專利名稱：Sod-tat融合蛋白在制備防治放射損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合蛋白領(lǐng)域，更具體地涉及一種SOD-TAT融合蛋白在制備防治放射損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一，癌癥與心腦血管疾病和意外事故一起，構(gòu)成當(dāng)今世界所有國家三大死亡原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織((WHO) 和美國臨床腫瘤協(xié)會(huì)(ASCO)統(tǒng)計(jì)，每年全球總計(jì)約有1000多萬人患上癌癥，大約760萬人死于各種類型的癌癥。放射治療是殺滅腫瘤的行之有效的手段，承擔(dān)著2/3腫瘤病人的治療。但因放療產(chǎn)生的自由基引起的輻射損傷副作用大，嚴(yán)重削弱了機(jī)體局部和整體的抵抗力，患者往往會(huì)因?yàn)檫@些副作用的發(fā)生而被迫中斷放療。所以腫瘤放療副作用的防治將直接影響著放療能否持續(xù)，是決定最終能否徹底根治腫瘤的主要因素之一，日益受到人們的關(guān)注和重視。此外，隨著核技術(shù)在軍用和民用領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使得各國各種核與輻射事故時(shí)有發(fā)生，例如 2011年3月份由地震引發(fā)的日本福島核電站事故以及1986年4月蘇聯(lián)烏克蘭加盟共和國切爾諾貝利核電站事故等，軍隊(duì)的核武器作業(yè)人員、核潛艇乘員，醫(yī)療與工業(yè)用放射源的操作人員等時(shí)刻都有受到核輻射威脅的可能，一旦發(fā)生核事故，就可能造成急性放射病。放射通過細(xì)胞內(nèi)外水分子均裂直接產(chǎn)生的活性氧自由基和通過誘發(fā)巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)等作用間接產(chǎn)生的活性氧自由基，使組織細(xì)胞的氧化還原平衡破壞，產(chǎn)生氧化脅迫， 直接損傷蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子，或擾亂細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，對(duì)組織細(xì)胞造成可逆或不可逆的損傷。雖然自由基的壽命極短(平均10_5 s)，但由于自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的存在，使得自由基在相互轉(zhuǎn)換過程中，細(xì)胞和機(jī)體的自由基和自由基反應(yīng)以及自由基反應(yīng)的有害產(chǎn)物，在較長時(shí)間內(nèi)保持高水平，而這些自由基會(huì)隨著血液和淋巴液的循環(huán)而遍布周身，對(duì)局部腫瘤以外的其它正常組織和器官造成損傷。從而產(chǎn)生了一系列的臨床放療副作
RR [1-3] Ztj 。截至目前，在現(xiàn)有的抗氧化型放射防護(hù)劑中，已經(jīng)應(yīng)用于臨床的放射防護(hù)劑有阿米福汀和超氧化物歧化酶(SOD)。阿米福汀又名WR-2721，是人工合成的巰基類合成物，99 年被批準(zhǔn)用于頭頸癌放療引起的口干，但其價(jià)格昂貴，國產(chǎn)注射液每支(0.4 mg)售價(jià)高，且具有較大的毒性，會(huì)使大部分患者出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐、等不良反應(yīng)M。SOD是一種十分重要的胞內(nèi)酶，它能催化體內(nèi)不同來源的超氧陰離子(02_)生成氧氣(O2)和過氧化氫(H2O2), 過氧化氫可在過氧化物酶或過氧化氫酶的作用下進(jìn)一步生成水(吐0)和氧氣，有保護(hù)生化系統(tǒng)免受超氧陰離子自由基毒性的作用[5]。早在70年代中期，人們就發(fā)現(xiàn)了 Cu，Zn-SOD 的防輻射作用[6]，但SOD在體內(nèi)的半衰期較短，一般只有7-10分鐘[5]，這大大影響了 SOD的藥用效果。目前，國內(nèi)外主要采取的方法包括對(duì)SOD分子進(jìn)行修飾，如對(duì)SOD氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾、用水溶性的大分子(如聚乙二醇[7]，牛血清白蛋白[8]等)對(duì)SOD進(jìn)行共價(jià)修飾，構(gòu)建SOD脂質(zhì)體等M。經(jīng)修飾的SOD雖然能延長其在血液中的半衰期，但由于超氧自由基產(chǎn)于組織中、細(xì)胞內(nèi)，僅僅提高SOD在血中的水平只能去除部分自由基，仍屬于治標(biāo)不治本。 此外，Epperly等證明氣管內(nèi)注射Mn-SOD質(zhì)粒-脂質(zhì)體和Mn-SOD腺病毒基因治療可以減弱肺損傷、提高小鼠生存率[1°_12]。Rabbani和康等也證明，過表達(dá)EC-SOD的轉(zhuǎn)基因小鼠似乎可防止放射引起的慢性肺損傷[13’14]。但這些方法都無法應(yīng)用到人類身上。在藥物治療的研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)某些藥物之所以沒有達(dá)到療效，并不是藥物沒有治療的效果，而是藥物根本就沒有到達(dá)其作用組織或細(xì)胞靶位。由于組織和細(xì)胞的選擇透過性，藥物不能通過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的作用部位與目標(biāo)分子相結(jié)合，從而喪失療效。既然自由基是由于水分子的電離輻射和巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)等作用產(chǎn)生的，不僅存在于細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)的量也不少，只清除細(xì)胞外的自由基，自然無法根治放射損傷。因此， SOD雖是人所盡知的自由基清除劑，但受其大小及其它特性的嚴(yán)格限制，無法透過細(xì)胞膜， 無論采取現(xiàn)有的口服還是注射的給藥方式，都很難被非破壞性地導(dǎo)入活細(xì)胞中，無論如何修飾，用量多大，其放射防護(hù)效應(yīng)都達(dá)不到人們的期望值。Tat (trans-activator transcription)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(Protein transduction domain, PTD)的發(fā)現(xiàn)，帶來了設(shè)想成真的曙光。Tat的核心序列由YGRKKRRQRRR 11個(gè)氨基酸組成。這11個(gè)氨基酸組成的TAT跨膜肽不但自身可以跨膜進(jìn)入細(xì)胞而且能把與它通過化學(xué)法交聯(lián)或基因工程法融合的其它超過50種的蛋白和其它外源藥物帶入細(xì)胞，甚至可以穿越血腦屏障，進(jìn)入腦組織，更為重要的是很多的外源高分子蛋白仍然保持其生物活性[15]。
我們采用基因重組技術(shù)，根據(jù)Genbank中人銅鋅超氧化物歧化酶(hCu，Ζη-SOD)的基因序列，構(gòu)建了融合SOD和TAT的表達(dá)質(zhì)粒，并在畢赤酵母中得到高效表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種SOD-TAT融合蛋白在制備防治放射損傷藥物中的應(yīng)用， 以彌補(bǔ)單純SOD的不足。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
本發(fā)明所述SOD-TAT融合蛋白的制備方法為采用基因重組技術(shù)，根據(jù)Genbank中人銅鋅超氧化物歧化酶的基因序列，將跨膜肽TAT融合SOD的C端，形成一個(gè)新蛋白S0D-TAT，構(gòu)建融合SOD和TAT的表達(dá)質(zhì)粒，在畢赤酵母中得到高效表達(dá)，最后從畢赤酵母的發(fā)酵液中提取SOD-TAT融合蛋白；所述SOD-TAT融合蛋白用于制備防治放射損傷藥物。所述SOD-TAT融合蛋白的使用濃度為2000-8000 U/ml ；將無菌過濾過的S0D-TAT 融合蛋白以無菌的PBS或生理鹽水稀釋至使用濃度。所述藥物的給用方式為注射或口服。使用方法為放射前池進(jìn)行肌肉注射或靜脈注射。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)
(1)本發(fā)明證實(shí)SOD-TAT可使大分子量的SOD跨膜深入細(xì)胞內(nèi)部，徹底消除細(xì)胞內(nèi)、外的自由基，既治標(biāo)又治本。(2)本發(fā)明證實(shí)SOD-TAT不僅能跨膜深入細(xì)胞內(nèi)部，還能跨越血腦屏障，到達(dá)腦組
幺口
/Ν ο本發(fā)明藥物的具體用途
(1)可用于預(yù)防或減弱癌癥患者因放療引起的副作用，如放射性肺損傷、放射性造血系統(tǒng)損傷以及放射性肝損傷等。(2)可用于醫(yī)療與工業(yè)用放射源的操作人員等日常預(yù)防放射損傷，例如檢修核工業(yè)設(shè)備時(shí)和搶救輻射事故病人。(3)可用于宇航人員預(yù)防太空的宇宙射線傷害。本發(fā)明藥物的藥理作用
本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，使人源的SOD的C端連接上一段具有跨膜功能的短肽TAT， 形成SOD-TAT融合蛋白，TAT使SOD可跨膜進(jìn)入細(xì)胞，因此，SOD-TAT不僅可消除細(xì)胞外的自由基，還可消除細(xì)胞內(nèi)的自由基，此外，SOD-TAT還可以跨越血腦屏障，其放射防護(hù)效果的深度和廣度遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于現(xiàn)有臨床使用的放射防護(hù)劑。


圖1 SOD-TAT對(duì)L_02細(xì)胞克隆形成能力的保護(hù)效果； 圖2 SOD-TAT對(duì)受照鼠體重增長率的保護(hù)效果；
圖3 SOD-TAT對(duì)受照鼠肺羥脯氨酸含量的影響；與正常組相比，’ < 0.01 ；與放射對(duì)照組相比，杯P < 0. 05，< 0. 01。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 對(duì)正常細(xì)胞的放射防護(hù)作用
(一)、SOD-TAT對(duì)L-02細(xì)胞克隆形成能力的保護(hù)效果 1、細(xì)胞株
人正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞株，購自中科院上海細(xì)胞所。2、操作
取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞分散充分，使單個(gè)細(xì)胞百分率大于90% ； 準(zhǔn)確計(jì)數(shù)好后用含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液充分混勻，分裝到規(guī)格相同的培養(yǎng)瓶，正常組未給藥未放射，其他各組均用2 Gy X射線進(jìn)行照射，放射對(duì)照組放射前未給藥，SOD-TAT (構(gòu)建融合SOD和TAT的表達(dá)質(zhì)粒，在畢赤酵母中得到高效表達(dá)，最后通過離子交換從畢赤酵母的發(fā)酵液中提取高純度的SOD-TAT融合蛋白)作用組放射前3 h分別加入S0D-TAT，天然 SOD組放射前3 h分別加入天然S0D，阿米福汀組放射前0.5 h加入阿米福汀，使之終濃度為4 μ g/ml阿米福汀，細(xì)胞與直線加速器源物距為lm，單次放射。照射后準(zhǔn)確分裝到直徑 3cm小培養(yǎng)皿中，每個(gè)小培養(yǎng)皿細(xì)胞懸液量為4 ml，每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)三個(gè)平行。小培養(yǎng)皿放在大培養(yǎng)皿中置于37 1含5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d。取出小培養(yǎng)皿，倒掉上清，將其倒扣在濾紙上，晾干，加甲醇固定10 min，棄固定液，加適量吉姆薩染料溶液鋪滿染色5 min，倒掉染料液，用鑷子夾住小培養(yǎng)皿在自來水中輕輕地充分清洗一次，棄盡自來水后倒扣在濾紙上晾干。肉眼計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的集落數(shù)。克隆接種率PE (plating efficiency)=(正常組克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))X 100%。存活分?jǐn)?shù)(surviving fraction，SF)=處理后克隆數(shù)/ (接種細(xì)胞數(shù)XΡΕ) X 100%。3、統(tǒng)計(jì)分析采用excel 2003中的Student，s t_檢驗(yàn)。4、結(jié)果
由圖1可以看出，天然SOD給藥劑量在2000 U/ml以上才開始對(duì)受照L-02細(xì)胞的克
5隆形成能力有保護(hù)作用，其最高可使受照L-02細(xì)胞的克隆形成能力提高33. 3%，現(xiàn)有臨床用藥阿米福汀使受照L-02細(xì)胞的克隆形成能力提高42. 6%，SOD-TAT給藥劑量在250 U/ml 的低劑量就對(duì)受照L-02細(xì)胞的克隆形成能力有保護(hù)作用，預(yù)給藥4000、6000和8000 U/ml SOD-TAT可使受照L-02細(xì)胞的克隆形成能力分別提高55. 6%，63. 3%和63. 3%，其保護(hù)效果比阿米福汀好的多。實(shí)施例2 對(duì)胸腔放射小鼠放射性肺損傷的防護(hù)作用 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
雄性C57BL/6小鼠，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司繁殖，清潔級(jí)。體重為18-21 g。 自由飲水和進(jìn)食，飼料為專用輻照料。定時(shí)排風(fēng)。照射前飼養(yǎng)三天無異常。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK (滬)2007-0005，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件合格證號(hào)為SYXK (軍)2007-031。2、照射條件和實(shí)驗(yàn)分組
將試驗(yàn)用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組正常對(duì)照組(未給藥未放射)、放射對(duì)照組(只放射未給藥)、阿米福汀組(150 mg/kg)(放射前30 min注射)、SOD-TAT組(6000 U/ml)(放射前3 h注射)。X射線6 MeV (IEC 61217)胸腔一次性照射，劑量率300 mU/min, 12 Gy，源皮距為100 cm。照射后普通喂養(yǎng)5 m。3、檢測指標(biāo) 3. 1小鼠體重變化
小鼠放射前稱一次原始體重，放射后，每個(gè)月稱一次小鼠體重，計(jì)算體重增長率。3. 2肺纖維化程度(羥脯氨酸含量)
用頸椎脫臼法處置小鼠，稱重后，摘取小鼠的左肺，以生理鹽水制成10%勻漿，用用南京建成的試劑盒測定羥脯氨酸含量。3. 3肺抗氧化指標(biāo)分析
處置動(dòng)物后，取右肺，以生理鹽水制成10%勻漿，用南京建成的試劑盒測定SOD、GSH、 T-AOC和總蛋白。4、統(tǒng)計(jì)分析采用excel 2003中的Student，s t_檢驗(yàn)。5、結(jié)果
由圖2可以看出，與正常對(duì)照組相比，放射對(duì)照組小鼠體重的月增長率降低。與放射對(duì)照組相比，預(yù)給藥阿米福汀使受照鼠體重的月增長率基本無保護(hù)作用，預(yù)給藥SOD-TAT則可提高受照鼠體重的月增長率。由圖3可以看出，與正常對(duì)照組相比，放射對(duì)照組小鼠肺羥脯氨酸含量顯著上升， 與放射對(duì)照組相比，預(yù)給藥阿米福汀使受照鼠的肺羥脯氨酸含量降低了 17. 00% (P<0. 05)， 預(yù)給藥SOD-TAT使受照鼠的肺羥脯氨酸含量降低了 20. 08% (P<0. 01)。表1 SOD-TAT對(duì)受照鼠肺抗氧化體系的保護(hù)效果
權(quán)利要求
1.SOD-TAT融合蛋白在制備防治放射損傷藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述SOD-TAT融合蛋白的制備方法為采用基因重組技術(shù)，根據(jù)Genbank中人銅鋅超氧化物歧化酶的基因序列，將跨膜肽TAT融合SOD的C端，形成一個(gè)新蛋白S0D-TAT，構(gòu)建融合SOD和TAT的表達(dá)質(zhì)粒，在畢赤酵母中得到高效表達(dá)，最后從畢赤酵母的發(fā)酵液中提取SOD-TAT融合蛋白；所述SOD-TAT融合蛋白用于制備防治放射損傷藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SOD-TAT融合蛋白在制備防治放射損傷藥物中的應(yīng)用，其特征在于=SOD-TAT融合蛋白的使用濃度為2000-8000 U/ml ；將無菌過濾過的SOD-TAT融合蛋白以無菌的PBS或生理鹽水稀釋至使用濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的SOD-TAT融合蛋白在制備防治放射損傷藥物中的應(yīng)用， 其特征在于所述藥物的給用方式為注射或口服。
全文摘要
本發(fā)明涉及融合蛋白領(lǐng)域，更具體地涉及一種SOD-TAT融合蛋白在制備防治放射損傷藥物中的應(yīng)用。所述SOD-TAT融合蛋白的制備方法為采用基因重組技術(shù)，根據(jù)Genbank中人銅鋅超氧化物歧化酶的基因序列，將跨膜肽TAT融合到SOD的C端，形成一個(gè)新蛋白SOD-TAT，構(gòu)建融合SOD和TAT的表達(dá)質(zhì)粒，在畢赤酵母中得到高效表達(dá)，最后通過離子交換從畢赤酵母的發(fā)酵液中提取高純度的SOD-TAT融合蛋白；所述SOD-TAT融合蛋白用于制備防治放射損傷藥物。SOD-TAT不僅可消除細(xì)胞外的自由基，還可消除細(xì)胞內(nèi)的自由基，此外，SOD-TAT還可以跨越血腦屏障，其放射防護(hù)效果的深度和廣度遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于現(xiàn)有臨床使用的放射防護(hù)劑。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102526712SQ20121000710
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者劉樹滔, 潘劍茹, 鄭光進(jìn), 饒平凡 申請人:福州大學(xué)