專利名稱：一種雙重TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測黃病毒和甲病毒的非診斷性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙重TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測蚊蟲標本中黃病毒和甲病毒的非診斷性方法。
背景技術(shù)：
蟲媒病毒(arbovirus)是指通過吸血的節(jié)肢動物盯咬敏感的脊椎動物而引起的自然疫源性疾病及人獸共患病的一組病毒。主要集中在黃病毒科黃病毒屬、披膜病毒科甲病毒屬、呼腸孤病毒科和布尼亞病毒科，以黃病毒屬病毒對人類的危害最大。人、畜被攜帶病毒的節(jié)肢動物叮咬而感染，不但造成人類疾病和死亡，更會造成大批牲畜發(fā)病甚至死亡， 造成巨大經(jīng)濟損失，成為各國的公共衛(wèi)生問題。目前，蟲媒病毒鑒定的金標準是病毒分離，但因其操作繁瑣、技術(shù)難度大、耗時長、 實驗條件要求高、并存在嚴重的生物安全問題，在實際工作中難以推廣應(yīng)用。近年來應(yīng)用廣泛的常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR擴增(retro-transcript-PCR，RT-PCR)及實時熒光定量PCR(Real-time PCR)在蟲媒病毒的檢測方面發(fā)揮了重要作用。但是，目前使用的 RT-PCR、實時熒光PCR大多是針對某一種蟲媒病毒的檢測。本發(fā)明利用TaqMan探針實時熒光RT-PCR技術(shù),建立一種快速、敏感的檢測和篩選黃病毒屬和甲病毒屬病毒的方法，應(yīng)用于蟲媒病毒的監(jiān)測檢測。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種高通量快速檢測和篩選黃病毒、甲病毒的雙重TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測的非診斷性方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種雙重TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測黃病毒及甲病毒的非診斷性方法，該非診斷性方法包括設(shè)計了兩對引物和探針對待檢樣本進行實時定量檢測，兩對引物和探針序列分別為針對黃病毒序列中NS5基因設(shè)計的互補序列
Fla-F:5，- CAACATGATGGGRAARAG -3，F(xiàn)la-R:5，- CHAGRGCTTCRAACTCHAG-3’Fla-P:5，- FAM-CTCCVAGCCACATGTACCATAT-BHQI -3 ’針對甲病毒序列中NSl基因設(shè)計的互補序列
權(quán)利要求
1.一種雙重TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測黃病毒和甲病毒的非診斷性方法，其特征在于，該非診斷性方法包括設(shè)計了兩對引物和探針對待檢樣本進行實時定量檢測，兩對引物和探針序列分別為 針對黃病毒序列中NS5基因設(shè)計的互補序列
2.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述NS5基因的互補序列中探針連接的熒光基團為=FAM-BHQl，熒光探針5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端連接淬滅基團。
3.如權(quán)利要求2所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該淬滅基團為BHQl非熒光淬滅基團。
4.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述NSl基因的互補序列中探針連接的熒光基團為TXR-BHQ2，熒光探針5’端標記的熒光報告基團是TXR，3’端連接淬滅基團。
5.如權(quán)利要求4所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該淬滅基團為BHQ2非熒光淬滅基團。
6.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該非診斷性方法包括步驟1)樣本用裂解液和RNA抽提液處理，提取病毒RNA；2)實時熒光RT-PCR反應(yīng)，配制一定組分濃度的25u LPCR反應(yīng)體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中；3)將待測樣品加入到反應(yīng)體系中，進行擴增；4)收集熒光信號，檢測Ct值。
7.如權(quán)利要求6所述的非診斷性方法，其特征在于，所述實時熒光RT-PCR反應(yīng)的體系組分及其體積如下
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙重TaqMan探針實時熒光RT-PCR檢測黃病毒和甲病毒的非診斷性方法，該非診斷性方法包括針對黃病毒序列中NS5基因和甲病毒序列中NS1基因所設(shè)計的互補序列，對待檢樣本進行實時定量檢測，采用常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR擴增及實時熒光定量PCR技術(shù)，簡化了蟲媒病毒檢測過程，替代了操作復(fù)雜、技術(shù)難度大、試驗時間長的病毒分離技術(shù)，提高了檢測時的生物安全性，建立一種高通量快速、敏感的檢測與篩選黃病毒屬和甲病毒屬病毒的方法，并在蟲媒病毒的檢測方面發(fā)揮了重要作用。
文檔編號C12Q1/70GK102586480SQ20121004592
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者劉麗娟, 姚李四, 孫肖紅, 楊宇, 燕清麗, 王旺, 郭金金 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院