光活化嵌合視蛋白及其使用方法
【專利摘要】本文提供包含在質(zhì)膜上表達(dá)的光活化嵌合蛋白的組合物；和使用所述組合物來(lái)選擇性地使興奮性或抑制性神經(jīng)元去極化的方法。
【專利說(shuō)明】光活化嵌合視蛋白及其使用方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求于2010年11月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/410，736 ;于2010年11月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/410，744;以及于2011年7月26日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/511，912的優(yōu)先權(quán)，這些專利申請(qǐng)各自的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式全部并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本申請(qǐng)涉及包含在質(zhì)膜上表達(dá)光活化嵌合蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的組合物；和使用所述組合物來(lái)選擇性地使存在于前額葉皮質(zhì)中的相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元去極化的方法。
[0004]背景
[0005]對(duì)大多數(shù)精神病障礙的神經(jīng)生理學(xué)底物的了解不多，盡管關(guān)于與復(fù)雜的行為表型，如在孤獨(dú)癥和精神分裂癥中所觀察到的那些表型相關(guān)的遺傳因素的信息快速涌現(xiàn)(Cichon 等，The American Journal of Psychiatryl66(5):540(2009) ;0，Donovan等，Human Geneticsl26 (I): 3 (2009))。一個(gè)正顯露的值得注意的原則是極為廣泛的看起來(lái)似乎不相關(guān)的遺傳異?？梢砸鹜活悇e的精神病表型(如社會(huì)行為機(jī)能障礙^olstein和Rosen-Sheidley, Nature Reviews2 (12):943(2001))。這個(gè)出人意料的型態(tài)指出需要鑒別出可以在普通病理生理學(xué)原則下統(tǒng)一不同的遺傳因素的簡(jiǎn)化回路級(jí)(circuit-level)見(jiàn)解。
[0006]一種這樣的回路級(jí)假設(shè)是皮質(zhì)細(xì)胞的興奮與抑制的比率(細(xì)胞的E/I平衡)提高可以引起孤獨(dú)癥的社會(huì)性和認(rèn)知性缺陷(Rubenstein, CurrentOpinion in Neurology23 (2): 118 ；Rubenstein 和 Merzenich,Genes,Brain,andBehavior2 (5): 255 (2003))。這種假設(shè)可以潛在地統(tǒng)一大量不同的病理生理學(xué)證據(jù)，包括觀察到許多孤獨(dú)癥相關(guān)基因與離子通道和突觸蛋白的功能獲得性表型有關(guān)(Bourgeron, Current Opinion in Neurobiologyl9 (2), 231 (2009))并且約 30% 的孤獨(dú)癥患者還表現(xiàn)出臨床上明顯的癲癇發(fā)作(Gillberg和Billstedt, Acta PsychiatricaScandinavica，102(5):321 (2000))。然而，還不清楚此種不平衡(與疾病癥狀相關(guān)的)是可以在長(zhǎng)期(例如在發(fā)展過(guò)程中)還是在短期時(shí)間跨度上操作。此外，這種假設(shè)并未得到普遍接受，部分是因?yàn)樗€不易于直接測(cè)試。在社會(huì)性和認(rèn)知性任務(wù)期間，無(wú)論在臨床環(huán)境中還是在自由行為的實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物中，藥理學(xué)和電學(xué)的干預(yù)缺乏必要的特異性來(lái)選擇性地促進(jìn)新皮質(zhì)興奮性細(xì)胞而非抑制性細(xì)胞的活性(以根本不同于受體調(diào)節(jié)的方式)。這也許涉及到多種挑戰(zhàn)，如已證明孤獨(dú)癥和精神分裂癥的社會(huì)性和認(rèn)知性缺陷對(duì)于臨床中的常規(guī)精神藥理學(xué)治療基本上無(wú)反應(yīng)。
[0007]光遺傳學(xué)是遺傳學(xué)方法和光學(xué)方法的組合，被用來(lái)控制活組織(甚至是自由移動(dòng)的哺乳動(dòng)物和其它動(dòng)物體內(nèi)的活組織)的靶細(xì)胞中的特定事件，具有為比肩功能完整的生物系統(tǒng)所需要的時(shí)間精確度(毫秒時(shí)間跨度)。光遺傳學(xué)的特點(diǎn)是將快速光活化通道蛋白引入靶神經(jīng)元細(xì)胞的質(zhì)膜，從而允許在時(shí)間上精確地操縱神經(jīng)元膜電位同時(shí)通過(guò)使用特異性靶向機(jī)制來(lái)維持細(xì)胞類型解析?？梢杂脕?lái)研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能的微生物視蛋白包括被用來(lái)促進(jìn)響應(yīng)于光的去極化的視紫紅質(zhì)通道蛋白(ChR2、ChRU VChRl、以及SFO)。在短短的幾年中，光遺傳學(xué)領(lǐng)域已深化了對(duì)特定細(xì)胞類型如何在活體內(nèi)促進(jìn)生物組織(如神經(jīng)回路)的功能的基礎(chǔ)性科學(xué)理解。此外，在臨床方面，光遺傳學(xué)帶動(dòng)的研究使得對(duì)帕金森氏(Parkinson's)病和其它神經(jīng)障礙和精神病障礙獲得了深入了解。
[0008]然而，現(xiàn)有的用于探究皮質(zhì)E/Ι平衡的比率提高可能與孤獨(dú)癥和其它障礙(如精神分裂癥)的社會(huì)性和認(rèn)知性缺陷相關(guān)的假設(shè)的光遺傳學(xué)工具存在限制。常規(guī)的視紫紅質(zhì)通道蛋白光電流展現(xiàn)出顯著的脫敏作用，這妨礙了 E/Ι平衡的階梯狀變化的產(chǎn)生(轉(zhuǎn)為要求斜坡或脈沖，這將不適合用于研究細(xì)胞的E/Ι平衡的穩(wěn)定變化)；此外，SFO和常規(guī)的ChR兩者均由藍(lán)光驅(qū)動(dòng)，這妨礙了驅(qū)動(dòng)不同回路元件(如興奮性和抑制性神經(jīng)元)群體的作用的制劑內(nèi)比較。因此，需要允許操縱皮質(zhì)E/Ι平衡和監(jiān)測(cè)皮質(zhì)切片中的Y振蕩的工具，以便容許研究這些操縱如何影響存在于前額葉皮質(zhì)中的相同微回路中的下游神經(jīng)元。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本文提供一種組合物，其包含嵌合光活化蛋白陽(yáng)離子通道，當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，所述嵌合光活化蛋白陽(yáng)離子通道能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。
[0011]本文提供包含在細(xì)胞膜上表達(dá)的光活化蛋白的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述蛋白是(a)來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻(Volvox carteri)的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardti)的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列；(b)對(duì)光可響應(yīng)；并且(c)當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是分離的或在細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0012]本文還提供包含在細(xì)胞膜上表達(dá)本文所描述的嵌合蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞群。本文還提供包含在細(xì)胞膜上表達(dá)本文所描述的嵌合蛋白的細(xì)胞的非人動(dòng)物和腦組織切片。
[0013]本文提供包含編碼在細(xì)胞膜上表達(dá)的光活化蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列；對(duì)光可響應(yīng)；并且當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。還提供包含所述多核苷酸的載體(如表達(dá)載體)。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是病毒載體(例如，AAV載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體、或慢病毒載體)。
[0014]本文還提供使用在細(xì)胞膜上表達(dá)本文所描述的嵌合蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括用光活化所述嵌合蛋白。
[0015]本文還提供選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元去極化的方法，所述方法包括:選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經(jīng)元去極化，其中所述第一光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第一波長(zhǎng)的光時(shí)被去極化；或選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經(jīng)元去極化，其中所述第二光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第二波長(zhǎng)的光時(shí)被去極化。在一些實(shí)施方案中，所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，其中所述第一光活化蛋白包含與SEQ ID NO: K SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5或SEQ ID N0:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
[0016]一種選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元去極化的方法，所述方法包括:在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)第一光活化蛋白；并且在抑制性神經(jīng)元中表達(dá)第二光活化蛋白，其中所述第一光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第一波長(zhǎng)的光時(shí)被獨(dú)立地去極化，并且其中所述第二光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第二波長(zhǎng)的光時(shí)被獨(dú)立地去極化。在一些實(shí)施方案中，所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述第一光活化蛋白包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
[0017]本文還提供用于鑒別選擇性地抑制存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元的去極化的化合物的方法，所述方法包括:(a)用具有第一波長(zhǎng)的光選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經(jīng)元去極化，或用具有第二波長(zhǎng)的光選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經(jīng)元去極化；(b)測(cè)量響應(yīng)于選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經(jīng)元去極化的興奮性突觸后電位(EPSP)，或測(cè)量響應(yīng)于選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經(jīng)元去極化的抑制性突觸后電流(IPSC) ；(c)使興奮性神經(jīng)元或抑制性神經(jīng)元與化合物接觸；(d)測(cè)量興奮性突觸后電位(EPSP)或測(cè)量抑制性突觸后電流(IPSC)以確定使興奮性神經(jīng)元或抑制性神經(jīng)元與化合物接觸是否選擇性地抑制任一神經(jīng)元的去極化。在一些實(shí)施方案中，所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述第一光活化蛋白包含與SEQ ID NO: K SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5或SEQ IDNO:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與SEQID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少 95% 相同的氨基酸序列。
[0018]應(yīng)理解，可以將本文描述的不同實(shí)施方案的一種、一些或全部特性進(jìn)行組合以形成本發(fā)明的其它實(shí)施方案。本發(fā)明的這些和其它方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。
[0019]附圖簡(jiǎn)述
[0020]圖1描繪了用于組合性光遺傳學(xué)的改進(jìn)型紅移視紫紅質(zhì)通道蛋白的工程化。(a)用受CaMKIIa啟動(dòng)子控制的VChRl_eYFP或ClVl_eYFP轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的共焦圖像。方框表示最后一幅圖中放大的區(qū)域，其示出CIVl-tsYFP的樹(shù)突狀膜定位。比例尺:20ym(&)，4ym(S)。(b)來(lái)自表達(dá)指定視蛋白的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中的全細(xì)胞膜片鉗記錄的峰值光電流。(c) ChRl、ChR2以及VChRl的序列比對(duì)。指出兩種ClVl變異體的剪接位點(diǎn)。推定跨膜螺旋1-7(ΤΜ1-7)用條欄指示；突變的氨基酸用灰色指示。(d)在表達(dá)ClVl剪接變異體I和2的HEK細(xì)胞中所記錄的光電流振幅。(e)用與EYFP融合的指定視蛋白轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的單個(gè)共焦平面圖像。DNA濃度在構(gòu)建體間匹配。(f)ChR2、VChRl、ClVlwtXlV(E122T) ,ClVl (E162T)、以及 ClVl (E122T/E162T)的作用譜。在 HEK293 細(xì)胞中，用2ms光脈沖來(lái)收集光電流。(g)ClVl剪接變異體I的離子滲透，所述離子滲透是使用陽(yáng)離子分離外部溶液通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗在HEK細(xì)胞中在_40mV下測(cè)得的光電流幅值所測(cè)量。將數(shù)據(jù)歸一化為最大峰值Na電流。(h)ClVl嵌合體的示意圖，其中點(diǎn)突變位置用白色指示。ChRl序列用黑色指示；VChRl序列用灰色指示。
[0021]圖2描繪了測(cè)試用于組合光遺傳學(xué)的改進(jìn)型紅移視紫紅質(zhì)通道蛋白。(a)表達(dá)指定視蛋白的培養(yǎng)神經(jīng)元中的通道閉合時(shí)間常數(shù)的代表性跡線和匯總圖線(summary plot);將跡線歸一化為峰值電流。(b) C1V1-E122T鈍化與ChR2去活的比較。(c)ClVl雙重變異體E122T/E162T與其它ClVl變異體中的電流鈍化的比較。(d)在表達(dá)指定視蛋白的培養(yǎng)神經(jīng)元中所記錄到的響應(yīng)于2ms542nm光脈沖的平均峰值光電流。
[0022]圖3描繪了在前額葉錐體神經(jīng)元中進(jìn)行短期切片記錄獲得的光電流。(a)峰值光電流顯示始終與積分熒光強(qiáng)度相關(guān)。(b)ChR2(H134R)與ClVl (E122T/E162T)中的熒光-光電流關(guān)系。黑色線是對(duì)數(shù)據(jù)的線性擬合。(c)在用指定頻率的560nm光脈沖列或電流注入所刺激的前額葉錐體神經(jīng)元中進(jìn)行的短期切片記錄。匯總圖形示出了群數(shù)據(jù)(n=6)。(d)在指定波長(zhǎng)和光功率密度下，成功尖峰相對(duì)于電流注入(200pA，IOms脈沖；左上)或2ms光脈沖的分?jǐn)?shù)。所有脈沖列由20 X 2ms脈沖組成，所述脈沖通過(guò)使用薩特(Sutter) DG-4光源的顯微鏡物鏡遞送、使用20nm帶通濾光片和額外的中性密度濾光片過(guò)濾以使光功率減弱(在2種切片中n=6個(gè)細(xì)胞)。(e)在表達(dá)C1V1-E122T或C1V1-E122T/E162T的細(xì)胞中的電壓鉗對(duì)542nm和630nm光脈沖的響應(yīng)(上部)。在表達(dá)C1V1-E122T的細(xì)胞中的電流鉗記錄顯示響應(yīng)于3.2mff ι?π 2下的50ms630nm光的5Hz列的尖峰(底部)。(f)ClVl (E122T)中的紅光響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。在540nm和630nm下，從表達(dá)C1V1(E122T)的培養(yǎng)神經(jīng)元中記錄到的光電流的活化時(shí)間常數(shù)(τ 。應(yīng)注意，光功率在630nm下是3.2mff mm-2并且在540nm下是
7.7mW mm2(n=5個(gè)細(xì)胞，ρ=0.0006成對(duì)t-檢驗(yàn))。(g)電壓鉗跡線顯示在表達(dá)ClVl (E122T)的神經(jīng)元中對(duì)630nm光脈沖的響應(yīng)。脈沖長(zhǎng)度指示于跡線上方。從150ms跡線計(jì)算出的τ活化是67ms。(h)來(lái)自表達(dá)ClVl (E122T)的神經(jīng)元的電流鉗記錄，顯示在630nm下由50ms脈沖(功率密度3.2mff mm 2)引發(fā)的尖峰。
[0023]圖4描繪了興奮性錐體神經(jīng)元和表達(dá)小白蛋白的抑制性細(xì)胞的獨(dú)立活化。(a)響應(yīng)于560nm或405nm下的2ms光脈沖(5Hz ;在兩個(gè)波長(zhǎng)下7.6mff/mm2),由表達(dá)C1V1(E122T/E162T)或ChR2(H134R)的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元得到的電流鉗記錄。(b)在皮質(zhì)錐體神經(jīng)元中表達(dá)CIVI并且在抑制性小白蛋白陽(yáng)性中間神經(jīng)元中表達(dá)ChR2 (H 134R)的雙重注射動(dòng)物中的記錄配置。為了獨(dú)立地表達(dá)視蛋白，給PV::Cre小鼠注射含有Lent1-CaMKIl a-ClVl (E122T/E162T)和 AAV5-EF Ia-DIO-Ch R2 (H134R)的雙病毒混合物。
(c)由非表達(dá)性PYR神經(jīng)元得到的電壓鉗記錄，所述神經(jīng)元接受來(lái)自表達(dá)ClVl的PYR-細(xì)胞和表達(dá)ChR2的PV-細(xì)胞的突觸輸入。在0mV、405nm光脈沖下鉗制引發(fā)短潛伏期IPSC，而560nm脈沖僅引起小的、長(zhǎng)潛伏期的抑制性突觸響應(yīng)。(d)由在c中所示的相同細(xì)胞得到的電壓鉗記錄。在_65mV、560nm光脈沖下鉗制引發(fā)EPSC,但405nm脈沖不能引起可檢測(cè)到的突觸電流。灰色線示出個(gè)別事件；黑色線示出光脈沖引發(fā)的平均值。(e)在注射CaMKIla::ClVl (E162T)-ts-eYFP 和 Efla-DIO::ChR2_eYFP 的被麻醉的 PV::Cre 小鼠中的mPFC光極記錄(圖表說(shuō)明實(shí)驗(yàn)設(shè)置)。紫色(405nm)光脈沖相對(duì)于綠光脈沖(實(shí)例跡線)呈現(xiàn)出可變延遲(At)。(f)匯總圖形示出了在紫光脈沖領(lǐng)先綠光脈沖所指示的延遲的情況下綠光引發(fā)的尖峰的概率。個(gè)別點(diǎn)是來(lái)自單個(gè)的記錄。黑色線示出所有記錄的平均值(每分區(qū)(bin) >3個(gè)記錄位點(diǎn))。(g)來(lái)自注射病毒的小鼠的光電極記錄，示出一個(gè)推定錐體單元和一個(gè)推定PV單元分別響應(yīng)于561nm刺激(右側(cè)，上方波形)和405nm刺激(右側(cè)，下方波形)而放電。
[0024]圖5描繪了在不同完整系統(tǒng)制劑中的組合光遺傳學(xué)激發(fā)。(a)在活體外用C1V1-E122T/E162T和ChR2_H134R進(jìn)行的組合投射控制。實(shí)驗(yàn)性范例分別示出ClVl和ChR2在皮層丘腦(CT)和腹側(cè)基底(VB)丘腦皮質(zhì)的細(xì)胞(TC)中的表達(dá)。(b)由從CT和TC細(xì)胞兩者中接收投射的nRT細(xì)胞得到的電壓鉗記錄。同時(shí)刺激(At=O ms)導(dǎo)致來(lái)自兩個(gè)投射的所引發(fā)的EPSC的線性疊加。(c)當(dāng)輸入是精確重合的時(shí)候，來(lái)自TC和CT纖維的個(gè)別低于閾值的輸入僅在nRT神經(jīng)元中產(chǎn)生尖峰。(d)CT與TC輸入之間的延遲指示于左側(cè)。水平短劃線指示切去頂端的尖峰。由以可變潛伏期(At)活化的CT和TC纖維引發(fā)的歸一化數(shù)目的動(dòng)作電位(來(lái)自6個(gè)nRT細(xì)胞)指示只有在5ms內(nèi)重合的情況下，CT和TC輸入才產(chǎn)生有效的整合。匯總數(shù)據(jù)表示平均土SEM。
[0025]圖6描繪了光譜時(shí)間分離和組合控制:正進(jìn)行的突觸活動(dòng)下的E/Ι狀態(tài)改變的回路調(diào)節(jié)和出射型態(tài)。(a)針對(duì)PV神經(jīng)元的SSFO活化和錐體神經(jīng)元中的ClVl活化的實(shí)驗(yàn)性范例。(b)在來(lái)自表達(dá)CaMKIla::C1V1 (E162T)和DIO-SSFO的PV::Cre小鼠的短期切片制劑中，在OmV下由錐體神經(jīng)元得到的電壓鉗記錄。SSFO和ClVl由藍(lán)光脈沖活化⑵，并且通過(guò)持續(xù)的SSFO活性使IPSC頻率增加(3 ；比較插圖中針對(duì)活化前和活化后IPSC活性的上方和下方跡線)。持續(xù)的黃光脈沖使SSFO去活，并且活化ClVl和瞬時(shí)增加IPSC頻率
(4)。群功率譜(右側(cè))示出光學(xué)興奮性神經(jīng)元活化(590nm脈沖)過(guò)程中的Y頻率活性，所述Y頻率活性在興奮性和PV神經(jīng)元(470nm脈沖)共同活化過(guò)程中增加。在跡線下方的圖表示出實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的ClVl和SSFO的預(yù)測(cè)活性。(c)所觀察到的Y頻率峰與先前經(jīng)由SSFO對(duì)PV神經(jīng)元的刺激無(wú)關(guān)。(d)基`線時(shí)和初始藍(lán)光或橙色光脈沖后來(lái)自(b)和(c)的匯總IPSC頻率。在跡線下方的圖表示出實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的ClVl和SSFO的預(yù)測(cè)活性。
[0026]詳述
[0027]本發(fā)明特別提供包含在質(zhì)膜上表達(dá)光活化嵌合蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的組合物；和使用所述組合物來(lái)選擇性地使存在于前額葉皮質(zhì)中的相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元去極化的方法。本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了具有獨(dú)特物理化學(xué)特性的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白首次容許實(shí)驗(yàn)性操縱皮質(zhì)E/Ι提高并且能夠監(jiān)測(cè)皮質(zhì)切片中的Y振蕩。這些獨(dú)特的光敏性嵌合蛋白可以在非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的興奮性或抑制性神經(jīng)回路中表達(dá)，然后可以響應(yīng)于具有特定波長(zhǎng)的光使所述興奮性或抑制性神經(jīng)回路去極化。此外，來(lái)自非人動(dòng)物的含有表達(dá)本文公開(kāi)的嵌合光敏性蛋白的皮質(zhì)興奮性或抑制性神經(jīng)元的腦切片可以被用來(lái)搜尋可以選擇性地抑制存在于相同神經(jīng)回路內(nèi)的興奮性或抑制性神經(jīng)元的去極化的化合物。
[0028]一般技術(shù)
[0029]除非另外指出，否則本發(fā)明的實(shí)踐將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、核酸化學(xué)以及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。所述技術(shù)已在文獻(xiàn)中得到充分說(shuō)明，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等，1989)和 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook 和 Russel, 2001)(本文統(tǒng)稱為“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel 等編著，1987，包括 2001 年增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等編著，1994) ;Harlow和 Lane(1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPublications, New York ;Harlow 和 Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (本文統(tǒng)稱為 “Harlow和 Lane，，)，Beaucage 等編著，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Johnffiley&Sons, Inc., New York, 2000), Handbook of Experimental Immunology,第四版(D.M.Weir 和 C.C.Blackwell 編著，Blackwell Science Inc., 1987);以及 Gene TransferVectors for Mammalian Cells (J.M.Miller 和 M.P.Calos 編著，1987)。
[0030]定義
[0031]如本文所使用，除非另外指出，否則單數(shù)形式“一個(gè)/ 一種(a/an) ”和“所述(the) ”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。
[0032]“動(dòng)物”可以是脊椎動(dòng)物，如任何常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室模式生物或哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于:人、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物、寵物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、以及其它嚙齒類動(dòng)物。
[0033]如本文所使用的“氨基酸取代”或“突變”意指指定氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸組分改變或取代為另一個(gè)氨基酸，從而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性或表達(dá)水平改變的由所述氨基酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
[0034]“嵌合蛋白”是包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于一種或多種不同蛋白的部分的蛋白。嵌合蛋白可以通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染有編碼所述嵌合蛋白的核酸的重組細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。
[0035]意欲在本說(shuō)明書(shū)通篇中給出的每個(gè)最大數(shù)值限制包括每個(gè)較低的數(shù)值限制，如同所述較低的數(shù)值限制被清楚地寫(xiě)在本文中一般。在本說(shuō)明書(shū)通篇中給出的每個(gè)最小數(shù)值限制將包括每個(gè)較高的數(shù)值限制，如同所述較高的數(shù)值限制被清楚地寫(xiě)在本文中一般。在本說(shuō)明書(shū)通篇中給出的每個(gè)數(shù)值范圍將包括每個(gè)落在所述較寬的數(shù)值范圍之內(nèi)的較窄的數(shù)值范圍，如同所述較窄的數(shù)值范圍都被清楚地寫(xiě)在本文中一般。
[0036]VlCl嵌合蛋白和表達(dá)所述VlCl嵌合蛋白的細(xì)胞
[0037]在一些方面中，本文所公開(kāi)的動(dòng)物細(xì)胞包含嵌合光敏性蛋白(稱為“C1V1”)，所述嵌合光敏性蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl陽(yáng)離子通道和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl陽(yáng)離子通道。所述蛋白可以由VChRl的氨基酸序列構(gòu)成，但另外VChRl多肽的至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋可以置換為ChRl的相應(yīng)第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋。ClVl嵌合視蛋白是從單獨(dú)不能在神經(jīng)元中很好地表達(dá)并且是有效、紅移且穩(wěn)定的視紫紅質(zhì)通道蛋白的其它視蛋白的片段組裝而來(lái)。在一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物細(xì)胞可以在細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)第二光活化蛋白。所述第二光活化蛋白可以能夠介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜響應(yīng)于光活化發(fā)生超極化。能夠介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜的超極化的光活化蛋白的實(shí)例可以例如在國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2011/028893中找到，所述專利 申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式全部并入本文。
[0038]本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案還可以是針對(duì)ClVl的修飾或突變型式。這些蛋白可以單獨(dú)或與多種其它視蛋白組合使用，以確保對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行光學(xué)控制。具體來(lái)說(shuō)，聯(lián)合其它視蛋白使用修飾的ClVl被認(rèn)為適用于對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)障礙進(jìn)行光學(xué)控制。ClVl的具體用途涉及光遺傳學(xué)系統(tǒng)或方法，所述光遺傳學(xué)系統(tǒng)或方法使對(duì)神經(jīng)回路的時(shí)間、空間和/或細(xì)胞類型特異性的控制與可測(cè)量的指標(biāo)關(guān)聯(lián)起來(lái)。
[0039]VlCl嵌合蛋白
[0040]本文提供在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)的光活化嵌合蛋白。在一些方面中，所述光活化蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的相應(yīng)第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白包含第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的相應(yīng)第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列，并且進(jìn)一步包含置換為ChRl的相應(yīng)部分的位于第二跨膜螺旋與第三跨膜螺旋之間的細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，在嵌合光活化蛋白的第二跨膜螺旋與第三跨膜螺旋之間的整個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域可以置換為ChRl的相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，位于第二跨膜螺旋與第三跨膜螺旋之間的置換為ChRl的相應(yīng)部分的細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域的所述部分可以延伸至SEQ ID N0:1的A145。在其它實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白包含第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域置換為ChRl的相應(yīng)第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域的VChRl的氨基酸序列，并且進(jìn)一步包含置換為ChRl的相應(yīng)部分的第三跨膜螺旋的至少一部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，置換為ChRl的相應(yīng)部分的第三跨膜螺旋的所述部分可以延伸至SEQ ID N0:1的W163。在一些實(shí)施方案中，所述光活化嵌合蛋白包含ChRl的氨基酸1-145和VChRl的氨基酸102-316。在一些實(shí)施方案中，所述光活化嵌合蛋白包含ChRl的氨基酸1-162和VChRl的氨基酸119-316。在一些實(shí)施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID NO:1中所示的序列在沒(méi)有信號(hào)肽序列的情況下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:1中所示的序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的氨基酸序列。
[0041]在其它實(shí)施方案 中，當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，光活化嵌合蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，所述光可以是綠光。在其它實(shí)施方案中，所述光的波長(zhǎng)可以在約540nm至約560nm之間。在一些實(shí)施方案中，所述光的波長(zhǎng)可以為約542nm。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用紫光照射細(xì)胞時(shí)，嵌合蛋白可能不能介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用波長(zhǎng)為405nm的光照射細(xì)胞時(shí)，嵌合蛋白可能不能介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。
[0042]在一些實(shí)施方案中，蛋白可以進(jìn)一步包含C末端熒光蛋白。在一些具體的實(shí)施方案中，所述C末端熒光蛋白可以是增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)、綠色熒光蛋白(GFP)、青色熒光蛋白(CFP)、或紅色熒光蛋白(RFP)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)添加增強(qiáng)蛋白質(zhì)向細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)(ts)來(lái)修飾光活化嵌合蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)是來(lái)源于人向內(nèi)整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白中的信號(hào)肽序列可以置換為不同信號(hào)肽序列。
[0043]在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、或干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的興奮性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，興奮性神經(jīng)元可以是錐體神經(jīng)元。在其它的實(shí)施方案中，抑制性神經(jīng)元可以是小白蛋白神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的抑制性神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的抑制性神經(jīng)元。
[0044] 在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以進(jìn)一步包含在細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)的第二光活化蛋白。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，所述第二光活化蛋白可以能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的超極化電流。在一些實(shí)施方案中，所述第二光活化蛋白可以是NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1或GtR3。關(guān)于其它光活化陽(yáng)離子通道、陰離子泵、以及質(zhì)子泵的另外的信息可以在美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2009/0093403 ;和國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2011/028893中找到，所述專利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容由此以引用的方式全部并入本文。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于表達(dá)其它光活化陽(yáng)離子通道蛋白的細(xì)胞，所述光活化嵌合蛋白在曝露于光的神經(jīng)細(xì)胞中可以具有增強(qiáng)的光電流。在一些實(shí)施方案中，由光活化嵌合蛋白提供的光電流增強(qiáng)可以比表達(dá)其它光活化陽(yáng)離子通道蛋白的細(xì)胞大I倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、或15倍中的任一者，包括所述倍數(shù)在內(nèi)。
[0045]本文還提供在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)的一種或多種光活化蛋白，其中所述一種或多種光活化蛋白包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列，并且進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)(例如，增強(qiáng)向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào))。所述轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以融合至核心氨基酸序列的C末端或可以融合至核心氨基酸序列的N末端。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以通過(guò)連接子連接至核心氨基酸序列。所述連接子可以包含5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、75 個(gè)、100 個(gè)、125 個(gè)、150 個(gè)、175 個(gè)、200 個(gè)、225 個(gè)、250 個(gè)、275 個(gè)、300 個(gè)、400 個(gè)、或 500 個(gè)氨基酸中的任一長(zhǎng)度。所述連接子可以進(jìn)一步包含熒光蛋白，例如但不限于:增強(qiáng)型黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或青色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以來(lái)源于人向內(nèi)整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。
[0046]VlCl嵌合突奪型奪異體
[0047]在一些方面中，本發(fā)明包括包含取代的或突變的氨基酸序列的多肽，其中所述突變型多肽保留了前體ClVl嵌合多肽的特征性光可活化性質(zhì)，但在一些具體方面中也可以具有改變的特性。例如，本文所描述的突變型光活化嵌合蛋白可以展現(xiàn)出在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)或在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上的表達(dá)水平均增加；當(dāng)被曝露于不同波長(zhǎng)的光(特別是紅光)時(shí)，響應(yīng)性改變；和/或性狀的組合，其中嵌合ClVl多肽具有以下特性:低脫敏作用、快速去活、低紫光活化以便與其它光活化陽(yáng)離子通道的交叉活化作用最低，和/或在動(dòng)物細(xì)胞中具有強(qiáng)表達(dá)。
[0048]包含氨基酸取代或突變的光活化嵌合蛋白包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)歷過(guò)氨基酸取代同時(shí)保留對(duì)光可響應(yīng)的能力和控制質(zhì)膜的極化狀態(tài)的能力的那些蛋白。例如，可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代為對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸序列來(lái)制備包含氨基酸取代或突變的光活化蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含的氨基酸序列與SEQ ID NO:1中的氨基酸序列相比改變的蛋白質(zhì)，其中所述改變的光活化嵌合蛋白保留了具有SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的蛋白的特征性光活化性質(zhì)和/或調(diào)控穿過(guò)質(zhì)膜的離子流的能力，但在一些具體方面中可以具有改變的特性。[0049] 天然蛋白序列中的氨基酸取代可以是保守性或非保守性的，并且所述取代的氨基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基?；趥?cè)鏈的化學(xué)特性，將標(biāo)準(zhǔn)的二十種氨基酸“字母表”分為化學(xué)家族。這些家族包括具有以下側(cè)鏈的氨基酸:堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香族基團(tuán)的側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)?！氨Ｊ匦园被崛〈笔瞧渲邪被釟埢脫Q為具有化學(xué)上類似的側(cè)鏈的氨基酸殘基(即，使具有堿性側(cè)鏈的氨基酸置換為具有堿性側(cè)鏈的另一種氨基酸)?！胺潜Ｊ匦园被崛〈笔瞧渲邪被釟埢脫Q為具有化學(xué)上不同的側(cè)鏈的氨基酸殘基(即，使具有堿性側(cè)鏈的氨基酸置換為具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸)。氨基酸取代可以是保守性或非保守性的。另外，氨基酸取代可以位于ClVl視黃醛結(jié)合袋、一個(gè)或多個(gè)ClVl細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域和/或視黃醛結(jié)合袋或細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域兩者中。
[0050]相應(yīng)地，本文提供在嵌合多肽的VChRl部分的整個(gè)視黃醛結(jié)合袋的關(guān)鍵位置上具有特定氨基酸取代的ClVl嵌合光活化蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述ClVl蛋白可以在SEQID NO:1的氨基酸殘基Ε122上具有突變。在一些實(shí)施方案中，所述ClVl蛋白可以在SEQID NO:1的氨基酸殘基Ε162上具有突變。在其它實(shí)施方案中，所述ClVl蛋白可以在SEQID Ν0:1的氨基酸殘基Ε162和Ε122兩者上具有突變。在一些實(shí)施方案中，所公開(kāi)的突變型ClVl嵌合蛋白各自可以具有可用于使響應(yīng)于光的動(dòng)物細(xì)胞的膜去極化的具體特性和特征。
[0051]C1V1-E122突變型多肽
[0052]本文提供在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)的本文所公開(kāi)的光活化ClVl嵌合蛋白，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)歷過(guò)氨基酸取代同時(shí)保留了 Civi活性(即，能夠催化動(dòng)物細(xì)胞響應(yīng)于光活化的去極化)，并且其中突變可以是在對(duì)應(yīng)于SEQ ID Ν0:1的E122(C1V1-E122)的谷氨酸殘基上。在一些實(shí)施方案中，所述C1V1-E122突變型嵌合光活化蛋白包含在氨基酸E122上引入SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的取代，所述取代可以引起嵌合蛋白對(duì)光的敏感性增加、對(duì)特定波長(zhǎng)的光的敏感性增加、和/或相對(duì)于在E122上不具有突變的ClVl嵌合光活化蛋白調(diào)控細(xì)胞質(zhì)膜的極化狀態(tài)的能力增加。在一些實(shí)施方案中，突變可以是保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，突變可以是非保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，在氨基酸殘基E122上的突變可以是突變?yōu)樘K氨酸(C1V1-E122T)。在其它實(shí)施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:3中所示的序列在沒(méi)有信號(hào)肽序列的情況下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:3中所示的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，所述C1V1-E122突變型嵌合光活化蛋白可以融合至C末端轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以通過(guò)連接子連接至C1V1-E122突變型嵌合光活化蛋白。所述連接子可以包含5 個(gè)、10 個(gè)、20 個(gè)、30 個(gè)、40 個(gè)、50 個(gè)、75 個(gè)、100 個(gè)、125 個(gè)、150 個(gè)、175 個(gè)、200 個(gè)、225 個(gè)、250個(gè)、275個(gè)、300個(gè)、400個(gè)、或500個(gè)氨基酸中的任一長(zhǎng)度。所述連接子可以進(jìn)一步包含熒光蛋白，例如但不限于:增強(qiáng)型黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或青色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以來(lái)源于人向內(nèi)整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。
[0053]在其它實(shí)施方案中，當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122嵌合蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，光可以是綠光。在其它實(shí)施方案中，光的波長(zhǎng)可以在約540nm至約560nm之間。在一些實(shí)施方案中，光的波長(zhǎng)可以為約546nm。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)用紅光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122嵌合蛋白可以介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，紅光的波長(zhǎng)可以為約630nm。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用紫光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122嵌合蛋白可能不能介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用波長(zhǎng)為405nm的光照射細(xì)胞時(shí)，嵌合蛋白可能不能介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、或干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的興奮性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，興奮性神經(jīng)元可以是錐體神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的抑制性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，興奮性神經(jīng)元可以是錐體神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，抑制性神經(jīng)元可以是小白蛋白神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以進(jìn)一步包含在細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)的第二光活化蛋白。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，第二光活化蛋白可以能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的超極化電流。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以是 NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1 或 GtR3。
[0054]C1V1-E162突變型多肽
[0055]本文提供在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)的本文所公開(kāi)的光活化ClVl嵌合蛋白，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)歷過(guò)氨基酸取代同時(shí)保留Civi活性(即，能夠催化動(dòng)物細(xì)胞響應(yīng)于光活化的去極化)，其中突變可以是在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的E162(C1V1-E162)的谷氨酸殘基上。在一些實(shí)施方案中，C1V1-E162突變型嵌合光活化蛋白包含在氨基酸E162上引入SEQID NO:1中所示的氨基酸序列中的取代，所述取代可以引起嵌合蛋白對(duì)光的敏感性增加、對(duì)特定波長(zhǎng)的光的敏感性增加、和/或相對(duì)于在E162上不具有突變的ClVl嵌合光活化蛋白調(diào)控細(xì)胞質(zhì)膜的極化狀態(tài)的能力增加。在一些實(shí)施方案中，突變可以是保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，突變可以是非保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，在氨基酸殘基E162上的突變可以是突變?yōu)樘K氨酸(C1V1-E162T)。在其它實(shí)施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID NO:5中所示的序列在沒(méi)有信號(hào)肽的情況下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含與 SEQ ID NO:5 中所示的序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 、或100%相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，C1V1-E162突變型嵌合光活化蛋白可以融合至C末端轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)上。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以通過(guò)連接子連接至C1V1-E162突變型嵌合光活化蛋白。連接子可以包含5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、75個(gè)、100個(gè)、125個(gè)、150個(gè)、175個(gè)、200個(gè)、225個(gè)、250個(gè)、275個(gè)、300個(gè)、400個(gè)、或500個(gè)氨基酸中的任一長(zhǎng)度。連接子可以進(jìn)一步包含熒光蛋白，例如但不限于:增強(qiáng)型黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或青色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以來(lái)源于人向內(nèi)整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
[0056]在其它實(shí)施方案中，當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E162嵌合蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，光可以是綠光。在其它實(shí)施方案中，光的波長(zhǎng)可以在約540nm至約535nm之間。在一些實(shí)施方案中，光的波長(zhǎng)可以為約542nm。在其它實(shí)施方案中，光的波長(zhǎng)可以為約530nm。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用紫光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E162嵌合蛋白可能不能介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用波長(zhǎng)為405nm的光照射細(xì)胞時(shí)，嵌合蛋白可能不能介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，C1V1-E162嵌合蛋白可以進(jìn)一步包含C末端突光蛋白。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、或干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的興奮性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，興奮性神經(jīng)元可以是錐體神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的抑制性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，興奮性神經(jīng)元可以是錐體神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，抑制性神經(jīng)元可以是小白蛋白神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以進(jìn)一步包含在細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)的第二光活化蛋白。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，第二光活化蛋白可以能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的超極化電流。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以是NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1或GtR3。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于缺乏E162上的突變的ClVl蛋白或相對(duì)于其它光活化陽(yáng)離子通道蛋白，C1V1-E162光活化嵌合蛋白可以具有加速的光循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，C1V1-E162光活化嵌合蛋白可以具有比缺乏E162上的突變的ClVl蛋白或相對(duì)于其它光活化陽(yáng)離子通道蛋白快多于I倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、或5倍的光循環(huán)，包括所述倍數(shù)在內(nèi)。
[0057]C1V1-E122/E162雙重突變型多肽
[0058]本文提供在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)的本文所公開(kāi)的光活化ClVl嵌合蛋白，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)歷過(guò)氨基酸取代同時(shí)保留Civi活性(即，能夠催化動(dòng)物細(xì)胞響應(yīng)于光活化的去極化)，其中突變可以是在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的E122和E162(C1V1-E122/E162)的谷氨酸殘基上。在一些實(shí)施方案中，C1V1-E122/E162突變型嵌合光活化蛋白可以包含在氨基酸E122和E162上引入SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的取代，所述取代可以引起嵌合蛋白對(duì)光的敏感性增加、對(duì)特定波長(zhǎng)的光的敏感性增加、和/或相對(duì)于不具有E122和E162上的突變的ClVl嵌合光活化蛋白調(diào)控細(xì)胞質(zhì)膜的極化狀態(tài)的能力增加。在一些實(shí)施方案中，突變可以是保守性`氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，突變可以是非保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，突變可以是保守性和非保守性的氨基酸取代兩者。在一些實(shí)施方案中，在氨基酸殘基E122和E162上的突變均可以是突變?yōu)樘K氨酸(C1V1-E122T/E162T)。在其它實(shí)施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:7中所示的序列在沒(méi)有信號(hào)肽序列的情況下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:7中所示的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，C1V1-E122/E162突變型嵌合光活化蛋白可以融合C末端轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)上。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以通過(guò)連接子連接至C1V1-E122/E162突變型嵌合光活化蛋白。連接子可以包含5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、75個(gè)、100個(gè)、125個(gè)、150個(gè)、175個(gè)、200個(gè)、225個(gè)、250個(gè)、275個(gè)、300個(gè)、400個(gè)、或500個(gè)氨基酸中的任一長(zhǎng)度。連接子可以進(jìn)一步包含熒光蛋白，例如但不限于:增強(qiáng)型黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或青色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以來(lái)源于人向內(nèi)整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)可以包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。[0059]在其它實(shí)施方案中，當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122/E162嵌合蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，光可以是綠光。在其它實(shí)施方案中，光的波長(zhǎng)可以在約540nm至約560nm之間。在一些實(shí)施方案中，光的波長(zhǎng)可以為約546nm。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用紫光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122/E162嵌合蛋白可能不能介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用波長(zhǎng)為405nm的光照射細(xì)胞時(shí)，嵌合蛋白可能不能介導(dǎo)細(xì)胞中的去極化電流。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于缺乏E122/E162上的突變的ClVl蛋白或相對(duì)于其它光活化陽(yáng)離子通道蛋白，當(dāng)被曝露于紫光時(shí)C1V1-E122/E162嵌合蛋白可以展現(xiàn)出較低程度的活化。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、或干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的興奮性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，興奮性神經(jīng)元可以是錐體神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的抑制性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，抑制性神經(jīng)元可以是小白蛋白神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以進(jìn)一步包含在細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)的第二光活化蛋白。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用光照射細(xì)胞時(shí)，第二光活化蛋白可以能夠介導(dǎo)細(xì)胞中的超極化電流。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以是NpHr、eNpHr2.0,eNpHr3.0,eNpHr3.1或GtR3。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于缺乏E122/E162上的突變的ClVl蛋白或相對(duì)于其它光活化陽(yáng)離子通道蛋白，C1V1-E122/E162突變型光活化嵌合蛋白可以具有減少的鈍化。在一些實(shí)施方案中，與缺乏E122/E162上的突變的ClVl蛋白相比或相對(duì)于其它光活化陽(yáng)離子通道蛋白，C1V1-E122/E162突變型光活化嵌合蛋白可以鈍化約 15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、或30%中的任一者，包括所述數(shù)據(jù)在內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，C1V1-E122/E162光活化嵌合蛋白可以具有比缺乏E122/E162上的突變的ClVl蛋白或相對(duì)于其它光活化陽(yáng)離子通道蛋白快多于I倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、或10倍的光循環(huán)，包括所述倍數(shù)在內(nèi)。
[0060]增強(qiáng)型細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸基序
[0061]本公開(kāi)內(nèi)容提供通過(guò)添加一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)向哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸序列基序而對(duì)細(xì)胞中表達(dá)的光活化嵌合蛋白進(jìn)行修飾。具有來(lái)源于進(jìn)化上較低等生物的組分的光活化嵌合蛋白可能不能由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)或耐受，或當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)時(shí)可能展現(xiàn)出亞細(xì)胞定位障礙。因此，在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞中表達(dá)的嵌合光活化蛋白質(zhì)融合至一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列基序，所述氨基酸序列基序選自由以下組成的組:信號(hào)肽、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)輸出信號(hào)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)、以及N末端高爾基(golgi)輸出信號(hào)。增強(qiáng)光活化嵌合蛋白向哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列基序可以融合至光活化蛋白的N末端、C末端、或N末端和C末端兩者。任選地，光活化蛋白和一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列基序可以由連接子分開(kāi)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)添加增強(qiáng)蛋白質(zhì)向細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)(ts)來(lái)修飾光活化嵌合蛋白。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)來(lái)源于人向內(nèi)整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV.可以增強(qiáng)光活化蛋白向細(xì)胞的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的另外的蛋白質(zhì)基序描述于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2/041，628中，所述專利申請(qǐng)以引用的方式全部并入本文。在一些實(shí)施方案中，嵌合蛋白中的信號(hào)肽序列被缺失或取代為來(lái)自不同蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列。
_2] 動(dòng)物細(xì)胞、非人動(dòng)物、以及腦切片[0063]本文提供包含本文所公開(kāi)的光活化嵌合蛋白的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的ClVl蛋白。在其它實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:3的突變型C1V1-E122T蛋白。在其它實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:5的突變型C1V1-E162T蛋白。在其它實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N07的突變型C1V1-E122T/E162T蛋白。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、或干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的興奮性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，興奮性神經(jīng)元可以是錐體神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的抑制性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，抑制性神經(jīng)元可以是小白蛋白神經(jīng)元。
[0064]本文還提供包含在動(dòng)物的細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)的本文所公開(kāi)的光活化嵌合蛋白的非人動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的ClVl蛋白。在其它實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:3的突變型C1V1-E122T蛋白。在其它實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:5的突變型C1V1-E162T蛋白。在其它實(shí)施方案中，動(dòng)物細(xì)胞包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID N07的突變型C1V1-E122T/E162T蛋白。在一些實(shí)施方案中，包含本文所描述的光活化嵌合蛋白的動(dòng)物是以轉(zhuǎn)基因方式表達(dá)所述光活化嵌合蛋白。在其它實(shí)施方案中，包含本文所描述的光活化嵌合蛋白的動(dòng)物已通過(guò)病毒用攜帶光活化蛋白的載體(如，但不限于腺病毒載體)進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。
[0065]本文提供來(lái)自非人動(dòng)物的活腦切片，所述活腦切片包含在這些切片中的細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)的本文所描述的光活化嵌合蛋白。在一些實(shí)施方案中，腦切片是來(lái)自以轉(zhuǎn)基因方式表達(dá)本文所描述的光活化嵌合蛋白的非人動(dòng)物。在其它實(shí)施方案中，腦切片是來(lái)自已通過(guò)病毒用攜帶所述光活化蛋白的載體(如，但不限于腺病毒載體)轉(zhuǎn)染的非人動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，腦切片是冠狀腦切片。在一些實(shí)施方案中，腦切片具有約100 μ m、約150 μ m、約 200 μ m、約 250 μ m、約 300 μ m、約 350 μ m、約 400 μ m、約 450 μ m、或約 500 μ m 中的任一厚度，包括所述在內(nèi)，包括在這些數(shù)值之間的任何厚度。
`[0066]分離的多核苷酸
[0067]本文提供分離的ClVl多核苷酸，所述分離的ClVl多核苷酸編碼本文所描述的例如具有ClVl多肽的至少一種活性的任何嵌合多肽。本公開(kāi)內(nèi)容提供分離的、合成的、或重組的多核苷酸，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:6或SEQ IDNO: 8的核酸在至少約10個(gè)，例如至少約15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、75 個(gè)、100 個(gè)、150 個(gè)、200 個(gè)、250 個(gè)、300 個(gè)、350 個(gè)、400 個(gè)、450 個(gè)、500 個(gè)、550 個(gè)、600 個(gè)、650個(gè)、700個(gè)、750個(gè)、800個(gè)、850個(gè)、900個(gè)、950個(gè)、或1000個(gè)核苷酸的區(qū)域上具有至少約 70%,例如至少約 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 或完全(100%)序列同一性的核酸序列。
[0068]本公開(kāi)內(nèi)容特別提供編碼ClVl和/或其突變型變異體的核酸。例如，本公開(kāi)內(nèi)容提供分尚的核酸分子，其中所述核酸分子編碼:(1)包含與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(2)包含與 SEQ ID NO:3 的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(3)包含與SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽；或(4)包含與SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽。
[0069]啟動(dòng)子和載體
[0070]本公開(kāi)內(nèi)容還提供包含上述核酸的表達(dá)序列盒和/或載體。適合的是，編碼本公開(kāi)內(nèi)容的嵌合蛋白的核酸可操作地連接至啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是本領(lǐng)域眾所周知的。在宿主細(xì)胞中起作用的任何啟動(dòng)子都可以用于表達(dá)本公開(kāi)內(nèi)容的ClVl和/或其任何變異體。有大量適用于驅(qū)動(dòng)ClVl嵌合蛋白或其變異體在特定動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的啟始控制區(qū)或啟動(dòng)子并且是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的?？梢允褂脦缀跞魏文軌蝌?qū)動(dòng)這些核酸的啟動(dòng)子。
[0071]具體來(lái)說(shuō)，在希望在興奮性神經(jīng)細(xì)胞中重組表達(dá)ClVl嵌合蛋白的情況下，可以使用人鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶IIa (CaMKIIa)啟動(dòng)子。在其它實(shí)施方案中，可以將延長(zhǎng)因子Ia(EF-1a)啟動(dòng)子與Cre誘導(dǎo)性重組AAV載體聯(lián)合用于小白蛋白-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)使表達(dá)ClVl嵌合蛋白靶向抑制性神經(jīng)元。
[0072]本文還提供包含編碼ClVl嵌合多肽或其任何變異體的本文所公開(kāi)的多核苷酸的載體?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明施用的載體還包括包含編碼當(dāng)從載體的多核苷酸中轉(zhuǎn)錄時(shí)將引起光活化嵌合蛋白在靶動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜上積聚的RNA(例如，RNA1、核酶、miRNA、siRNA)的多核苷酸的載體。可以使用的載體包括，但不限于:慢病毒載體、HSV載體、以及腺病毒載體。慢病毒包括但不限于:HIV-1、HIV-2、SIV、FIV以及EIAV。慢病毒可以是具有其它病毒的包膜蛋白的假型病毒，所述其它病毒包括但不限于:VSV、狂犬病病毒、Mo-MLV、桿狀病毒以及埃博拉病毒(Ebola)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)制備此類載體。
[0073]在一些實(shí)施方案中,載體是重組AAV載體。AAV載體尺寸相對(duì)較小的DNA病毒，所述DNA病毒可以穩(wěn)定和位點(diǎn)特 異性的方式整合至它們感染的細(xì)胞的基因組中。所述AAV載體能夠感染一系列細(xì)胞而不會(huì)誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)學(xué)或分化的任何影響，并且它們似乎不參與人病理學(xué)。AAV基因組已進(jìn)行了克隆、測(cè)序和表征。所述AAV基因組涵蓋約4700個(gè)堿基并且在每個(gè)末端包含具有約145個(gè)堿基的反向末端重復(fù)(ITR)區(qū)，其用作病毒的復(fù)制起點(diǎn)?；蚪M的其余部分分為承載衣殼化功能的兩個(gè)必需區(qū)域:基因組的左邊部分，所述左邊部分包含參與病毒基因的病毒復(fù)制和表達(dá)的rep基因；和基因組的右邊部分，所述右邊部分包含編碼病毒的衣殼蛋白的cap基因。
[0074]AAV作為基因療法的載體的應(yīng)用已在近年來(lái)得到快速發(fā)展。野生型AAV可以用相對(duì)高的滴度感染分裂的或未分裂的細(xì)胞、或哺乳動(dòng)物(包括人)的組織，并且還可以整合至人細(xì)胞中的特定位點(diǎn)(在染色體19的長(zhǎng)臂上)(Kotin, R.M.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2211-2215，1990) (Samulski, R.J 等，EMBO J.10:3941-3950，1991，所述參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容由此以引用的方式全部并入本文)。沒(méi)有rep和cap基因的AAV載體失去位點(diǎn)特異性整合的特異性，但仍然可以介導(dǎo)外源基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。AAV載體以兩種形式存在于細(xì)胞中，其中一種是染色體外的游離基因；另一種被整合至染色體中，其中前者作為主要的形式。此外，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)AAV與任何人疾病相關(guān)，也沒(méi)有觀察到整合引起生物學(xué)特征發(fā)生任何變化。在文獻(xiàn)中報(bào)道了十六種血清型AAV，分別命名為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、以及 AAV16，其中 AAV5是最初從人中分離出來(lái)的(Bantel-Schaal 和 H.zur Hausen.1984.Virologyl34:52-63)，而AAV1-4和AAV6均是在腺病毒的研究中發(fā)現(xiàn)的(Ursula Bantel-Schaal, Hajo Delius以及 Harald zur Hausen.J.Virol.1999, 73:939-947)。
[0075]可以使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)制備AAV載體。任何血清型的腺相關(guān)病毒都是適合的(參見(jiàn)，例如 Blacklow, “Parvoviruses and Human Disease"J.R.Pattison 編著(1988)的第 165-174 頁(yè)；Rose, Comprehensive Virology3:1, 1974 ；P.Tattersall “TheEvolution of Parvovirus Taxonomy，，于Parvoviruses(JR Kerr, SF Cotmore.ME Bloom, RMLinden, CR Parrish 編著)第 5-14 頁(yè)，Hudder Arnold, London, UK(2006);以及 DEBowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski “The Genus Dependovirus，，(JR Kerr, SF Cotmore.ME Bloom, RM Linden, CR Parrish編著)第 15-23 頁(yè)，Hudder Arnold, London, UK (2006),所述參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容由此以引用的方式全部并入本文)。用于純化載體的方法可以見(jiàn)于例如美國(guó)專利號(hào) 6566118、6989264 和 6995006 以及名稱為“Methods for Generating HighTiter Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors” 的 W0/1999/011764,所述專利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式全部并入本文。雜交載體的制備描述于例如PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2005/027091中，所述申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式全部并入本文。使用來(lái)源于AAV的載體用于在活體外和活體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因已有描述(參見(jiàn)例如，國(guó)際專利申請(qǐng)公布號(hào)91/18088 和 W093/09239 ;美國(guó)專利號(hào) 4，797，368,6, 596，535 和 5，139，941，全部所述專利文獻(xiàn)均以引用的方式全部并入本文)。這些公布描述了 rep和/或cap基因被缺失并且置換為相關(guān)基因的各種AAV來(lái)源的構(gòu)建體；以及使用這些構(gòu)建體用于在活體外(轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)細(xì)胞中)或活體內(nèi)(直接轉(zhuǎn)移 至生物體中)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制缺陷型重組AAV可以通過(guò)將含有側(cè)接有兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)(ITR)區(qū)的相關(guān)核酸序列的質(zhì)粒和帶有AAV衣殼化基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至用人輔助病毒(例如腺病毒)感染的細(xì)胞系中來(lái)制備。然后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來(lái)純化所產(chǎn)生的AAV重組體。
[0076]在一些實(shí)施方案中，使供本發(fā)明方法使用的載體衣殼化成病毒粒子(例如AAV病毒粒子，包括但不限于 AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVl 1、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、以及AAV16)。因此，本發(fā)明包括包含本文所描述的任何載體的重組病毒粒子(重組是因?yàn)樗亟M多核苷酸)。產(chǎn)生所述粒子的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且描述于美國(guó)專利號(hào)6，596，535中。
[0077]關(guān)于本文所描述的動(dòng)物細(xì)胞，應(yīng)理解可以對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、心臟細(xì)胞、或干細(xì)胞施用一種或多種載體。如果使用多于一種載體，應(yīng)理解它們可以同時(shí)或在不同的時(shí)間里施用至動(dòng)物細(xì)胞。
[0078]本發(fā)明的方法
[0079]本文提供用于通過(guò)在存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元中表達(dá)本文所描述的光活化嵌合蛋白而選擇性地使那些神經(jīng)元去極化的方法。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白(如本文所公開(kāi)的那些)可以在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)，而第二光活化蛋白可以在抑制性神經(jīng)元中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)的第一光活化蛋白可以由不同于在抑制性神經(jīng)元中表達(dá)的第二光活化蛋白的波長(zhǎng)的光活化。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白和第二光活化蛋白可以在活的非人動(dòng)物或在來(lái)自非人動(dòng)物的活腦切片中表達(dá)。[0080]在其它實(shí)施方案中，提供用于鑒別選擇性地抑制通過(guò)在存在于相同神經(jīng)回路的興奮性或抑制性神經(jīng)元中表達(dá)本文所描述的光活化嵌合蛋白而引起的那些神經(jīng)元的去極化的化合物的方法。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)，而第二光活化蛋白可以在抑制性神經(jīng)元中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)的第一光活化蛋白可以由不同于在抑制性神經(jīng)元中表達(dá)的第二光活化蛋白的波長(zhǎng)的光活化。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白和第二光活化蛋白可以在活的非人動(dòng)物或在來(lái)自非人動(dòng)物的活腦切片中表達(dá)。
[0081]用于選擇性地改變存在于相同微回路中的神經(jīng)元中的E/Ι平衡的方法
[0082]在一些方面中，提供用于選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元去極化的方法，所述方法包括:選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經(jīng)元去極化，其中所述第一光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第一波長(zhǎng)的光時(shí)被去極化；或選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經(jīng)元去極化，其中所述第二光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第二波長(zhǎng)的光時(shí)被去極化。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在其它實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ IDNO: 11 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID勵(lì):13中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 14中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。關(guān)于其它光活化陽(yáng)離子通道的公開(kāi)內(nèi)容的更多信息可見(jiàn)于美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0054319 ;美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/410，704 ;以及國(guó)際專利申請(qǐng)公布號(hào)W02010/056970中，所述專利文獻(xiàn)各自的公開(kāi)內(nèi)容由此以引用的方式全部并入。
[0083]在其它方面中，提供用于選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元去極化的方法，所述方法包括:在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)第一光活化蛋白；并且在抑制性神經(jīng)元中表達(dá)第二光活化蛋白，其中第一光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第一波長(zhǎng)的光時(shí)，被獨(dú)立地去極化，并且其中第二光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第二波長(zhǎng)的光時(shí)，被獨(dú)立地去極化。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的蛋白。在其它實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以包含與 SEQ ID NO:5 中所示的氨基酸 序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID N0:11中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與 SEQ ID NO: 14 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。
[0084]在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)綠光來(lái)活化第一光活化蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)波長(zhǎng)為約560nm的光來(lái)活化第一光活化蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)紅光來(lái)活化第一光活化蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)波長(zhǎng)為約630nm的光來(lái)活化第一光活化蛋白。在其它實(shí)施方案中，可以通過(guò)紫光來(lái)活化第二光活化蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)波長(zhǎng)為約405nm的光來(lái)活化第二光活化蛋白。在其它實(shí)施方案中，可以通過(guò)綠光來(lái)活化第二光活化蛋白。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)光脈沖來(lái)活化光活化蛋白，所述光脈沖可以具有約I毫秒(ms)、約2ms、約3ms、約4ms、約5ms、約6ms、約7ms、約8ms、約9ms、約 10ms、約 15ms、約 20ms、約 25ms、約 30ms、約 35ms、約 40ms、約 45ms、約 50ms、約 60ms、約70ms、約 80ms、約 90ms、約 100ms、約 200ms、約 300ms、約 400ms、約 500ms、約 600ms、約 700ms、約800ms、約900ms、約I秒、約1.25秒、約1.5秒、或約2秒中的任一持續(xù)時(shí)間，包括所述數(shù)值在內(nèi)，包括在這些數(shù)值之間的任何時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)光脈沖來(lái)活化光活化蛋白，所述光脈沖的光功率密度可以為約0.05mff mm2、約0.1mff mm2、約0.25mff mm2、約0.5mffmm 2、約 0.75mff mm 2、約 ImW mm 2、約 2mW mm 2、約 3mW mm 2、約 4mW mm 2、約 5mW mm 2、約 6mWrnnT2、約 7mW rnnT2、約 8mW mnT2、約 9mW mnT2、約 10mW mnT2、約 IlmW mnT2、約 12mW mnT2、約 13mWmnT2、約 14mW mnT2、約 mW mnT2、約 16mW mnT2、約 17mW mnT2、約 18mW mnT2、約 19mW mnT2、約 20mWmm2、約 21mW mm2、約 22mW mm2、約 23mW mm2、約 24mW mm2、或約 25mW mm2 中的任一者，包括所述數(shù)值在內(nèi)，包括這些數(shù)值之間的任何值。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的興奮性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，興奮性神經(jīng)元可以是錐體神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的抑制性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，抑制性神經(jīng)元可以是小白蛋白神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，抑制性和興奮性神經(jīng)元可以是在活的非人動(dòng)物中。在其它實(shí)施方案中，抑制性和興奮性神經(jīng)元可以是在來(lái)自非人動(dòng)物的腦切片中。
[0085]用于鑒別選擇性地改變存在于相同微回路中的神經(jīng)元中的E/Ι平衡的化合物的述
[0086]在一些方面中，提供用于鑒別選擇性地抑制存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元的去極化的化合物的方法，所述方法包括:(a)用具有第一波長(zhǎng)的光選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經(jīng)元去極化，或用具有第二波長(zhǎng)的光選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經(jīng)元去極化；(b)測(cè)量響應(yīng)于選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經(jīng)元去極化的興奮性突觸后電位(EPSP)或測(cè)量響應(yīng)于選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經(jīng)元去極化的抑制性突觸后電流(IPSC) ；(c)使興奮性神經(jīng)元或抑制性神經(jīng)元與化合物接觸；(d)測(cè)量興奮性突觸后電位(EPSP)或測(cè)量抑制性突觸后電流(IPSC)以確定使興奮性神經(jīng)元或抑制性神經(jīng)元與化合物接觸是否選擇性地抑制任一神經(jīng)元的去極化。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在其它實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第一光活化蛋白可以包含與 SEQ ID NO:5 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些方面中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID ΝΟ:11中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，第二光活化蛋白可以包含與 SEQ ID NO: 14 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實(shí)施方案中，化合物可以是組合化學(xué)文庫(kù)中的成員。在其它實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括測(cè)定化合物以確定它是否不利地影響心臟組織的功能或哺乳動(dòng)物的心臟動(dòng)作電位。
[0087]在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)綠光來(lái)活化第一光活化蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)波長(zhǎng)為約560nm的光來(lái)活化第一光活化蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)紅光來(lái)活化第一光活化蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)波長(zhǎng)為約630nm的光來(lái)活化第一光活化蛋白。在其它實(shí)施方案中，可以通過(guò)紫光來(lái)活化第二光活化蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)波長(zhǎng)為約405nm的光來(lái)活化第二光活化蛋白。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)光脈沖來(lái)活化光活化蛋白，所述光脈沖可以具有約I毫秒(ms)、約2ms、約3ms、約4ms、約5ms、約6ms、約 7ms、約 8ms、約 9ms、約 10ms、約 15ms、約 20ms、約 25ms、約 30ms、約 35ms、約 40ms、約45ms、約 50ms、約 60ms、約 70ms、約 80ms、約 90ms、約 100ms、約 200ms、約 300ms、約 400ms、約500ms、約600ms、約700ms、約800ms、約900ms、約I秒、約1.25秒、約1.5秒、或約2秒中的任一持續(xù)時(shí)間，包括所述數(shù)值在內(nèi)，包括在這些數(shù)值之間的任何時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)光脈沖來(lái)活化光活化蛋白，所述光脈沖的光功率密度可以為約0.05mff mm2、約0.1mffmnT2、約 0.25mff mnT2、約 0.5mff mnT2、約 0.75mff mnT2、約 ImW mnT2、約 2mW mnT2、約 3mW mnT2、約 4mW mnT2、約 5mW mnT2、約 6mW mnT2、約 7mW mnT2、約 8mW mnT2、約 9mW mnT2、約 IOmW mnT2、約llmff mm2、約 12mW mm2、約 1`3mW mm2、約 14mW 1111]12、約碰 mm2、約 16mW mm2、約 17mW mm2、約 18mW mnT2、約 19mW mnT2、約 20mW mnT2、約 21mW mnT2、約 22mW mnT2、約 23mW mnT2、約 24mWmnT2、或約25mW mnT2中的任一者,包括所述數(shù)值在內(nèi)，包括這些數(shù)值之間的任何值。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的興奮性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，興奮性神經(jīng)元可以是錐體神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)元細(xì)胞可以是位于非人動(dòng)物的前額葉皮質(zhì)中的抑制性神經(jīng)元。在其它實(shí)施方案中，抑制性神經(jīng)元可以是小白蛋白神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，抑制性和興奮性神經(jīng)元可以是在活的非人動(dòng)物中。在其它實(shí)施方案中，抑制性和興奮性神經(jīng)元可以是在來(lái)自非人動(dòng)物的腦切片中。
[0088]示例性實(shí)施方案
[0089]本公開(kāi)內(nèi)容涉及光活化嵌合體視蛋白，所述光活化嵌合體視蛋白當(dāng)在膜表達(dá)時(shí)改變膜電壓。雖然本公開(kāi)內(nèi)容不必限制于這些背景，但可以通過(guò)使用這些背景和其它背景對(duì)實(shí)施例進(jìn)行討論來(lái)理解本公開(kāi)內(nèi)容的不同方面。
[0090]本公開(kāi)內(nèi)容的不同實(shí)施方案涉及經(jīng)過(guò)修飾以供在細(xì)胞膜(包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)的光活化視蛋白。所述視蛋白來(lái)源于兩種不同的視蛋白(團(tuán)藻視紫紅質(zhì)通道蛋白(VChRl)和萊茵衣藻視紫紅質(zhì)通道蛋白(ChRl))的組合。所述視蛋白可以適用于以高于它所來(lái)源的任一個(gè)別視蛋白的速率水平表達(dá)。
[0091]在某些更具體的實(shí)施方案中，ChRl/VChRl嵌合體(ClVl)的遺傳序列主要是VChRl。VChRl序列中與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的部分置換為來(lái)自ChRl的同源序列。
[0092]不同實(shí)施方案涉及針對(duì)添加轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)以促進(jìn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)的修飾。
[0093]本公開(kāi)內(nèi)容的某些方面針對(duì)ClVl的進(jìn)一步修飾型式。例如，某些實(shí)施方案包括ClVl的突變E162T，實(shí)驗(yàn)表明所述突變E162T提供了加速的光循環(huán)(例如，幾乎3倍)。
[0094]本公開(kāi)內(nèi)容的不同實(shí)施方案涉及使對(duì)神經(jīng)回路的時(shí)間、空間和/或細(xì)胞類型特異性控制與可測(cè)量的指標(biāo)相關(guān)的光遺傳學(xué)系統(tǒng)或方法。光遺傳學(xué)系統(tǒng)使用多種視蛋白(包括ClVl和/或ClVl變異體)來(lái)確保對(duì)神經(jīng)回路的多個(gè)部分進(jìn)行控制。例如，不同的指標(biāo)或癥狀可能與神經(jīng)病癥相關(guān)。光遺傳學(xué)系統(tǒng)靶向患者體內(nèi)的神經(jīng)回路用于對(duì)其進(jìn)行選擇性控制。光遺傳學(xué)系統(tǒng)涉及對(duì)患者的與神經(jīng)病癥相關(guān)的指標(biāo)或癥狀進(jìn)行監(jiān)測(cè)。以此方式，光遺傳學(xué)系統(tǒng)可以提供關(guān)于神經(jīng)回路、其功能和/或神經(jīng)病癥的詳細(xì)信息。
[0095]與本文所討論的實(shí)施方案一致，特定實(shí)施方案涉及使用多種視蛋白來(lái)研究和探測(cè)病癥。其它實(shí)施方案涉及對(duì)表型和內(nèi)在表型的鑒別和/或研究。其它實(shí)施方案涉及治療靶標(biāo)的鑒別。
[0096]本公開(kāi)內(nèi)容的方面針對(duì)在快速時(shí)間尺度上人工誘導(dǎo)病癥/疾病病況?；陉P(guān)于加速的光循環(huán)的特征，使用視蛋白(如C1V1)可能特別有用。此外，某些實(shí)施方案允許用于可逆的疾病病況，這可以特別適用于建立用于測(cè)試和/或用于測(cè)試治療對(duì)展現(xiàn)出疾病病況時(shí)和沒(méi)有展現(xiàn)出疾病病況時(shí)的相同動(dòng)物的作用的基線/控制點(diǎn)。使用視蛋白(如C1V1)允許使用光源對(duì)細(xì)胞進(jìn)行控制。ClVl對(duì)光有反應(yīng)，從而引起細(xì)胞的膜電位變化。去除光并且隨后停止活化ClVl允許細(xì)胞返回至它的基線狀態(tài)。存在各種其它的可能性，本文更詳細(xì)地討論了一些所述可能性。
[0097]本公開(kāi)內(nèi)容的不同方面針對(duì)ClVl視蛋白的E122T突變。在本公開(kāi)內(nèi)容的某些實(shí)施方案中，相對(duì)于未突變的視蛋白，E122T突變使ClVl或其變異體的最大吸收移向紅光光
-1'TfeP曰。
[0098]本公開(kāi)內(nèi)容的不同實(shí)施方案涉及經(jīng)過(guò)修飾以供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并且相對(duì)于ChR2，綠光光譜中的最大吸收得到遷移的視蛋白。ClVl視蛋白來(lái)源于視蛋白的組合，并且以高于它所來(lái)源的任一視蛋白的速率表達(dá)。視蛋白ClVl來(lái)源于團(tuán)藻視紫紅質(zhì)通道蛋白(VChRl)和萊茵衣藻視紫紅質(zhì)通道蛋白(ChRl)。所得到的視蛋白ClVl以及其變異體在530nm與546nm之間的波長(zhǎng)下具有最大吸收。
[0099]本公開(kāi)內(nèi)容的某些方面針對(duì)ClVl的進(jìn)一步修飾型式。例如，某些實(shí)施方案包括突變E122T，所述突變E122T使ClVl的最大吸收移向紅光光譜。其它修飾可以包括另一突變E162T，實(shí)驗(yàn)表明除了由E122T突變提供紅移之外，所述另一突變E162T提供了加速的光循環(huán)。
[0100]在一些實(shí)施方案中，提供來(lái)源于VChRl并且轉(zhuǎn)運(yùn)序列置換為來(lái)自ChRl的同源序列的跨膜蛋白。在一些實(shí)施方案中，分子進(jìn)一步包括突變E122T。在其它實(shí)施方案中，分子進(jìn)一步包括E162T和E122T上的突變。在某些實(shí)施方案中，分子響應(yīng)于綠光而活化離子通道。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子的最大光吸收為約546nm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分子的最大光吸收為約535nm。
[0101]在一些實(shí)施方案中，提供一種動(dòng)物細(xì)胞,所述動(dòng)物細(xì)胞包含:表達(dá)對(duì)紅光可響應(yīng)的離子通道的整合外源分子；來(lái)源于VChRl并且包括其置換為來(lái)自ChRl的同源序列的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)序列的外源分子。在一些實(shí)施方案中，外源分子進(jìn)一步包括E122T。在其它實(shí)施方案中，響應(yīng)于分別具有405nm和560nm波長(zhǎng)的光，細(xì)胞的神經(jīng)放電比率為約14%至94%。在其它實(shí)施方案中，分別響應(yīng)于具有405nm和560nm波長(zhǎng)的光，細(xì)胞的神經(jīng)放電比率為約11%至72%。
[0102]本公開(kāi)內(nèi)容的其它示例實(shí)施方案涉及使用雜交ChRl/VChRl嵌合體，所述雜交ChRl/VChRl嵌合體完全不包含ChR2序列，來(lái)源于不能單獨(dú)良好表達(dá)的兩種視蛋白基因并且在本文中稱為C1V1。本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案還涉及通過(guò)添加來(lái)源于KiJ.1通道的膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)而改進(jìn)VChRl的膜靶向。與ChR2相比，由表達(dá)VChRl-EYFP的培養(yǎng)神經(jīng)元得到的共焦圖像揭示細(xì)胞內(nèi)蛋白的比例較大；因此，使用來(lái)源于U I通道的膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)(ts)來(lái)改進(jìn)VChRl的膜靶向。與VChRl-EYFP相比，這種VChRl-ts_EYFP的膜靶向稍微有所增強(qiáng)；然而，從表達(dá)VChRl-ts-EYFP的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中記錄到的平均光電流僅稍微大于VChRl-EYFP的平均光電流。因此，本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案涉及通過(guò)將螺旋更換為來(lái)自其它ChR的相應(yīng)螺旋而修飾的VChRl。例如，在螺旋I和螺旋2置換為來(lái)自ChRl的同源區(qū)段的兩個(gè)嵌合體中發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的改進(jìn)。發(fā)現(xiàn)無(wú)論剪接位點(diǎn)是在螺旋2與螺旋3之間的細(xì)胞內(nèi)環(huán)中(在ChRl殘基Alal45上)或是在螺旋3內(nèi)(在ChRl殘基Trp 163上)，所得到的嵌合體均穩(wěn)定地表達(dá)并且顯示出類似增強(qiáng)的光電流和光譜特性。這種結(jié)果是出人意料的，因?yàn)镃hRl僅具有弱表達(dá)并且不容易整合至大多數(shù)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的膜中。
[0103]本公開(kāi)內(nèi)容的特定方面涉及適合于神經(jīng)科學(xué)的微生物視蛋白基因，從而允許在完整哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的特定細(xì)胞類型中使光脈沖列轉(zhuǎn)變?yōu)楹撩霑r(shí)間尺度的膜電位變化(例如，視紫紅質(zhì)通道蛋白(ChR2)、團(tuán)藻視紫紅質(zhì)通道蛋白(VChRl)以及鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)(NpHR))。ChR2是來(lái)源于單細(xì)胞綠藻萊茵`衣藻的視紫紅質(zhì)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“視紫紅質(zhì)”是包含至少兩個(gè)構(gòu)建嵌段(即視蛋白和共價(jià)結(jié)合的輔因子，通常是維生素A醛(視黃醛))的蛋白質(zhì)。視紫紅質(zhì)ChR2來(lái)源于衣藻基因組中的視蛋白通道視蛋白_2(Chop2)，最初命名為衣藻視蛋白-4(Cop4)。一種去極化視紫紅質(zhì)通道蛋白(ChR2)的時(shí)間特性包括活化和去活的快速動(dòng)力學(xué)，從而給予精確定時(shí)的動(dòng)作電位列的產(chǎn)生。針對(duì)尋求長(zhǎng)時(shí)間尺度活化的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)可以使視紫紅質(zhì)通道蛋白的通?？焖俚慕怆x動(dòng)力學(xué)變慢。例如，視紫紅質(zhì)通道蛋白的某些實(shí)施例應(yīng)用lmW/mm2的光持續(xù)希望去極化的幾乎全部時(shí)間，這可能不太合乎需要。
[0104]本文的大多數(shù)討論是針對(duì)ChR2。除非另外指明，否則本公開(kāi)內(nèi)容包括許多類似的變異體。實(shí)例包括但不限于:Chop2、ChR2-310、Chop2_310、以及團(tuán)藻視紫紅質(zhì)通道蛋白(VChRl)。為了對(duì)VChRl進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，可以參考〃Red-shifted optogeneticexcitation:a tool for fast neural control derived from Volvox carteri, 〃NatNeurosc1.2008年6月，11 (6):631-3.Epub2008年4月23日，所述參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式全部完全地并入本文。在其它實(shí)施例中，可以對(duì)其它視蛋白分子進(jìn)行類似的修飾。例如，可以對(duì)ChR2或VChRl變異體進(jìn)行修飾/突變。此外，修飾的變異體可以與光活化離子泵組合使用。
[0105]本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案包括天然存在的序列的相對(duì)次要氨基酸變異體。在一個(gè)例子中，變異體與天然存在的序列的蛋白質(zhì)序列的同源性大于約75%。在其它變異體中，同源性大于約80%。其它的變異體具有大于約85%、大于90%、或甚至高達(dá)約93%至約95%或約98%的同源性。在此上下文中的同源性意指序列相似性或同一性，其中同一性是優(yōu)選的?？梢允褂眯蛄蟹治鲋幸阎臉?biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)確定這種同源性。本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案的組合物包括本文所提供的蛋白質(zhì)和核酸序列，包括與所提供的序列的同源性高于約50%、與所提供的序列的同源性高于約55%、與所提供的序列的同源性高于約60%、與所提供的序列的同源性高于約65%、與所提供的序列的同源性高于約70%、與所提供的序列的同源性高于約75%、與所提供的序列的同源性高于約80%、與所提供的序列的同源性高于約85%、與所提供的序列的同源性高于約90%、或與所提供的序列的同源性高于約95%的變異體。
[0106]如本文所使用，“刺激靶細(xì)胞”通常被用來(lái)描述對(duì)細(xì)胞的特性進(jìn)行修飾。例如，靶細(xì)胞的刺激物可以造成細(xì)胞膜特性的變化，這可以引起靶細(xì)胞的去極化或極化。在一個(gè)具體的例子中，靶細(xì)胞是神經(jīng)元，并且刺激物通過(guò)促進(jìn)或抑制神經(jīng)元的脈沖(動(dòng)作電位)的產(chǎn)生來(lái)影響脈沖的傳遞。
[0107]關(guān)于對(duì)光活化視蛋白的進(jìn)一步詳細(xì)描述，可以參考Deisseroth等，名稱為^Optically-Based Stimulation of Target Cells and Modifications Thereto, 〃的PCT公布號(hào)W02010/056970，所述專利文獻(xiàn)以引用的方式全部完全地并入本文。
實(shí)施例
[0108]實(shí)施例1:嵌合視紫紅質(zhì)通道蛋白變異體ClVl的開(kāi)發(fā)
[0109]在本實(shí)施例中，尋求將容許在皮質(zhì)切片中以及在活動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中活體內(nèi)驅(qū)動(dòng)皮質(zhì)E/I升高和監(jiān)測(cè)Y振蕩的工具，其中具有三個(gè)關(guān)鍵特性:1)實(shí)現(xiàn)劑量-響應(yīng)研究的效力高得多；2)低脫敏作用，以允許E/Ι平衡的階梯狀變化；以及3)紅移激發(fā)，以允許類似地驅(qū)動(dòng)相同制劑中的不同的群。
[0110]這些實(shí)驗(yàn)最初嘗 試使用VChRl，所述VChRl顯示紅移和降低的脫敏作用14，但先前研究表明表達(dá)VChRl的細(xì)胞中的光電流較小(-100-150pA14)，并且不能在下游細(xì)胞(未示出)中引發(fā)穩(wěn)定的突觸活性。實(shí)際上，當(dāng)首先嘗試在細(xì)胞中表達(dá)VChRl時(shí)，僅觀察到小的光電流(圖1A)，這與先前的發(fā)現(xiàn)一致。與VChRl-EYFP相比，添加來(lái)源于Kir2.1通道的膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)以便產(chǎn)生VChRl-1s-EYFP僅實(shí)現(xiàn)了不高的光電流增強(qiáng)的趨向(圖1B)。然而，要注意在ChR2中，用來(lái)自ChRl的同源區(qū)域置換跨膜區(qū)段增強(qiáng)了膜靶向并且增強(qiáng)了光電流，假設(shè)在VChRl的螺旋與來(lái)自其它ChR的相應(yīng)螺旋之間的類似系統(tǒng)性交換可以類似地引起HEK細(xì)胞中的膜表達(dá)增強(qiáng)。
[0111]材料和方法
[0112]通過(guò)重疊延伸PCR將野生型或人的密碼子優(yōu)化的視紫紅質(zhì)通道蛋白-1與人密碼子改適的VChRl (GenBankTM保藏編號(hào)A⑶70142.1)融合來(lái)產(chǎn)生嵌合視紫紅質(zhì)通道蛋白變異體C1V1。通過(guò)重疊PCR產(chǎn)生ClVl剪接變異體。變異體一包含ChRl的前145個(gè)氨基酸和VChRl的氨基酸102至316。變異體二包含ChRl的前162個(gè)氨基酸和VChRl的氨基酸119 至 316。將所得到的嵌合 PCR 片段克隆至 pECFP-Nl(Clonetech, Mountain View, CA)和慢病毒表達(dá)載體中的CaMKIIa啟動(dòng)子下。膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)來(lái)源于Kir2.1通道。通過(guò)對(duì)編碼序列和剪接位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序來(lái)確認(rèn)突變。對(duì)于AAV介導(dǎo)的基因遞送，將視蛋白-EYFP融合物連同CaMKIIa啟動(dòng)子一起亞克隆到pAAV2_MCS載體的修飾型式中。通過(guò)以相反的方向在不相容1x位點(diǎn)對(duì)(1xP和lox2722)之間克隆視蛋白-EYFP序列盒以便產(chǎn)生在延長(zhǎng)因子Ia(EF-1a)啟動(dòng)子控制下的雙f 1xed倒置開(kāi)放閱讀框(DlO)來(lái)實(shí)現(xiàn)Cre-依賴性視蛋白表達(dá)。所有構(gòu)建體可從戴瑟羅斯實(shí)驗(yàn)室(Deisseroth Lab) (www.0ptogenetics.0rg)獲得。
[0113]在補(bǔ)充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺(Biochrome,柏林,德國(guó))、以及l(fā)%(w/w)青霉素(penicillin)/鏈霉素(str印tomycin)的杜爾貝科氏最低必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞。將細(xì)胞以0.175X106個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度接種到蓋玻片上，并且補(bǔ)充I μ M全反式維生素A醛。用Fugene6(羅氏(Roche)公司，曼海姆，德國(guó))來(lái)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并且在20至28小時(shí)后做記錄。通過(guò)常規(guī)的全細(xì)胞膜片鉗來(lái)記錄瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中的光電流。外部溶液包含[mM]:140NaCl、2CaCl2、2MgCl2、2KCl、10HEPES(pH7.2)。內(nèi)部溶液包含[mM]:110NaCl、10EGTA、2MgCl2、lCaCl2、5KCl、10HEPES(使用 CsOH 或 HCl 將 pH 調(diào)至 7.2)。用 P-97 型拉針儀(micropipette puller)(薩特儀器公司(Sutter Instrument C0.),諾瓦托，加拿大)將膜片吸管從具有1.5ΜΩ至2ΜΩ電阻的分血器微管(Hecht-Assistant,桑德海姆，德國(guó))中拉出。用EPC7(HEKA，Elektronik GmbH，蘭布雷希特，德國(guó))放大器進(jìn)行HEK細(xì)胞的全細(xì)胞膜片鉗。以20kHz對(duì)類似數(shù)據(jù)進(jìn)行取樣，用Digidatal440 (分子儀器公司(Molecular Devices),福斯特市，CA)進(jìn)行數(shù)字化并且使用pClampl0.1軟件(分子儀器公司，福斯特市，CA)來(lái)顯示。為了記錄波長(zhǎng)相關(guān)性，將來(lái)自Polychrome V單元(TILLPhotonics公司，普拉內(nèi)格，德國(guó))的光導(dǎo)管安裝在奧林巴斯1X70顯微鏡的表皮發(fā)光端口上。為了將光反射進(jìn)入物鏡中，使用分光鏡(70%R/30%T)從而在蓋玻片上在470nm下產(chǎn)生大約I X IO22個(gè)光子HT2iT1的最終光子密度。為了記錄作用光譜，使用僅50%的光強(qiáng)度。用Tillvision軟件(TILL Photonics,普拉內(nèi)格,德國(guó))與pClamp軟件同步來(lái)對(duì)polychromeV單元進(jìn)行控制。
[0114]結(jié)果
[0115]有趣的是，發(fā)現(xiàn)了嵌合體的最穩(wěn)定的改進(jìn)，在所述嵌合體中螺旋I和螺旋2置換為來(lái)自ChRl的同源物(圖1C至圖1D)。在培養(yǎng)HEK293細(xì)胞中測(cè)試了用于膜靶向的兩種嵌合ChRl-VChRl通道和光電流大小。第一種嵌合ChRl-VChRl通道被接合在ChRl的Alal45之后的第二細(xì)胞內(nèi)環(huán)中，并且第二種嵌合ChRl-VChRl通道被接合在ChRl的Trpl63之后的螺旋三內(nèi)(圖1C)。然而，這兩種變異體在HEK293細(xì)胞中接近同等良好地表達(dá)(圖1D)，在培養(yǎng)的神經(jīng)元中第二變異體更穩(wěn)定地表達(dá)(圖1E)，并且與VChRl-EYFP相比顯示大為增強(qiáng)的峰值光電流(888±128pA，n=ll個(gè)細(xì)胞;ρ〈0.0005)(圖1B)。相對(duì)于ChR2，作用光譜峰保持穩(wěn)定的紅移(表1 ;圖1F)，并且嵌合體的離子選擇性類似于先前針對(duì)ChR2和VChRl所報(bào)道的離子選擇性(圖1G)。將Kir2.1轉(zhuǎn)運(yùn)序列添加至這種雜交體中傾向于進(jìn)一步增加光電流(1104±123pA，n=12 個(gè)細(xì)胞；與 VChRl-EYFP 相比 ρ〈0.0005，與 C1V1-EYFP 相比 ρ=0.23 ；圖1B ;表1至表2)。所得到的雜交ChRl/VChRl嵌合體完全不包含ChR2序列，明顯來(lái)源于不能單獨(dú)地良好表達(dá)的兩種視蛋白基因，并且在本文被稱為ClVl (圖1A、圖1H)。
[0116]實(shí)施例2 =ClVl的光電流動(dòng)力學(xué)的優(yōu)化
[0117]這種紅移的視蛋白的快速去活特性28將是最大時(shí)間以及與由位于向著可見(jiàn)光譜藍(lán)光端的波長(zhǎng)活化的其它視蛋白光譜分離所需要的。然而，發(fā)現(xiàn)由CIVl-ts-EYFP顯示的光電流展現(xiàn)出比ChR2慢>10倍的衰變，并且甚至比原始VChRl慢的衰變(圖2A ;針對(duì)CIVl-ts-EYFP (n=4)和 VChRl-EYFP (n=5)，T去活分別為 156 ± 12ms 和 132 ± 12ms ;表 1)，潛在地排除了使用ClVl用于要求迅速放電速率的應(yīng)用。為了校正ClVl的光電流動(dòng)力學(xué)，使用已知的結(jié)構(gòu)模型22’28(圖1H)搜尋發(fā)色團(tuán)區(qū)域，用于具有光循環(huán)動(dòng)力學(xué)更快、鈍化減小以及藍(lán)光吸收減少的突變。接下來(lái)，基于螺旋2中富含谷氨酸的基序的研究將谷氨酸-122突變?yōu)樘K氨酸，顯示這種突變減小了鈍化3。
[0118]材料和方法
[0119]通過(guò)定點(diǎn)誘變(安捷倫科技(Agilent Technologies),帕洛阿爾托,CA)在質(zhì)粒中產(chǎn)生ClVl載體的所有點(diǎn)突變。膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)來(lái)源于U.1通道。通過(guò)對(duì)編碼序列和剪接位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序來(lái)確認(rèn)突變。
[0120]結(jié)果
[0121]ChETA同源性突變E162T28明顯使光循環(huán)加速了幾乎3倍(T_58±4.7ms，n=7個(gè)細(xì)胞；圖2A，表1)。出人意料地，鑒于ChR2或其它微生物視蛋白中的類似突變引起紅移28’29，在ClVl中這種突變使作用光譜在不希望的方向上移動(dòng)，藍(lán)移至530nm(圖1F ;表1)。與ChR2去活46%相比，C1V1-E122T僅鈍化26% (圖2B，表1);另外，光譜進(jìn)一步紅移至546nm(圖1F，表1)并且顯示ClVl作用光譜有問(wèn)題的藍(lán)肩峰明顯消失。最后，在雙重突變體E122T/E162T中，電流的鈍化甚至低于在E122T突變體中的鈍化，并且與E162T相比光循環(huán)仍然更快(Ti活34±4.9ms,n=7個(gè)細(xì)胞；圖2A，圖2C，表1)，同時(shí)保留紅移并且不存在作用光譜的藍(lán)肩峰。此外，當(dāng)E122突變體大幅減少光電流振幅(圖2D)時(shí)，雙重突變體恢復(fù)原始CIVl-ts所特有的極高電流。因此，在雙重突變體、轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)的ClVl嵌合體中保留個(gè)別突變體的多種出人意料和有用的特性。
[0122]表1:ChR2、VChRl以及ClVl變異體的光譜/動(dòng)力學(xué)特性。
[0123]使用峰值活化波長(zhǎng)下的2ms光脈沖，在HEK細(xì)胞中記錄峰值活化波長(zhǎng)。使用最大活化波長(zhǎng)下的2ms光脈沖，在培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中記錄去活動(dòng)力學(xué)(τ 和峰值光電流。為了鑒別出用于與ChR2組合活化的最優(yōu)變異體，在HEK細(xì)胞中記錄405nm和560nm下的響應(yīng)百分比。使用300ms光脈沖來(lái)記錄光電流的脫敏作用，從而對(duì)峰值光電流(Iiic)向穩(wěn)定狀態(tài)的衰變進(jìn)行定量。
【權(quán)利要求】
1.一種動(dòng)物細(xì)胞，其包含在細(xì)胞膜上表達(dá)的光活化蛋白，其中所述蛋白: 是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列； 對(duì)光可響應(yīng)；并且 當(dāng)用光照射所述細(xì)胞時(shí)，能夠介導(dǎo)所述細(xì)胞中的去極化電流。
2.如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述蛋白進(jìn)一步在位于所述嵌合光響應(yīng)性蛋白的第二跨膜螺旋與第三跨膜螺旋之間的細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域中包含置換，其中所述細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域的至少一部分置換為來(lái)自所述ChRl的相應(yīng)部分。
3.如權(quán)利要求2所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域的所述部分置換為來(lái)自所述ChRl的延伸至所述ChRl的氨基酸殘基A145的相應(yīng)部分。
4.如權(quán)利要求2所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述蛋白進(jìn)一步在所述嵌合光響應(yīng)性蛋白的第三跨膜螺旋中包含置換，其中所述第三跨膜螺旋的至少一部分置換為ChRl的相應(yīng)序列。
5.如權(quán)利要求4所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域的所述部分置換為來(lái)自所述ChRl的延伸至所述ChRl的氨基酸殘基W163的相應(yīng)部分。
6.如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述嵌合蛋白包含與SEQID NO:1中所示的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的動(dòng)物細(xì)胞，其進(jìn)一步包含SEQID N0:1的氨基酸殘基E122和/或E162上的突變。`
8.如權(quán)利要求7所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中氨基酸E122上的所述突變是突變?yōu)樘K氨酸。
9.如權(quán)利要求7所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中氨基酸E162上的所述突變是突變?yōu)樘K氨酸。
10.如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述嵌合蛋白包含SEQID NO:3的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述嵌合蛋白包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述嵌合蛋白包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述蛋白進(jìn)一步包含C末端膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)。
14.如權(quán)利要求13所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述C末端膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
15.如權(quán)利要求13或14所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)是通過(guò)連接子連接至所述蛋白的C末端上。
16.如權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物細(xì)胞,其中所述蛋白進(jìn)一步包含選自由以下組成的組的C末端熒光蛋白:EYFP、GFP、CFP、以及RFP。
17.如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物細(xì)胞,其中所述動(dòng)物細(xì)胞選自由以下組成的組:神經(jīng)元細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、以及干細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物細(xì)胞，其進(jìn)一步包含在所述細(xì)胞膜上表達(dá)的第二光活化蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述第二光活化蛋白是當(dāng)用光照射所述細(xì)胞時(shí)能夠介導(dǎo)所述細(xì)胞中的超極化電流的蛋白。
20.如權(quán)利要求19所述的動(dòng)物細(xì)胞，其中所述第二光活化蛋白選自由以下組成的組:NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1 以及 GtR3。
21.—種細(xì)胞群，其包含如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
22.—種非人動(dòng)物，其包含如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
23.—種腦組織切片，其包含如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
24.一種分離的多核苷酸，其包含編碼在細(xì)胞膜上表達(dá)的光活化蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列；對(duì)光可響應(yīng)；并且當(dāng)用光照射所述細(xì)胞時(shí)，能夠介導(dǎo)所述細(xì)胞中的去極化電流。
25.如權(quán)利要求24所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含與編碼SEQIDNO:1的氨基酸序列的核苷酸序列至少95%相同的序列。
26.如權(quán)利要求24所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼SEQID NO:3的氨基酸序列的核苷酸序列。
27.如權(quán)利要求24所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼SEQID NO:5的氨基酸序列的核苷酸序列。
28.如權(quán)利要求24所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼SEQID NO:7的氨基酸序列的核苷酸序列。
29.—種表達(dá)載體,其包含如權(quán)利要求25至28所述的任何多核苷酸。
30.如權(quán)利要求29所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體是病毒載體。
31.如權(quán)利要求30所述的表達(dá)載體，其中所述病毒載體選自由以下組成的組:AAV載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體、以及慢病毒載體。
32.—種使用如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞的方法，所述方法包括用光來(lái)活化光活化蛋白。
33.如權(quán)利要求32所述的使用細(xì)胞的方法，所述方法包括用紅光來(lái)活化所述光活化蛋白。
34.如權(quán)利要求32所述的使用細(xì)胞的方法，所述方法包括用綠光來(lái)活化所述光活化蛋白。
35.一種選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元去極化的方法，所述方法包括:選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經(jīng)元去極化，其中所述第一光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第一波長(zhǎng)的光時(shí)被去極化；或選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經(jīng)元去極化，其中所述第二光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第二波長(zhǎng)的光時(shí)被去極化；其中所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。
36.一種選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元去極化的方法，所述方法包括:在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)第一光活化蛋白；并且在抑制性神經(jīng)元中表達(dá)第二光活化蛋白，其中所述第一光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第一波長(zhǎng)的光時(shí)被獨(dú)立地去極化，并且其中所述第二光活化蛋白當(dāng)被曝露于具有第二波長(zhǎng)的光時(shí)被獨(dú)立地去極化；其中所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。
37.如權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述第一光活化蛋白包含與SEQID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13或SEQ IDNO: 14中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述第一光活化蛋白由綠光活化，并且所述第二光活化蛋白由紫光活化。
39.如權(quán)利要求35至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經(jīng)元是在活的非人動(dòng)物中。
40.如權(quán)利要求35至39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經(jīng)元是在來(lái)自非人動(dòng)物的活腦切片中。
41.如權(quán)利要求35至40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經(jīng)元是來(lái)自前額葉皮質(zhì)。
42.如權(quán)利要求35至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述興奮性神經(jīng)元包含錐體神經(jīng)元，并且所述抑制性神經(jīng)元包含小白蛋白神經(jīng)元。
43.一種用于鑒別選擇性地抑制存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經(jīng)元的去極化的化合物的方法，所述方法包括: (a)用具有第一波長(zhǎng)的光選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經(jīng)元去極化，或用具有第二波長(zhǎng)的光選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經(jīng)元去極化；其中所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來(lái)源于來(lái)自強(qiáng)壯團(tuán)藻的VChRl和來(lái)自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列； (b)測(cè)量響應(yīng)于選擇性地使包含第一光活化蛋白的所述興奮性神經(jīng)元去極化的興奮性突觸后電位(EPSP)，或測(cè)量響應(yīng)于選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經(jīng)元去極化的抑制性突觸后電流(IPSC)； (c)使所述興 奮性神經(jīng)元或所述抑制性神經(jīng)元與化合物接觸；以及 (d)測(cè)量所述興奮性突觸后電位(EPSP)或測(cè)量所述抑制性突觸后電流(IPSC)以確定使所述興奮性神經(jīng)元或所述抑制性神經(jīng)元與所述化合物接觸是否選擇性地抑制任一神經(jīng)元的去極化。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述第一光活化蛋白包含與SEQID NO: 1、SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述第一光活化蛋白由綠光活化，并且所述第二光活化蛋白由紫光活化。
46.如權(quán)利要求43至45中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經(jīng)元是在活的非人動(dòng)物中。
47.如權(quán)利要求43至46中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經(jīng)元是在來(lái)自非人動(dòng)物的活腦切片中。
48.如權(quán)利要求43至47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經(jīng)元是來(lái)自前額葉皮質(zhì)。
49.如權(quán)利要求43至48中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述興奮性神經(jīng)元包含錐體神經(jīng)元，并且所述抑制性神經(jīng)元包含小白蛋白神經(jīng)元。
50.如權(quán)利要求43至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述化合物是組合化學(xué)文庫(kù)中的成員。
51.如權(quán)利要求43至50中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括在心臟組織上測(cè)定所述化合物以確定所述化合物是`否不利地影響心臟動(dòng)作電位。
【文檔編號(hào)】C12N15/00GK103492564SQ201180061697
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月5日
【發(fā)明者】K·戴瑟羅斯, O·伊扎爾, L·芬諾, P·黑格曼, M·普里格 申請(qǐng)人:斯坦福大學(xué)托管董事會(huì)