性藥物、手性農(nóng)藥以及手性食品添加劑的合成，在醫(yī)藥、農(nóng)藥和食品領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。D-氨基酸的制備方法主要包括化學(xué)法和生物法。化學(xué)法主要包括化學(xué)拆分法和化學(xué)不對(duì)稱(chēng)合成法。化學(xué)拆分法工藝路線復(fù)雜，拆分收率低。化學(xué)不對(duì)稱(chēng)合成采用價(jià)格昂貴的手性源、手性助劑或手性催化劑，得到的D-氨基酸光學(xué)純度不高。生物法包括生物拆分法、生物不對(duì)稱(chēng)合成法和生物去消旋化法。生物法具有過(guò)程簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高、副產(chǎn)物少、分離純化工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已成為D-氨基酸的主流生產(chǎn)技術(shù)。生物拆分法以?；?、脂肪酶等酶為生物催化劑對(duì)衍生的DL-氨基酸進(jìn)行拆分，D-氨基酸的理論收率為50%，涉及衍生、去衍生等步驟，工藝普適性差。生物不對(duì)稱(chēng)合成法如轉(zhuǎn)氨酶法以D-轉(zhuǎn)氨酶為生物催化劑，價(jià)格高昂的酮酸為原料、另一個(gè)D-氨基酸為氨供體，分離工藝相當(dāng)復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種光學(xué)純度高、分離工藝簡(jiǎn)單的D-氨基酸制備方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，一種通過(guò)DL-氨基酸去消旋化制備D-氨基酸的方法，以一種DL-氨基酸為原料，通過(guò)以下步驟獲得所述DL-氨基酸中的 D-對(duì)映體
a)細(xì)胞培養(yǎng)將糞產(chǎn)堿桿菌接種到培養(yǎng)基中，采用所述DL-氨基酸中的L-對(duì)映體作為誘導(dǎo)劑加入培養(yǎng)基中，30°C下培養(yǎng)24h，離心，獲得濕菌體；
b)細(xì)胞通透性處理采用丙酮對(duì)步驟a)所獲得的濕菌體處理5 20min，離心，用生理鹽水洗滌，獲得通透性細(xì)胞；
c)酶催化反應(yīng)將步驟b)所獲得的通透性細(xì)胞加入蒸餾水中，使其懸浮，加入所述原料，30°C下反應(yīng)24 72h，使原料DL-氨基酸中的L-對(duì)映體氧化脫氨形成酮酸；
d)D-氨基酸分離將步驟c)的反應(yīng)液離心以去除細(xì)胞，所獲得的離心液加入鹽酸酸化至pH2 3，濃縮至干，得D-氨基酸鹽酸鹽；將所述D-氨基酸鹽酸鹽溶于乙醇中，過(guò)濾，向?yàn)V液中加入環(huán)氧丙烷以脫除鹽酸，獲得D-氨基酸。生產(chǎn)工藝路線是
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)DL-氨基酸去消旋化制備D-氨基酸的方法，其特征在于以DL-氨基酸為原料，通過(guò)以下步驟獲得所述DL-氨基酸中的D-對(duì)映體a)細(xì)胞培養(yǎng)將糞產(chǎn)堿桿菌菌株接種到培養(yǎng)基中，采用所述DL-氨基酸中的L-對(duì)映體作為誘導(dǎo)劑加入培養(yǎng)基中，30°C下培養(yǎng)24h，離心，獲得濕菌體；b)細(xì)胞通透性處理采用丙酮對(duì)步驟a)所獲得的濕菌體處理5 20min，離心，用生理鹽水洗滌，獲得通透性細(xì)胞；c)酶催化反應(yīng)將步驟b)所獲得的通透性細(xì)胞加入蒸餾水中，使其懸浮，加入所述原料，30°C下反應(yīng)24 72h，使原料DL-氨基酸中的L-對(duì)映體氧化脫氨形成酮酸；d)D-氨基酸分離將步驟c)的反應(yīng)液離心除去細(xì)胞，所獲得的離心液加入鹽酸酸化至 pH2 3，濃縮至干，得D-氨基酸鹽酸鹽；將所述D-氨基酸鹽酸鹽溶于乙醇中，過(guò)濾，向?yàn)V液中加入環(huán)氧丙烷以脫除鹽酸，室溫下攪拌30min，過(guò)濾，固體用無(wú)水乙醇洗滌，烘干，得對(duì)映純D-氨基酸。
2.如權(quán)利要求I所述的一種通過(guò)DL-氨基酸去消旋化制備D-氨基酸的方法，其特征在于所述原料DL-氨基酸選自DL-丙氨酸、DL-亮氨酸、DL-纈氨酸、DL-蛋氨酸、DL-絲氨酸、DL-天冬氨酸、DL-谷氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-酪氨酸、DL-色氨酸、DL-賴氨酸或DL-鳥(niǎo)氨酸；其中步驟a)中，所述L-對(duì)映體是與所述原料具有相同R基的L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-蛋氨酸、L-絲氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、 L-賴氨酸或L-鳥(niǎo)氨酸。
3.如權(quán)利要求I所述的一種通過(guò)DL-氨基酸去消旋化制備D-氨基酸的方法，其特征在于步驟 a)中糞產(chǎn)堿桿菌菌株選自 Alcaligens faecali I. 767、I. 924、I. 1799、I. 7686、I.2006,1. 1837。
4.如權(quán)利要求I所述的一種通過(guò)DL-氨基酸去消旋化制備D-氨基酸的方法，其特征在于步驟b)中所述丙酮溶液的濃度為30%。
5.如權(quán)利要求I所述的一種通過(guò)DL-氨基酸去消旋化制備D-氨基酸的方法，其特征在于步驟c)中，所述原料濃度為O. 02 O. 2mol/L。
6.如權(quán)利要求I所述的一種通過(guò)DL-氨基酸去消旋化制備D-氨基酸的方法，其特征在于步驟d)中，所述環(huán)氧丙烷與DL-氨基酸的摩爾比為2 2. 4 I。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過(guò)DL-氨基酸去消旋化制備D-氨基酸的生物催化方法。以經(jīng)通透性處理后的糞產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞為生物催化劑，利用其中的L-氨基酸氧化酶在空氣存在下將DL-氨基酸的L-對(duì)映體特異性氧化脫氨為相應(yīng)的酮酸，D-對(duì)映體保留，同時(shí)利用共表達(dá)的過(guò)氧化氫酶分解反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫。本發(fā)明的方法避免了傳統(tǒng)拆分方法的衍生和去衍生步驟，具有過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉，產(chǎn)品光學(xué)純度高，環(huán)境友好的特點(diǎn)，適合D-氨基酸的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P41/00GK102586384SQ201210049258
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者何從林, 夏仕文, 徐紅梅, 方國(guó)蘭 申請(qǐng)人:重慶凱樂(lè)爾生物催化技術(shù)有限公司, 重慶郵電大學(xué)