培養(yǎng)的胰島的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了制備可包含pancreatite的胰島的方法。所述方法涉及例如酶消化破壞胰腺和/或其部分，和在培養(yǎng)基中接種包含胰島的經(jīng)回收細胞產(chǎn)物，所述培養(yǎng)基包含至少可檢測量的內(nèi)分泌組織和/或外分泌組織。
【專利說明】培養(yǎng)的胰島
【背景技術】
[0001]I型糖尿病是由于胰腺的β細胞不能分泌足夠胰島素引起的廣泛代謝紊亂。大部分細胞類型吸收葡萄糖都需要胰島素，并且胰島素產(chǎn)量不足造成葡萄糖吸收的降低和血糖水平的提高。不經(jīng)合適治療，糖尿病能致死。盡管能拯救生命，胰島素治療經(jīng)常不提供對血糖的充分控制以防止所述疾病導致短命的并發(fā)癥，并且這能深入研究實現(xiàn)和維持血糖量正常的更好的方法。在提出的更新的治療策略中，移植獲自其他人或動物的胰腺β胰島細胞在世界范圍內(nèi)取得了巨大關注。這是因為胰島細胞移植不僅能恢復胰島素分泌單元，也能恢復響應朗格漢斯島內(nèi)外所產(chǎn)生多種神經(jīng)和體液信號的胰島素釋放的精確調(diào)節(jié)。
[0002]自從第一個試圖通過移植同種異體移植供體胰島來緩解I型糖尿病的實驗以來，所述領域受到對改善從供體胰島收回和/或獲得胰島方法需求的挑戰(zhàn)。世界范圍內(nèi)對進一步開發(fā)通過移植胰島治療I型糖尿病的概念作出巨大努力，但是在動物模型中開發(fā)的所述技術的臨床應用充滿挑戰(zhàn)。
[0003]所述胰島的來源是首要關注問題，并且從供體胰腺分離需要與供體器官的來源、供給和病癥有關問題的解決方法。就這個目的而言認為依賴于人體器官的充足夠供應是無用的，從而積極地尋找替代來源(Bonner-Weir, S.等，New sources of pancreaticβ -cells (《膜腺 β 細胞的新來源》)，Nat.Biotechnol.23:857 - 861，2005;Hering, B.J.等,Prolonged diabetes reversal after intraportal xenotransplanation ofwild-type porcine islets in immunosuppressed nonhuman primates (在免疫抑制非人靈長類動物中野生型豬胰島的門靜脈內(nèi)異種移植后延長了糖尿病的復發(fā))，Nat.Med., 12:301 - 303, 2006;Inada, A.;Bonner-ffeir, S.等，How can we get more β cells?(《我們?nèi)绾文苋〉酶嗟摩录毎?，Curr.Diab.Rep.,6:96 - 101, 2006)。
[0004]認為多種哺乳動物是異種胰島移植的最佳候選。對有潛力的哺乳動物而言，出于很多強有力的理由 ，認為豬是選擇異種胰島移植的供體物種。豬與人共有很多生理相似性，并且很多年來豬胰島素顯示了臨床功效。豬作為食物來源飼養(yǎng)，并且通過在控制環(huán)境下飼養(yǎng)以確保豬胰島異種移植安全性的而提供符合倫理的供體胰島來源。然而，很多實驗室在過去10多年的經(jīng)驗顯示相較分離人體(KenmoChi，T.等,Improved quality and yield of islets isolated from human pancreas usingtwo-step digestion method (《使用兩步消化方法從人胰腺分離胰島的質(zhì)量和產(chǎn)率的提高》)，Pancreas20:184 - 190，2000)、牛(Figliuzzi, M.等，Influence of donor age onbovine pancreatic islet isolation (《供體年齡對牛膜島分離的影響》)，Transplantation, 70:1032 - 1037，2000)或嚙齒動物胰島(Shapiro,A.M.等，High yield of rodentislets with intraductal collagenase and stationary digestion—a comparisonwith standard technique (《管內(nèi)膠原酶和靜止消化的卩齒齒動物胰島的高產(chǎn)率一與標準技術比較》)，Cell Transplant., 5:631 - 638, 1996),分離豬胰島似乎更加困難(Finke,E.等，Large scale isolation, function, and transplantation of islets ofLangerhans from the adult pig pancreas (《成年豬胰腺的朗格漢斯島的大規(guī)模分離、功能和移植》).Transplant.Proc.23:772 - 773，1991;Giannarellij R.等，Preparationof pure, viable porcine and bovine islets by a simple method (〈〈通過簡單方法制備純的、可變的豬和牛膜島》).Transplant.Proc.，26:630 - 631，1994;Marchetti，P.等，Automated largescale isolation, in vitro function and xenotransplantation ofporcine islets of Langerhans (《豬朗格漢斯島的自動大規(guī)模分離、體外功能和異種移植》)，Transplantation52:209 - 213，1991 ;0，Neil，J.J.等，The isolation and functionof porcine islets from market weight pigs (《上市體重豬的豬胰島的分離和功能》).Cell Transplant.，10:235 - 246，2001 ;Toso，C.等，Isolation of adult porcine isletsof Langerhans (《成年豬朗格漢斯島的分離》).Cell Transplant.，9:297 - 305，2000)。
[0005]例如，豬胰島不太緊湊，并且在分離過程和體外培養(yǎng)的延長期內(nèi)易于片段化(Ricordi, C.等，A method for the mass isolation of islets from the adult pigpancreas (從成年豬胰腺大量分離胰島的方法)，Diabetes, 35:649 - 653，1986)。另外，數(shù)個組記載了供體豬的年齡、甚至品系顯著影響胰島分離過程，證明小的所謂上市大小豬(〈6月齡)特別難以作為可移植胰島的來源(Bottino, R.等，Isolation outcomeand functional characteristics of young and adult pig pancreatic isletsfor transplant ation studies (《對移植研究的年輕和成年豬胰島的分離結果和功能特性〉〉)，Xenotransplantation, 14:74 - 82，2007; Dufrane, D.等,Impact of porcineislet size on cellular structure and engraftment after transplantation:Adultversus young pigs (《豬胰島大小對細胞結構和移植后植入的影響:成年對比年輕豬》)，Pancreas30:138 - 147，2005; Toso, C.等，Isolation of adult porcine islets ofLangerhans (《成年豬朗格漢斯島的分離》).Cell Transplant., 9:297 - 305, 2000) ?成年豬(>2歲齡)胰島不僅提供更高的產(chǎn)率，也保留了在分離和培養(yǎng)過程中保持完整形態(tài)的能力，以及移植后更高的功能特性。盡管很多組在試圖從年輕豬中分離胰島時遇到了挑戰(zhàn)，但上市體重供體豬(<80kg=〈12月齡)優(yōu)于退役的種畜(>200kg=>2歲齡)，這是由于其豐富性、更低的動物和飼養(yǎng)成本，并且其更適合符合異種移植供體組織的調(diào)控準則。如果通過培養(yǎng)更易得來源的供體胰島以擴大胰島細胞(包括但不必限于β細胞)的供給，其可以不太緊湊，并且在細胞培養(yǎng)中可以顯示或不顯示片段化屬性(例如獲自年輕豬的胰島)，這種新的胰島來源可以提供足夠材料用于胰島素依賴性糖尿病的新治療。
[0006]然而，盡管為改善胰島分離和制備技術作出很多努力，所述領域受到包含少于5%內(nèi)分泌組織腺體的酶消化局限性和異常變化的限制。因此，從單個供體胰腺中收集胰島產(chǎn)生的胰島量經(jīng)常不足以逆轉(zhuǎn)受體的糖尿病，從而經(jīng)常必需考慮多個供體以治療單個受體。用于緩解對人胰腺供給不足的需求的異種移植潛能依賴于從來源胰腺分離和制備胰島技術的功效和效率的提高(Hering, B.J.等，The International xenotransplantationAssociation consensus statement on conditions for undertaking clinical trialsof porcine islet products in typeldiabetes—executive summary (國際異種移植協(xié)會關于對I型糖尿病中豬胰島產(chǎn)物進行臨床試驗的條件的共識聲明一執(zhí)行摘要)，Xenotransplantationl6:196 - 202, 2009)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明提供了制備胰島群和胰島的新方法，所述胰島群可包含異質(zhì)或均質(zhì)的pancreatite,所述胰島可包含從這種方法制備的pancreatite。在實施方式中,所述胰島可包含"pancreatite"。在實施方式中，本發(fā)明方法包含用例如酶消化破壞胰腺和/或其部分，和培養(yǎng)基中接種包含胰島的經(jīng)回收細胞產(chǎn)物，所述培養(yǎng)基包含至少可檢測量的內(nèi)分泌組織和/或外分泌組織，例如獲自供體胰腺的內(nèi)分泌組織和/或外分泌組織。
[0008]本發(fā)明的新方法能獲得、制備和/或培養(yǎng)足夠質(zhì)量和數(shù)量的胰島以努力符合上面需要(即使供體組織生成的胰島在細胞產(chǎn)物分離過程和延長的體外培養(yǎng)期中可能不成熟、不太緊湊和/或易于片段化，例如年輕的、獲自所謂上市大小豬的胰島，〈6月齡)。本發(fā)明的新方法生成可以包含后面稱為“pancreatite”結構的新胰島組合物。本發(fā)明的"pancreatite〃可以在培養(yǎng)中形成，并且包含胰島(內(nèi)分泌)和/或外分泌組織的組合。
[0009]在下面詳細描述的實施方式中描述了本發(fā)明的其他特性和優(yōu)勢，并且其從實施方式中顯而易見。
[0010]附圖簡要說明
[0011]圖1顯示了通過用于插管腹腔干(CT)和腸系膜上動脈(SMA)的降主動脈片段切割的胰腺；
[0012]圖2包含的圖片顯示了 LifePort?機器上豬胰腺的低體溫灌注保存；更低的圖顯示了 LifePoil?的原理特性；中間圖顯示裝入灌注盒中和通過環(huán)形密封套管鉤住灌注入口的豬胰腺的細節(jié)；這個專有的套管能以環(huán)形密封套管中夾住的主動脈貼片方式同時灌注腹腔干(CT)和腸系膜上動脈(SMA)(見圓形小圖)；所述小圖顯示了通過環(huán)形密封套管開口暴露以觀察的主動脈貼片(AP)上CT和SMA的開口 ；
[0013]圖3是第O天分離后非培養(yǎng)的幼豬胰島的光學顯微圖；
[0014]圖4A-H的光學顯微圖顯示了在培養(yǎng)過程的不同階段中包含胰島的經(jīng)培養(yǎng)細胞產(chǎn)物；胰島由雙硫腙染色鑒定， 并且與顯示灰-褐色的未染色外分泌組織相反，顯示紫-紅色，A=24 小時(xlOO)、B=24 小時(xlOO), C=48 小時(xlOO)、D=48 小時(x200)、E=5 天(xl00)、F=6 天(xlOO)、G=6 天(x200)、H=6 天(xlOO);和
[0015]圖5顯示給予裸小鼠包含pancreatite的豬胰島的活力測試的數(shù)據(jù)，所述豬胰島從HMP灌注24小時后保存的胰腺分離。
【具體實施方式】
[0016]本文所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復數(shù)指代形式，除非文中另有明確說明。因此，例如，提及“細胞”指的是一種或多種細胞，并且包含本領域技術人員所知的其等同物，等等。
[0017]術語"pancreatite"指例如外分泌材料存在時,在分散胰島的培養(yǎng)中形成的成熟的和/或不成熟的胰島聚集物。
[0018]術語"小分子"指例如核酸、肽、多肽、氨基酸、糖、脂質(zhì)或其他有機或無機分子。
[0019]本文使用的術語〃水腫〃指例如細胞、組織或漿膜腔中積累的過量水狀液。
[0020]本文使用的術語〃器官〃、〃組織〃、〃供體器官〃和〃供體組織〃指任何天然或工程改造的器官或組織，例如胰腺或其片段或部分。
[0021]本文使用的術語〃灌注〃指液體流過組織。灌注器官和灌注的技術描述于例如Fahy等的美國專利號5，723，282，其全文納入本文。
[0022]本文使用的術語"培養(yǎng)"指將細胞維持于其能增殖、保留其功能狀態(tài)的條件下。例如，培養(yǎng)的胰島增殖并且保留其胰島素生成的能力。細胞能在包含合適生長因子(如生長因子混合物)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0023]涉及胰島使用的術語"自體"指獲自個體的包含胰島的細胞產(chǎn)物，所述個體根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)后給予可包含pancreatite的胰島。
[0024]涉及胰島使用的術語〃異源〃指獲自不同個體的包含胰島的細胞產(chǎn)物，所述不同個體與根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)后給予可包含pancreatite胰島的個體不同。
[0025]本發(fā)明提供了制備胰島群和胰島的新方法，所述胰島群可包含異質(zhì)或均質(zhì)的pancreatite,所述胰島可包含從這種方法制備的pancreatite。在實施方式中,所述胰島可以包含"pancreatite"。在實施方式中,本發(fā)明的方法包含用例如酶消化破壞包含胰島的胰腺和/或供體組織，和在培養(yǎng)基中接種包含胰島的經(jīng)回收細胞產(chǎn)物，所述培養(yǎng)基包含至少可檢測量的外分泌組織，例如獲自供體胰腺的外分泌組織。
[0026]本發(fā)明的新方法能獲得、制備和/或培養(yǎng)足夠質(zhì)量和數(shù)量的胰島以努力符合上面需要(即使供體胰島在分離過程和延長的體外培養(yǎng)期中不太緊湊和易于片段化，例如年輕的、獲自所謂上市大小豬的胰島，〈6月齡)。本發(fā)明的新方法生成可以包含"pancreatite"的新胰島的組合物。本發(fā)明的"pancreatite"可以在培養(yǎng)中形成,并且包含胰島和外分泌組織的組合。
[0027]本公開也涉及制備的可包含pancreatite的胰島在植入個體用于糖尿病體內(nèi)治療的應用。本公開還涉及使用體外制備的可包含pancreatite胰島的方法，以體內(nèi)修復器官從而具有與正常胰腺組織中所觀察相同的功能、形態(tài)和組織特性。制備、獲得和/或培養(yǎng)可包含pancreatite的胰島的能力為糖尿病相關的體外研究和治療開辟了重要的新途徑。
`[0028]本公開也提供了可包含pancreatite的胰島。本公開所述的可包含pancreatite的胰島能在膜上培養(yǎng)和/或形成，所述膜可以是平坦表面，例如有硅酮膜的燒瓶。在實施方式中，所述膜置于錐形容器或者容器表面積從容器頂部向容器底部減少的容器中。在實施方式中，所述膜是透氣膜。
[0029]本公開也提供了可包含pancreatite的胰島，其植入受體后可以提供對所述受體血糖狀態(tài)快得多的影響。
[0030]本公開也描述了能制備可包含pancreatite胰島的方法，例如有與天然分離的胰島所顯示相似的組織特性和胰島素生成能力的功能胰島。本公開所述方法能用于生成可包含pancreatite胰島的儲液，以用于實驗性研究或治療胰島移植。在實施方式中，可包含pancreatite的大量胰島可以通過本方法從相對少量胰腺組織中生成。在實施方式中,可包含pancreatite的胰島和使用本公開方法獲得的細胞材料能用于生成可包含pancreatite的其他胰島(即在實施方式中所述可包含pancreatite的胰島是自復制的。本方法因此可以提供生成大量實驗上有用的可包含pancreatite胰島的方法。另外，鑒于可包含pancreatite的胰島的特性，本文所公開方法可用于臨床應用以提供治療胰島移植或研究的胰島來源。
[0031]在實施方式中，可包含pancreatite的胰島能從包含胰島的細胞產(chǎn)物中制備,所述包含胰島的細胞產(chǎn)物獲自一個或多個新鮮、冷凍、或低溫處理供體的胰腺。在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物可包含不成熟胰島、成熟胰島或其混合物。在實施方式中，可包含pancreatite的胰島能從獲自任何動物例如哺乳動物的含胰島細胞產(chǎn)物中制備。合適的哺乳動物對象包含嚙齒動物例如小鼠、大鼠、豚鼠和兔，非嚙齒類哺乳動物例如豬、狗、貓、棉羊、馬、牛和山羊，靈長動物例如大猩猩和人。在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物可以獲自胎兒供體、新生兒供體或年輕供體。
[0032]由本公開方法制備的可包含pancreatite的胰島能用于很多試驗。在實施方式中，所述可包含pancreatite的胰島能用于例如篩選和評價促胰島素化合物、藥物、其他大分子或小分子。在另一個實施方式中，所述可包含pancreatite的胰島能用于例如測量胰島素含量和分析胰島素生物合成。在實施方式中，由本公開方法制備的可包含pancreatite的胰島能用于鑒定小分子或藥物化合物對第二信使活性的影響(例如cAMP、三磷酸肌醇(IP, I丐))。本公開的其他實施方式涉及使用可包含pancreatite的胰島以測量胰島的代謝。另外，由本公開方法制備的可包含pancreatite的胰島能用于測量胰高血糖素和促生長素抑制素的釋放，和通過各種小分子和藥物化合物調(diào)節(jié)胰高血糖素和促生長素抑制素。
[0033]在實施方式中，制備可包含pancreatite的胰島的方法包含在培養(yǎng)基中接種含胰島的細胞產(chǎn)物。在實施方式中，所述培養(yǎng)基在膜上存在，所述膜可以位于容器例如培養(yǎng)瓶中。在實施方式中，所述膜是可透氣的硅膠膜。在實施方式中，所述膜是可透氣或不透氣的平坦膜。在實施方式中，所述膜是透氣膜。在其他實施方式中，培養(yǎng)基在聚碳酸酯透氣硅膠膜培養(yǎng)瓶上存在。在實施方式中，制備可包含pancreatite胰島的方法可以包含膜上培養(yǎng)含胰島的細胞產(chǎn)物，所述膜可以是平坦的，例如硅膠膜。在實施方式中，所述培養(yǎng)基在可選位于培養(yǎng)瓶的膜上存在。在實施方式中，所述膜是可透氣的硅膠膜。在實施方式中，所述膜是可透氣或不透氣的平坦膜。在實施方式中，所述膜是透氣膜。在其他實施方式中，培養(yǎng)基在聚碳酸酯透氣娃膠膜培養(yǎng)瓶中存在。
[0034]在實施方式中，制備可包含pancreatite胰島的方法可以在威爾森沃爾夫制造公司(Wilson Wolf Manufacturing)(明尼蘇達州威爾森沃爾夫制造有限公司(Wilson WolfInc.)生產(chǎn)的透氣培養(yǎng)瓶中包括含有胰島的細胞產(chǎn)物。在實施方式中，透氣培養(yǎng)瓶包含硅膠膜，并且所述包含胰島的細胞產(chǎn)物獲自例如動物如哺乳動物如人或豬。在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物可以獲自 胎兒供體、新生兒供體或年輕供體。
[0035]本公開的方法可以利用包含胰島的分散細胞產(chǎn)物，并且因此通?？墒褂冒葝u的所有經(jīng)分離細胞產(chǎn)物。因此，本公開的方法避免了胰島的人工選擇，并且因此在樣品制備中節(jié)省了大量時間。
[0036]本公開方法提供了對當前所用胰島制備方法的改善，并且顯著增加了胰島制備的效率。
[0037]在實施方式中，本方法還包括使包含胰島的細胞產(chǎn)物和/或可包含pancreatite的胰島與抗氧化劑接觸，所述抗氧化劑，例如Trolox(a-生育酚的類似物；范圍是約30-約80 μ Μ,如約50 μ Μ)、Q-VD-OPH (廣譜半胱天冬酶抑制劑;范圍是約5-約20 μ Μ,例如約10 μ Μ)、肝細胞生長因子、卡波西成纖維細胞生長因子、煙酰胺或其組合。
[0038]在實施方式中,提供了制備pancreatite的試劑盒。在一個實施方式中,所述試劑盒包含例如消化酶，有膜的培養(yǎng)瓶(如上面所討論)和培養(yǎng)基。在另一個實施方式中，所述試劑盒也可包括例如在分離包含胰島的細胞產(chǎn)物前保存供體組織的膜和灌注溶液。[0039]在實施方式中，提供了制備可包含pancreatite的胰島的方法。在實施方式中，所述方法包含在膜上培養(yǎng)含有胰島的細胞產(chǎn)物以制備和/或獲得可包含pancreatite的胰島。在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物還包含外分泌物質(zhì)。在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物不包含任何外分泌物質(zhì)。在實施方式中，將外分泌物質(zhì)分別加入到培養(yǎng)基中(即與包含胰島的細胞產(chǎn)物分開)。例如，在實施方式中，外分泌物質(zhì)可以在包含胰島的細胞產(chǎn)物(可包括或不包括任何外分泌物質(zhì))加入到培養(yǎng)基之前或之后加入培養(yǎng)基。
[0040]在實施方式中，提供了胰島移植的方法。例如，在實施方式中，所述胰島移植的方法包含在膜上培養(yǎng)含有胰島的細胞產(chǎn)物以獲得可包含pancreatite的胰島，和向受體例如哺乳動物給予可包含pancreatite的胰島。在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物還包含外分泌物質(zhì)。在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物不包含任何外分泌物質(zhì)，并且分開加入外分泌物質(zhì)。例如，在實施方式中，外分泌物質(zhì)可以在包含胰島的細胞產(chǎn)物(可包括或不包括任何外分泌物質(zhì))加入到培養(yǎng)基之前或之后加入培養(yǎng)基。在實施方式中，可以給予糖尿病受體，例如糖尿病哺乳動物。在實施方式中，所述膜是可透氣的硅膠膜。在實施方式中，所述膜是可透氣或不透氣的平坦膜。在實施方式中，所述膜是透氣膜。在其他實施方式中，培養(yǎng)基在聚碳酸酯透氣娃膠膜培養(yǎng)瓶中存在。
[0041]在實施方式中，給予可包含pancreatite的胰島能通過哺乳動物腎小囊下、皮下、靜脈內(nèi)、經(jīng)肝門靜脈、或進入胰腺間充質(zhì)移植。在實施方式中，將所述可包含pancreatite的胰島給予受體，所述受體是哺乳動物例如人。在其他實施方式中，所給予可包含pancreatite的胰島是自體或異源的。
[0042]本公開形成胰島的方法可包括分離含胰島的細胞產(chǎn)物的方法，可適應胰島細胞的培養(yǎng)基，和培養(yǎng)含胰島的細胞產(chǎn)物以制備可包含pancr eat i te胰島的方法，并且引起從給定數(shù)量供體組織分離的含胰島細胞產(chǎn)物數(shù)量增加以及胰島的功能和活力提高。所述可包含pancreatite的胰島和本公開方法可以增強胰島的移植能力,和增加移植成功性。
[0043]分離包含胰島的細胞產(chǎn)物前，切除供體胰腺(或胰腺供體組織)意味著供體胰腺(胰腺供體組織)的缺血是總 體的和不可避免的，盡管所述時間段可以短暫。供體胰腺(或胰腺組織)停止血液供應的直接結果是剝奪了供體組織的氧供應，但是缺氧(總體)或低氧(局部)僅是很多缺乏血液供應的后果之一。缺血開始后繼發(fā)多因素級聯(lián)事件。關鍵的事件是在缺氧的前幾分鐘內(nèi)發(fā)生的ATP耗盡。這個早期事件立即造成有氧代謝向厭氧代謝的轉(zhuǎn)化，其快速變成自我限制，生成乳酸鹽和質(zhì)子。級聯(lián)中也極早發(fā)生細胞去極化，造成破壞離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、最終在凋亡或壞死引起的細胞死亡中積累的其他細胞內(nèi)和膜相關事件的關聯(lián)。在分離含胰島細胞產(chǎn)物的方法開始前，防止這種破壞性通路增加了從給定胰腺或其部分收集的含胰島細胞產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量。
[0044]就臨床應用而言細胞保存的基本原理是使保存間隔中缺血和缺氧的有害影響最小化。藥理學上這能通過使用廣泛的細胞保護藥物和/或通過降低溫度來實現(xiàn)。有趣的是，傳統(tǒng)智慧教給我們沒有單個藥物或藥物混合物能如低溫應用那樣安全和有效地抑制代謝和提供對多個組織和器官的缺血保護。因此，焦點變成控制細胞環(huán)境以優(yōu)化低溫保存。
[0045]在實施方式中，本文所公開的方法實施某種方法，所述方法利用灌注技術的進展，并且可選與那些低溫血液替代溶液的進展組合以通過PFC擴大方法來提高O2遞送。這個方法避免了現(xiàn)有臨床胰腺存儲模式中數(shù)個公認缺點，其中最顯著的是使用傳統(tǒng)二層法(TLM)顯示PFC和氧的低滲透。
[0046]在胰腺保存然后分離包含胰島的細胞產(chǎn)物的特定示例中，出現(xiàn)年輕豬模型中低溫機器灌注(HMP)對胰島產(chǎn)率的有益效果。然而，由于胰島對甚至短時期(<10h)冷缺血的易損性，本文所述方法通過避免傳統(tǒng)胰腺保存技術中認可的限制來延長對缺血的耐受，并且使包含胰島的細胞產(chǎn)物產(chǎn)率增加，并且因此使可包含pancreatite的胰島的質(zhì)量和數(shù)量增加。
[0047]在實施方式中，可以在保存胰島完整性同時通過應用HMP和發(fā)展間質(zhì)性水腫來分離包含胰島的細胞產(chǎn)物，所述胰島待培養(yǎng)形成可包含pancreatite的胰島,相較應用于非灌注供體組織(即新鮮或靜態(tài)冷凍保存的供體組織)的傳統(tǒng)方法，這可以大幅增加包含胰島的經(jīng)回收細胞產(chǎn)物的量和質(zhì)量。在實施方式中，可以利用酶消化從而進一步幫助分離包含胰島的細胞產(chǎn)物。
[0048]實施方式中，用作起始材料的包含胰島的細胞產(chǎn)物可以通過從哺乳動物含胰島體的胰腺(如來自胎兒、新生或成年胰腺)獲得功能胰島的公知方法獲得。這種方法可以包含粉碎全部胰腺或其 部分，并且通過使其暴露于酶溶液足夠的時間以使胰島從周圍胰腺組織中釋放，從而消化所述粉碎段，所述酶裂解結締組織，如膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶和其混合物。在實施方式中，所述粉碎段僅進行非常溫和的消化，例如從而組織裂解程度大約對應于用膠原酶溶液在約37° C消化約12-15分鐘獲得的那些，所述膠原酶溶液包含約750膠原酶單位/ml。例如，所述粉碎的胰腺部分可以用酶處理，通過例如把酶溶液灌注到供體組織中，和/或當接觸酶溶液時振蕩供體組織的方法。在實施方式中，所述供體組織可與酶溶液以任何需要的時間接觸，例如僅僅是釋放大量胰島所需的最短時間。在實施方式中，可使用酶的稀釋溶液，例如組織裂解潛能不多于包含約1，500單位膠原酶/ml的參照溶液，例如約1000單位/ml或約750單位/ml。在實施方式中，本公開方法可以使用更溫和的結締組織裂解酶例如膠原酶和/或透明質(zhì)酸酶，而不是更加劇烈作用的酶例如已知解離細胞的胰蛋白酶。在實施方式中，可以使用所述羅氏公司(Roche)MTF酶。
[0049]在實施方式中，可通過包含在灌注供體胰腺和/或其(供體組織)部分或片段或期間發(fā)展水腫的方法分離含胰島的細胞產(chǎn)物，所述胰島待培養(yǎng)形成可含有pancreatite胰島。在這種實施方式中，灌注供體組織期間發(fā)展水腫可以通過增加灌注溶液通過所述組織的第一流速以實現(xiàn)第二流速，增加由灌注設備向所述組織應用的第一灌注壓力以實現(xiàn)第二灌注壓力，和/或選擇造成組織水腫的灌注溶液組合物來完成。
[0050]在實施方式中，發(fā)展水腫可以通過增加灌注溶液通過供體組織的第一流速以實現(xiàn)第二流速，增加由灌注設備向供體組織應用的第一灌注壓力以實現(xiàn)第二灌注壓力，和/或選擇造成供體組織水腫的灌注溶液組合物來完成，其中水腫的程度可以通過監(jiān)測供體組織的浮力，監(jiān)測供體組織的表面積，監(jiān)測供體組織的周長，監(jiān)測供體組織的重量和/或質(zhì)量，和/或監(jiān)測供體組織的容積來評價。
[0051]實施方式中，包含待培養(yǎng)形成可含有pancreatite的胰島的含胰島細胞產(chǎn)物可以通過某些方法分離，所述方法包含提供具有不易破壞性冷凍的所需細胞和更易破壞性冷凍的不需要細胞的組織，冷凍所述組織，破壞所述組織，加熱所述組織，和分離所需含胰島的細胞產(chǎn)物與不需要的細胞材料以獲得包含胰島的細胞產(chǎn)物。
[0052]在實施方式中，包含待培養(yǎng)形成可含有pancreatite的胰島的含胰島細胞產(chǎn)物可以通過某些方法分離，所述方法包含手術制備用于血管和導管插管(cannulation)的離體組織，冷卻所述組織，用低溫保護劑平衡組織，可選冷凍所述組織到約-10° C-約-200° C的溫度，可選在保持組織冷凍下機械破壞所述組織，可選解凍所述組織，過濾所述組織，洗滌所述組織，純化包含胰島的細胞產(chǎn)物，例如通過梯度純化。
[0053]在實施方式中，包含待培養(yǎng)形成可含有pancreatite胰島的胰島的細胞產(chǎn)物可以通過某些方法分離，所述方法包含通過血管系統(tǒng)用含低溫保護劑(CPA)的低溫保護溶液注入胰島組織，通過導管系統(tǒng)用水溶液注入腺泡組織，冷凍所述胰腺，破壞所述胰腺，加熱所述胰腺和分離所述胰島。在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物可保持足夠的功能完整性以用作移植來源。
[0054]低溫機器灌注(HMP):傳統(tǒng)的移植器官保存方法主要依賴于冰上靜態(tài)冷凍儲存，這是使用了幾十年的相對簡單和經(jīng)濟的技術。然而，在胰腺保存領域，特別是應用于作為分離含胰島細胞產(chǎn)物的來源器官時，靜態(tài)冷凍存儲對獲自單個供體胰腺的島產(chǎn)率和質(zhì)量有嚴重的限制。例如，引入據(jù)稱增加缺血器官氧供應的全氟化合物層在靜態(tài)冷凍保存方法中沒能提供額外的保護。
[0055]在實施方式中，包含待培養(yǎng)形成可含有pancreatite胰島的胰島的細胞產(chǎn)物可以從供體組織中分離，所述供體組織通過使用HMP和低體溫血液替代(HBS)技術組合以及PFC氧化的方法來保存。
[0056]低溫血液替代物作為保存介質(zhì):傳統(tǒng)上，開發(fā)了各種器官保存溶液。
[0057]Brasile 的美國專利號 5，643，712,5, 699，793,5, 843，024 和 Brasile 等的美國專利號5，599，659,5, 702，881描述了組織和器官的單獨復蘇和保存溶液，所述專利通過引用全文納入本文。所述Brasile專利描述了可用于本公開方法的組合物。
[0058]Taylor 等制備并評價了稱為 Hypothermosol?-吹掃(HTS-P)和Hypothermosol?-維持(HTS-M)的兩種溶液。這些溶液的一些方面描述于Taylor的美國專利號5，405, 742和5，514 ，536，兩者的公開內(nèi)容通過引用全文納入本文。所述Taylor的專利描述了可用于本公開方法的組合物。
[0059]溶液例如Unisol?家族溶液的保護特性(描述于Taylor的美國專利號6，492，103和 6，994，954,標題為〃System for organ and tissue preservation and hypothermicblood substitution (用于器官和組織保存以及低溫血液替代的系統(tǒng))〃，其公開內(nèi)容通過引用全文納入本文)可以用于本公開的方法。在實施方式中，除了細胞保護添加劑，Unisol可以用作乳化PFC的載劑溶液以顯著增加氧輸送能力。
[0060]在實施方式中，主要溶液可以是設計成在最低溫度(〈10° C)低溫暴露中“維持”細胞完整性的高血鉀、“胞內(nèi)型”溶液。
[0061]增加低體溫保存中對組織的氧輸送和PFC作用:開發(fā)出所述Unisol? “維持”溶液，并且在溫度范圍7-10° C測試，所述溫度范圍確證了如果通過連續(xù)灌注維持充分O2供應，能重新建立ATP逆轉(zhuǎn)。例如，很多研究提示氧供應在肝低溫保存中很重要。
[0062]在0-2° C冷凍保存器官(如傳統(tǒng)靜態(tài)冷冰保存)期間腺嘌呤核苷酸的快速耗盡可以提示低溫嚴重損傷了線粒體功能。灌注中可能需要維持所述O2水平以確保包含胰島的細胞產(chǎn)物的最高數(shù)量和質(zhì)量，并且使用PFC以允許其實現(xiàn)。
[0063]PFC是所有或大部分氫原子用氟取代(即全氟碳)的烴。其有兩倍的水密度，和用于溶解呼吸道氣體的高容量。PFC中溶解氧的可溶性比血液或水高約25倍。根據(jù)亨利定律，PFC釋放氧的能力不受溫度顯著影響，使其理想用于低溫器官保存期間的氧輸送。近期的證明也支持這個觀點:在用于系統(tǒng)氧化的腹膜灌注應用中需要全氟碳的氣體溶解和氣體卸載特性，因為當用單獨鹽水溶液作為灌注液時，不能獲得相同的效果。然而，低溫條件下使用全氟碳受到限制。
[0064]應用一種或多種這些胰腺或供體組織保存策略使供體組織或器官的損傷和細胞死亡最小化，其可以促進包含胰島的細胞產(chǎn)物整體產(chǎn)率增加，并且因此提高可包含pancreatite的胰島整體產(chǎn)率增加。
[0065]如上面所討論，胰島的獲取和保存對分離包含胰島的細胞產(chǎn)物重要，作為在膜上培養(yǎng)含胰島細胞產(chǎn)物的前期工作以獲得可包含pancreatite的胰島，并且所述可包含pancreatite的胰島的最終移植作為治療I型糖尿病的選擇。胰腺灌注還能用于在分離含胰島細胞產(chǎn)物前保存暴露于熱缺血的器官，并且就更佳產(chǎn)率和質(zhì)量優(yōu)化胰腺保存溶液。
[0066]生理上，胰腺是低流動器官。實施方式中，在分離包含胰島的細胞產(chǎn)物期間和/或之前，本公開的所述方法可包含胰腺灌注，所述灌注可基于低恒壓(約IOmmHg或更小，例如約ImmHg -約IOmmHg)驅(qū)動的流動。LifePort?的現(xiàn)有設計可能不適合于小于IOmmHg的輸注壓力。因此，可以用更低壓力值以達到本文保存胰島的公開方法所需的小于IOmmHg的輸注壓力，以分離包含胰島的細胞產(chǎn)物。在實施方式中，可以根據(jù)包含胰島特性和質(zhì)量(如熱缺血暴露、大小、種類等)的所需細胞產(chǎn)物來選擇驅(qū)動流速值。
[0067]在實施方式中，所述灌注方法可以基于高(約IOmmHg或等高,例如約IOmmHg-約60mmHg)恒壓驅(qū)動的流動。
[0068]在實施方式中，本文所述方法使用灌注一種或多種胰腺器官或組織(此后通稱為供體組織)的設備。示例性設備描述于美國專利申請?zhí)?2/379，239，其是2005年3月10日提交的美國專利申請?zhí)?1/075，690(2009年3月17日授權的美國專利號7，504，201)的分案，其全部公開通過引用全`文納入本文。在實施方式中，本文所述方法使用LifePon?
平臺運輸器或改良的LifePort?平臺運輸器以完成供體組織(即胰腺)的低體溫機器灌注(HMP) ο
[0069]在實施方式中，HMP可以在供體組織內(nèi)產(chǎn)生均一的流體積聚，進而提供對包含胰島的細胞產(chǎn)物產(chǎn)生有利影響的受破壞胞外空間，而不損害胰島活力和胰島功能。在實施方式中，當使用酶消化時，這種破壞可以更有效完成所述酶消化，并且因此降低了對分離包含胰島的細胞產(chǎn)物必要的所需時間。本文所述關于年輕豬胰島的方法可容易應用于人和其他供體胰腺。在實施方式中，可實現(xiàn)胰腺低溫灌注優(yōu)化以發(fā)展灌注期間器官評價和質(zhì)量控制的方法發(fā)展，從而可靠選擇分離包含胰島的細胞產(chǎn)物的胰腺。
[0070]在實施方式中，用于胰腺灌注的LifePon?機器可適應在小于150ml/min的流速操作，例如小于 100ml/min,或約 10ml/min-約 100ml/min,例如約 15ml/min -約 50ml/min，或約 20ml/min -約 30ml/min。
[0071]在實施方式中，用于胰腺灌注的LifePort?機器可適應在高壓設定操作(約IOmmHg或更高，例如范圍約IOmmHg-約60mmHg，或范圍約20mmHg-約50mmHg)-控制的豬胰腺的灌注作為分離含胰島細胞產(chǎn)物過程的前期工作。在實施方式中，用于胰腺灌注的LifePort?機器可以適應在小于200ml/min的流速操作，例如小于150ml/min,或約IOml/min_ 約 150ml/min,例如約 50ml/min -約 120ml/min,或約 60ml/min -約 110ml/min。
[0072]本公開的實施方式可以提供分離包含胰島的細胞產(chǎn)物的改善方法(可選與酶消化組合)，這比傳統(tǒng)基于酶消化的方法更一致和更可靠。實施方式也提供產(chǎn)生最優(yōu)量的所需包含胰島細胞產(chǎn)物的方法。在實施方式中，供體組織中水腫發(fā)展形成的溶脹組織可以通過應用低溫機器灌注(HMP)完成。作為分離包含胰島的細胞產(chǎn)物的前期工作，應用供體組織HMP (所述胰腺HMP)，也利用了其他多種器官(主要是腎)顯示的一些HMP優(yōu)勢，作為延長保存期中更好保存的方法，特別對于次最優(yōu)的器官。
[0073]延長器官的機器灌注中累進發(fā)生水腫，通常認為這是不需要的現(xiàn)象。與期望相反，水腫發(fā)展例如至約280%(即在監(jiān)測評價水腫的程度例如重量、質(zhì)量、周長、浮力和/或容積的特定參數(shù)中增加180%)或多至約250%、多至約150%沒有證明對收獲包含胰島的細胞產(chǎn)物有害，但是觀察到了酶消化中與更有效破壞胰腺有關的顯著優(yōu)勢，產(chǎn)生顯著更多數(shù)目的含胰島細胞產(chǎn)物。
[0074]在實施方式中，供體組織灌注中水腫發(fā)展形成溶脹組織可以造成溶脹組織顯示約110%的起始或最初非灌注供體組織重量、質(zhì)量、周長、表面積、浮力和/或容積(即在重量、質(zhì)量、周長、表面積、浮力和/或容積上增加約10%)，例如約120%-約280%(即在重量、質(zhì)量、周長、表面積、浮力和/或容積上增加約20%-約180%)，或約130%-約250%(即在重量、質(zhì)量、周長、表面積、浮力和/或容積上增加約30%-約150%)。
[0075]認為存在預定量的水腫造成對胰腺或胰腺組織的胞外基質(zhì)和結構的足夠破壞，腺體的后續(xù)膨脹和消化更有效推進。這由顯著更短的消化時間、更均勻的消化產(chǎn)物證明。包含胰島的細胞產(chǎn)物的結構和功能本身看來沒有受這些研究中遇到的組織水腫水平影響。HMP引起的包含胰島的經(jīng)分離細胞產(chǎn)物水合變化可改變所述胰島的浮力密度，并且因此改變其在密度梯度上與任何不需要的外分泌組織分離的能力，這個關注沒有成為問題。這可能是由于胰島中的任何固有水腫與高滲介質(zhì)UW溶液的預梯度孵育互相對抗，所述UW溶液會在30-min冷孵育中使胰島脫水，然后加載到通常用于胰島分離操作方案的濃度梯度純化(Lakey, J.R.T., Tech nical aspects of islet preparation and transplantation (《膜島制備和移植的技術方面》)，Transpl.1nt., 16:613 - 632, 2003;Lakey, J.R.T.;Currenthuman islet isolation protocol(《新編人膜島分離實驗指南》)，Chuo-ku, 0saka:MedicalReview醫(yī)學綜述有限公司(Medical Review C0.Ltd.), 2004;其公開內(nèi)容通過引用全文納入本文)。
[0076]上述HMP未預期的優(yōu)勢可以在不損害收獲的含胰島細胞產(chǎn)物質(zhì)量情況下實現(xiàn)?？梢允褂脙煞N專有溶液KPSl和Unisol-UHK中任一種來實現(xiàn)這些保存的影響和標準。
[0077]這個技術的其他提高和優(yōu)勢可以通過下面方法完成:加入設計用于盡可能減少保存和灌注損傷的細胞保護劑，和/或PFC來優(yōu)化這些基線灌注液組合物。
[0078]例如，細胞保護添加劑可以是低溫保存期間顯示效果的添加劑，并且因此其有很大可能對低溫機器灌注中胰腺保存的質(zhì)量產(chǎn)生正面影響，例如抗氧化劑、抗凋亡劑和營養(yǎng)因子。
[0079]在實施方式中，所述供體組織可以分成更小的斷裂和/或片段化的部分。為了增強供體組織例如胰腺的破碎，體積升溫(volumetric warming)可以與浸在熱水浴中加入壓縮空氣熱交換器組合。實施方式中，這能解凍供體細胞，而不需要從平臺上移出其。在暴露于消化酶之前的任何時間(例如在加溫供體組織中)都可以發(fā)生供體組織的分裂或斷裂。
[0080]在實施方式中，使所述供體組織暴露于各種劑量的消化酶(例如上面提到的那些和市售可得的那些)是有利的，以幫助結締組織分散從而使包含胰島的細胞產(chǎn)物(可選是冷凍保護的胰島)從破壞的組織中釋放出來。
[0081]在實施方式中，水腫程度達到預定水平后，例如水腫水平在體重、質(zhì)量、周長、表面積、浮力和/或體積上增加多達約200%(即如果組織的起始或最初體重、質(zhì)量、周長、表面積、浮力和/或體積是X (例如100克)，增加約200%可以產(chǎn)生3X(300克)的終體重，例如增加多至約150%、或增加多至約100%，可以破壞所述供體組織以釋放來自分解供體組織的細胞產(chǎn)物。在實施方式中，當所述供體組織冷凍時、當所述供體組織加熱時、和/或在所述組織達到室溫后，可發(fā)生所述供體組織的破壞。在實施方式中，這種破壞能通過以下實現(xiàn):機械壓力、差異膨脹引起的熱-機械壓力、大溫度梯度引起的熱-機械壓力、和冷凍后體積改變引起的熱-機械壓力、通過消化酶、或其組合。
[0082]熱-機械壓力可以是材料冷凍后接觸趨勢(tendency)的結果,其由三個不同影響驅(qū)動:如上述冷凍后的體積改變、大溫度梯度、和復合材料的差異膨脹。實踐中，兩個或多個上述影響可以協(xié)同作用。在其他實施方式中，破壞供體組織可以通過機械破裂冷凍的供體組織來實現(xiàn)。例如，這可以通過兩個階段完成。第一階段可以是將冷凍的供體組織物理分裂成部分，例如用錘子和鑿子。第二階段可以是將冷凍的組織部分浸沒在熱水或等滲介質(zhì)中研磨，例如通過使用電子碎冰機或攪拌機。這也可以在機械研磨所述組織的同時，影響冰凍保護劑(如果包含)的快速加熱和稀釋。
[0083]在實施方式中，所述方法還包含從所述不需要的供體組織材料中分離包含胰島的細胞產(chǎn)物。在實施方式中，存在的所述胰島含量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約20%，例如含量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約40%、或含量大于約60%、或含量大于約80%,其中所述胰島含量通過胰島包圍的面積與培養(yǎng)基中所存在外分泌組織和 內(nèi)分泌組織總面積之比來計算。在實施方式中，存在的所述胰島含量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約70%，例如含量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約60%或50%，其中所述胰島含量通過胰島包圍的面積與培養(yǎng)基中所存在外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積之比來計算。在實施方式中，存在的所述外分泌物質(zhì)含量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約60%，例如含量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約70%、或含量大于約80%、或含量大于約90%，其中所述外分泌物質(zhì)的量通過外分泌物質(zhì)包圍的面積與培養(yǎng)基中所存在外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積之比來計算。
[0084]在其他實施方式中，所述含胰島的細胞產(chǎn)物可以包含任何所需量的外分泌物質(zhì)，例如小于10%的量，例如約0.5%-約10%，例如約1%-約8%或約2%-約5%。在其他實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物與外分泌物質(zhì)分離，并且因此不包含任何外分泌物質(zhì)?？梢酝ㄟ^例如過濾、密度梯度分離、組織培養(yǎng)或其組合實現(xiàn)含胰島細胞產(chǎn)物的分離?？梢允褂眠^濾設備例如不銹鋼絲網(wǎng)(濾茶網(wǎng))進行過濾。分離可包括用培養(yǎng)基洗滌過濾的供體細胞，所述培養(yǎng)基包含蛋白酶抑制劑例如PEFABLOC?和脫氧核糖核酸酶例如PULMOZYME?，從而從裂解的外分泌組織去除有害的內(nèi)源性蛋白酶和DNA。在實施方式中，所述過濾的供體組織用指示劑染色以鑒定所述細胞產(chǎn)物，例如用于胰島的雙硫腙染色，并且顯微鏡檢查是否存在包含胰島的完整細胞產(chǎn)物。
[0085]包含胰島的經(jīng)分離細胞產(chǎn)物可以不從供體組織干凈地切除，并且不是所有的含胰島細胞產(chǎn)物都可以充分完整。例如，對胰島而言，一些胰島組織可以有能反映滲透休克的彌漫性或松散結構，所述滲透休克是由于在任何冷凍胰腺加熱中直接浸沒于水性培養(yǎng)基而引起。在實施方式中，可通過解凍冷凍胰腺期間或之后，在從胰島組織洗脫CPA中使用滲透緩沖液來避免這個問題。使用滲透緩沖技術的實施方式可以在滲透CPA的流出中保護胰島組織結構和盡可能減少滲透溶脹和裂解。相反，在這種實施方式中，滲透緩沖沒有同時影響腺泡細胞的破壞和裂解，因為這些細胞沒有CPA滲透的保護。
[0086]在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物可以根據(jù)Ricordi等的方法(An automatedmethod for the isolation of human pancreatic islets (〈〈分離人膜島的自動方法》)，Diabetes, 1988;37:413)或本領域技術人員熟悉的其他方法分離。在實施方式中，所述包含胰島的細胞產(chǎn)物加入到本文公開的或本領域技術人員熟悉的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)合適的時間段以維持或增強功能和活力，并且通過本領域已知的任何合適方法引入受體，例如通過門靜脈輸注到肝。
[0087]在實施方式中，包含胰島的細胞產(chǎn)物可以培養(yǎng)約3小時-約4周或更長的時間，例如約24小時-約14天，例如約4天-約10天。然而，包含胰島的細胞產(chǎn)物可以使用本組合物和方法培養(yǎng)60天或者甚至更長。
[0088]在實施方式中，所述培養(yǎng)基可以是能維持哺乳動物細胞生長的任何液體組合物。大量的合適液體培養(yǎng)基市售可得。任何給定液體培養(yǎng)基的促進細胞生長品質(zhì)可以當然通過實施試驗培養(yǎng)(例如用分離的胰島)的試驗和實驗容易測定，并且測定細胞是否發(fā)生聚集、增殖、繁殖和/或生長。
[0089]在實施方式中，所述培養(yǎng)基包含適合培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基，例如以CELLGRO?商標出售的或獲自密迪亞泰克公司(Mediatech)的那些；包含例如CMRL1066，其中加入了有效量的煙酰胺、維生素E和HSA。其他等同的基本培養(yǎng)基可以替代CMRL使用，包括但不限于基礎伊格爾培養(yǎng)基(BME)、DMEM; DMEM/F12、培養(yǎng)基199;F-12 (Ham)營養(yǎng)混合物;F-10 (Ham)營養(yǎng)混合物;極限必需培養(yǎng)基(MEM)、Williams培養(yǎng)基E; RPMI1640、CO2獨立培養(yǎng)基和其混合物。(這些制劑可獲自馬里蘭州蓋瑟斯堡的Gibco-BRL/生命技術公司和其他商業(yè)來源)。本領域技術人員應了解很多其他合適的基礎培養(yǎng)基市售可得，并且能在實驗室中常規(guī)制備。通常，這種基礎培養(yǎng)基包含無機鹽(如NaCl, KC1、NaH2PO4, CaCl2, MgSO4、乙酸鈉)、天然產(chǎn)生的氨基酸、維生素、緩沖液和支持細胞存活所需的其他可能有利成分(膽固醇、輔酶A、葡萄糖谷胱甘肽、胸苷、尿苷-5三磷酸、抗生素)。
[0090]在實施方式中，所述培養(yǎng)基還可以包含其他成分，例如ITS液體培養(yǎng)基、ITS+Premix、鹽酸環(huán)丙沙星、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒、水溶性亞油酸、丙酮酸鈉、硫酸鋅或氯化鋅、Hepes, N-乙酰半胱氨酸、煙酰胺、熱滅活的豬血清、L-谷胺酰胺、肝素鈉、Trolox,Q-VD-0PH、百慕時和 GlutaMax-1。
[0091]培養(yǎng)基的示例性制品可以包含:補充ME199的基礎培養(yǎng)基(IOOOml)[賽爾格羅公司99-601-CM]，其可以通過額外加入50ml丙酮酸鈉(IOOml儲液)、加入Iml硫酸鋅(4.8mg/ml儲液)、加入IOml ITS液體培養(yǎng)基、加入2ml鹽酸環(huán)丙沙星(10mg/ml儲液)、加入60mgN-乙酰半胱氨酸、加入1.22g煙酰胺(最終IOmM)制備。對這種培養(yǎng)基而言，下列步驟可以在臨近使用時進行:加入IOOml熱滅活的豬血清、加入25ml L-谷胺酰胺(200mM儲液)、力口入IOml肝素鈉(1000U/ml儲液)、加入14ml百慕時(2500U/2.5ml安瓿)、加入Trolox* (終濃度50 μ Μ)、和加入Q-VD-0PH* (終濃度10 μ Μ)。
[0092]在實施方式中，少量葡萄糖可以對應于體內(nèi)胰腺的濃度加入到培養(yǎng)基中，例如葡萄糖的摩爾濃度為約5-約20mM，例如約10mM，并且所述培養(yǎng)基可以在使用前用包含5%C02的空氣平衡以實現(xiàn)與體內(nèi)條件對應的溶解氣體分壓。在實施方式中，所述培養(yǎng)基包含有效濃度的抗生素例如約50-約200 μ U/ml (如約100 μ U/ml青霉素)和約50-約200 μ g/ml(如約100 μ g/ml鏈霉素)以抑制不需要的微生物生長。在實施方式中，所述培養(yǎng)基也可以加入了少量哺乳動物血清，所述血清包含促進細胞組織與細胞底物的結合的蛋白。例如，所述血清可以約5-20%體積(基于混合物體積)的量存在，例如約15%體積，并且對培養(yǎng)的含胰島細胞產(chǎn)物而言是異源的。
[0093]在實施方式中，所述培養(yǎng)基可以在大約接近體內(nèi)條件的條件下維持，所述條件認為可適于哺乳動物細胞的生長，如在約35° -40° C范圍的大致正常哺乳動物體溫，例如約37° C，并且在合適的氣體組合物氣氛下，例如適合維持溶液中氣體分壓的約5%C02/95%空氣。在實施方式中，所述培養(yǎng)維持在水飽和空氣中以避免培養(yǎng)基中通過蒸發(fā)損失引起的不需要濃度改變。
[0094]氣相的重要組成可包括氧氣和二氧化碳。通常,大氣氧張力對細胞培養(yǎng)有用。培養(yǎng)容器通常排氣到培養(yǎng)箱空氣中，以通過使用透氣蓋或防止培養(yǎng)容器密封來使氣體交換。二氧化碳與細胞培養(yǎng)基中的緩沖液一起在PH穩(wěn)定中起作用，并且通常培養(yǎng)箱中存在的濃度是1_10%。在實施方式中，所述CO2濃度可以是約5%。
[0095]在實施方式中，培養(yǎng)基中初始接種包含胰島的細胞產(chǎn)物后，可以頻繁間隔改變所述培養(yǎng)基以在所述培養(yǎng)基中維持有效的營養(yǎng)和抗生素，并且洗掉任何污染物。例如，對培養(yǎng)基的頭3或4天而言，可以約12 - 24小時的間隔改變培養(yǎng)基。對培養(yǎng)持續(xù)時間長于3或4天的階段而言，可以更長間隔 改變培養(yǎng)基，例如約5 -約10天。
[0096]在實施方式中，可引入培養(yǎng)基的胰島密度可以變化。在實施方式中，胰島的密度可以是約10 -約200胰島/ml培養(yǎng)基，例如約25-100胰島/ml培養(yǎng)基，或者30-50胰島/ml培養(yǎng)基。在實施方式中，培養(yǎng)細胞產(chǎn)物培養(yǎng)物可以維持至少約3天時間段，例如至少約一周或更長。
[0097]在實施方式中，懸浮中的塑料皿、燒瓶、滾瓶或微載體可用于根據(jù)本公開方法培養(yǎng)包含胰島的細胞產(chǎn)物。合適的培養(yǎng)容器可以包含例如多孔板、皮氏培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)管、燒瓶、滾瓶等。
[0098]可以對培養(yǎng)系統(tǒng)進行各種修改以降低p02氣和p02室的差異。例如,可以使用在機械混合或灌注容器中的對流氧氣運輸，包括攪拌和/或鼓泡氧氣通過培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可以使用水的電化學水解原位產(chǎn)生氧氣?；蛘呋蛄硗?，還可使用包含透氧膜的培養(yǎng)容器，所述容器有一個或多個細胞能與其接觸并生長的邊、壁和/或底。本文使用的透氧膜是氧氣透過性大于標準培養(yǎng)皿(如聚苯乙烯)的膜。透氧膜的一個示例是氟代乙烯-丙烯共聚物(FEP-特氟龍(Teflon))膜。包含這種膜的培養(yǎng)容器作為Lumox皿(慕尼黑的葛萊娜第一生化公司(Greiner Bio-One))市售可得。透氧膜的另一個示例是實施例中使用的娃橡膠膜。
[0099]在實施方式中,可以使用包含娃橡膠膜的娃橡膠培養(yǎng)容器或器皿。例如，與含胰島細胞產(chǎn)物接觸的所述管的內(nèi)表面由硅橡膠制成。硅橡膠的優(yōu)勢是其對氣體如氧氣有高滲透性?？捎玫呐囵B(yǎng)器皿示例可以從例如明尼蘇達州威爾森沃爾夫制造公司市售可得。其他示例可以包含美國專利申請?zhí)?0080227176所述的那些，所述專利通過引用全文納入本文。在其他實施方式中，這種透氧膜插入可以置入任何上述容器或培養(yǎng)器皿中。硅橡膠膜插入從明尼蘇達州威爾森沃爾夫制造公司市售可得。
[0100]在實施方式中，本培養(yǎng)方法過程中由本公開方法制備的可包含pancreatite的胰島能連接到或者變得連接其培養(yǎng)接觸的底物。在實施方式中，所述培養(yǎng)方法可以在提供或包含合適底物的器皿中進行，所述底物與哺乳動物細胞組織相容，并且能接受可包含pancreatite的胰島與其連接。因此合適的器皿包含市售可得的組織培養(yǎng)皿，其底部平面用涂層覆蓋，所述涂層促進連接包含胰島的細胞產(chǎn)物。當然也可以使用提供或包含合適底物表面的其他培養(yǎng)器皿。在實施方式中，本公開方法進行靜止培養(yǎng)，即所述培養(yǎng)或培養(yǎng)基停留在靜息狀態(tài)，除了定期的可選培養(yǎng)基改變(可以是液體)。然而，其同樣可能實施使用其他培養(yǎng)形式的方法，其中正在培養(yǎng)的含胰島細胞產(chǎn)物結合浸入培養(yǎng)基的底物，所述培養(yǎng)基可以是液體培養(yǎng)基。
[0101 ] 在實施方式中，本公開提供了移植可包含pancreatite胰島的方法，所述方法包含從供體組織分離包含胰島的細胞產(chǎn)物，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含胰島的細胞產(chǎn)物以制備可包含pancreatite的胰島,和將所述可包含pancreatite的胰島引入受體或宿主。在實施方式中，所述受體或宿主是需要移植胰島素生產(chǎn)細胞的患者，例如I型糖尿病患者。因此，本公開也提供治療糖尿病例如I型糖尿病的方法，包含步驟:從供體組織分離包含胰島的細胞產(chǎn)物，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含胰島的細胞產(chǎn)物以制備可包含pancreatite的胰島，和將所述可包含pancreatite的胰島移植到宿主、受體或患者。
`[0102]所述可包含pancreatite的胰島能用于篩選或評價促胰島素化合物?？赏ㄟ^將促胰島素化合物給予和/或加入本公開方法制備的可包含pancreatite的胰島，來評價這種化合物在葡萄糖存在以及GLP-1存在和缺失情況下加強胰島素分泌的能力。另外，通過本公開方法制備的可包含pancreatite的胰島也能用于測量胰島素含量、檢測胰島素合成，測試化合物對例如cAMP的影響(如直接SPA篩選Biotrak試驗試劑盒,新澤西州皮斯卡特維的阿莫山公司(Amersham))，以及測量胰島細胞中的代謝物(如光譜或熒光酶分析，或本領域技術人員已知的任何其他方法)。本公開方法制備的所述可包含pancreatite的胰島也能用于測量胰高血糖素釋放。高血糖素癥是2型糖尿病的常見現(xiàn)象。胰高血糖素的主要生理影響是增加肝葡萄糖的生成。2型糖尿病患者中循環(huán)胰高血糖素水平增加對加快高血糖有顯著影響。因此，抑制胰高血糖素的釋放或降低胰高血糖素對靶標組織的影響是治療糖尿病的另一個方法。本公開方法制備的所述可包含pancreatite的胰島能提供測量胰高血糖素釋放和多種化合物調(diào)節(jié)的強有力方法。
[0103]本公開方法制備的可包含pancreatite的胰島能用于多種應用。這些包括但不限于體內(nèi)移植或植入包含pancreatite的胰島；體外篩選細胞毒性化合物、變應原、生長/調(diào)節(jié)因子、藥物化合物等；闡明某些疾病的機制；研究藥物和/或生長因子作用的機制；診斷和監(jiān)測患者中的癌癥；基因治療；和生產(chǎn)生物活性化合物等等。
[0104]所述可包含pancreatite的胰島能體外用于篩選多種化合物，例如細胞毒性化合物、生長/調(diào)節(jié)因子、藥劑等。為此，所述可包含pancreatite的胰島體外維持，并且暴露于要測試的化合物。細胞毒性化合物的活性可以通過培養(yǎng)中其損傷或殺死可包含pancreatite的胰島的能力來測量。這容易通過活體染色技術來評價?？梢酝ㄟ^例如總細胞計數(shù)和差異細胞計數(shù)評價生長/調(diào)節(jié)因子的影響。這可使用標準細胞學和/或組織學技術完成，包括使用定義類型特異性細胞抗原的抗體的免疫細胞化學技術?？梢栽u價各種藥物對可包含pancreatite的胰島的影響。
[0105]可包含pancreatite的胰島能通過本領域已知的任何方法給予患者。給藥的合適方法包含例如靜脈內(nèi)、皮下、通過肝門靜脈、通過腎小囊下移植、或進入腎間充質(zhì)。在實施方式中，可包含pancreatite的胰島能單獨或者與制劑或底物聯(lián)合給予患者。所述可包含pancreatite的胰島能在合適給予的例如水性和非水性制劑中,在等滲的無菌注射液中，所述注射液能包含使該制劑與預期接受者血液等滲的抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和溶質(zhì)，和在能包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸浮液中。在實施方式中，所述可包含pancreatite的胰島或其制劑能通過例如腎下直接手術移植、門內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)輸注或腹膜內(nèi)輸注給予。
[0106]為測定治療或預防由減少或異常胰島素表達所引起病癥中待給予的有效量的含pancreatite胰島，醫(yī)師評價細胞毒性、移植反應、疾病進展和抗細胞抗體的生成。對給藥而言，可以給予有效量的本公開方法制備的所述可包含pancreatite的胰島以向?qū)ο筇峁藴驶钠咸烟琼憫砸葝u素生成和標準化葡萄糖水平，考慮應用于質(zhì)量和患者整體健康時各種濃度下細胞類型的副作用。在實施方式中，給藥可以通過單個或分開的劑量完成。
[0107]示例如下文所示，并且闡明能用于實踐實施方式的不同組合物和條件。除非另有說明，所有的比例是重量比例。然而，顯然本公開能通過很多類型的組合物來實施，并且根據(jù)上述公開和下文所指出，能有很多不同的應用。例如，本領域普通技術人員容易識別這些示例，其也可應用于分離人胰島，因為豬胰腺是本領域認可的人胰腺模型。
[0108]豬胰腺是有用的模型，因為至少豬被視作就未來臨床異種移植而言最有希望的胰島來源。分離包含胰島的細胞產(chǎn)物前，胰腺保存的特殊示例在引起全世界興趣的胰島異種移植方面非常重要，可以幫助提高胰島產(chǎn)量而不損傷胰島功能。
[0109]另外，近期由國際異種移植協(xié)會(InternationalXenotransplantationAssociation)所發(fā)表關于I型糖尿病的豬胰島產(chǎn)物臨床試驗的共識戰(zhàn)略規(guī)劃強調(diào)了就豬源和產(chǎn)物而言無菌、無疾病環(huán)境的需要和重要性。為此，LifePort?系統(tǒng)提供了從采購點運輸胰腺源到胰島加工設施的便捷無菌環(huán)境。這個方法應用于豬胰島低溫灌注保存后，活胰島的保存和獲取，因為出于很多強有力的原因，現(xiàn)在認為豬是異種移植胰島移植選擇的供體物種(0’Neil，J.J.等，The isolation and function of porcineislets from market weight pigs (《上市體重豬的豬胰島的分離和功能》)，CellTransplant.10:235 - 246;2001)。
[0110]用于離體機器保存的器官獲取和胰腺插管的手術過程可以強烈影響用于胰島分離的豬胰腺低溫灌注的成功。豬胰腺手術恢復方法的發(fā)展不是明顯的過程。最初，缺乏詳細豬胰腺解剖學記錄造成胰腺獲取中不合適的器官血管系統(tǒng)保存。不充分的器官獲取造成不一致和不完整的胰腺機器灌注，因而產(chǎn)生低胰島產(chǎn)率和活力。
[0111]直到最近，豬胰腺的解剖學才得到良好記載。在生理上和形貌上，認為豬和人胰島相似。所述胰腺是如圖1所示延長的腹膜后腺體。在豬和人中，胰頭與十二指腸近端密切關聯(lián)，但是豬的胰腺管開口在十二指腸遠端發(fā)現(xiàn)，并且與膽總管分開(Swindle，M.Μ.; Smith, A.C.Comparative anatomy and physiology of the pig (《豬的比較解剖學和生理學》).Scand.J.Lab.Anim.Surg.23:1 - 10; 1997)。源自脾、肝、胃十二指腸、腸系膜上和腹腔動脈的血管數(shù)目可變，其在個體基礎上有非常規(guī)胰腺血液供應配置。通常，頭部的血液由來自胃十二指腸的前和后動脈以及腸系膜上動脈提供(圖1)。豬中，頭部不圍繞胰十二指腸的動脈和靜脈一后者在頭部和十二指腸之間，有容易鑒定的胰腺分支。胰腺頸和腺體通常由胰背動脈和胰下動脈血管化。前者源于脾、肝或直接來自腹腔動脈。所述胰下動脈可始于胰腺頸下面的腸系膜上動脈(SMA)并且與腺體密切接觸、沿著胰腺表面的后下部邊緣流向尾部。其能與不同數(shù)目的脾動脈分支聯(lián)系。胰腺頸也是脾和腸系膜上靜脈匯集處的門靜脈位點。胰尾接受主要來自脾動脈的血液供應。
[0112]在所述供體組織(胰腺)可灌注和/或連接到LifePort?灌注機器的實施方式中，胰腺的胃十二指腸和肝側邊緣上的所有暴露動脈分支應該小心鑒定和連接，以確保通過腺體的均一灌注，并且使流出物僅從門靜脈出現(xiàn)。就胰島分離而言胰腺灌注/保存的經(jīng)證明最優(yōu)手術方法描述于Taylor, M.J.等，Hypothermic perfusion of pancreas:Emphasis onpreservation prior to islet isolation (《胰腺的低溫灌注:著重胰島分離前的保存》)，收錄于Lee, C.Y.編，Organ perfusion preservation (《器官灌注保存》)馬薩諸塞州波士頓的阿泰克出版社(Artech House Publisher) ; 2010,其通過全文整體納入本文。
[0113]如Taylor等所述，示例性手術方法可以包含下列:1.胰腺獲取的兩個操作者組-X遵循用于著裝標準和個人保護設備的手術設施要求；3.0R獸醫(yī)技師確證豬被插管和處于全身麻醉下(即氯胺酮22mg/kg、乙酰丙嗪0.2mg/kg和阿托品0.025mg/kg) ; OR獸醫(yī)技師確證維持豬的麻醉和合適的通氣；4.0R獸醫(yī)技師證實監(jiān)測所有的生命體征(ECG、心率、氧飽和水平、體溫等)；5.證實電刀、抽吸線和罐是可用的。6.0R證實合適準備了后場手術臺(手術設備、手術巾(lap sponge)、紗布、冷鹽水、全棉臍帶線等)；7.證實2L冷乳酸林格溶液置于冰上；8.證實操作臺附近可用1.V.桿，并且其高度對重力驅(qū)動的器官原位沖洗合適(約6 -約6.5英尺)；9.從OR獸醫(yī)技師獲得進行手術的許可；10.使胰腺暴露于熱缺血最小化到3分鐘，除非另有需要；11.當授予許可時，從劍狀軟骨到剛好骨盆上面進行中線切口并且暴露腹腔；12.指導OR獸醫(yī)技師向豬給予肝素(約150U/kg)，使在開始原位沖洗前通過至少三分鐘；13.(在手術巾幫助下)移動膀胱和腸并且把它們放置一旁，和鑒定降主動脈；14.在腎下面從周圍組織/血管中切開主動脈區(qū)段(約3cm)，在主動脈區(qū)段周圍置入臍帶膠布結；在兩個結之間的主動脈上切一個小開口，而外科手術助理員向主動脈壁上施加壓力以防止血液噴射出；15.主動脈插管插入所述開口并且在適當?shù)奈恢么蚪Y(確保全棉臍帶線牢固地置于套管(cannula)箍)；16.把沖洗器的兩個釘插入到乳酸林格溶液兩個袋子的合適灌注口(確保輥夾具關閉以防止溶液損失)；17.乳酸林格溶液的袋子懸掛在1.V.桿上并且沖洗沖洗器管以合適去除所有空氣；關閉輥夾具；18.下腔靜脈和主動脈在隔膜上阻斷；19.連接套管的胰島開口與沖洗器流出口，并且打開輥夾具以開始重力驅(qū)動的原位沖洗；20.在隔膜上、夾具下游切開下腔靜脈，以使血液流出；21.在腹腔內(nèi)胰腺和肝周圍立即放置充足的冰，以在低溫下維持/保護器官；22.使用吸入管和容器收集洗出的血液；23.確保來自所述袋通過套管進入主動脈的溶液流沒有被阻斷，并且從下腔靜脈流出；24.當清空時，從1.V.桿除去乳酸林格溶液袋，并且懸掛SPS-1溶液袋(預先保存在冰上)，使用僅一半的SPS-1溶液體積沖洗器官；25.指導OR獸醫(yī)技師使用靜脈內(nèi)給予致死劑量的5%戊巴比妥鈉對豬施以安樂死(根據(jù)美國獸醫(yī)協(xié)會組安樂死委員會(AmericanVeterinary Medical Association Panel on Euthanasia (AVMA))指南可接受的安樂死形式)并且完成原位沖洗；26.把SPS-1溶液袋的另一半轉(zhuǎn)移到胰腺運輸生物危險品袋中，并且把后者置于冰上；27.小心并快速(小于15分鐘)進行暴露并且解剖分離胰腺與周圍組織和器官(如需要，內(nèi)臟器官周圍加上冰)，確保維持胰腺囊和完整性；28.使十二指腸近端的區(qū)段(幽門附近，并且包含大部分十二指腸第二降部分)連接到胰腺頭；確保十二指腸區(qū)段包含胰腺管的開口(圖1) ;29.脾脫落前，連接脾靜脈和動脈；30.保持約5 -約7cm長的主動脈片段連接到用于未來器官插管的胰腺上；所述主動脈片段應該包含腸系膜上動脈(SMA)和腹腔干(CT)的開口 ；31.從身體除去胰腺，并且有連接其上的主動脈插管，使用冷鹽水從胰腺外表面快速洗去血液；將胰腺浸入運輸袋的SPS-1溶液中；32.將有胰腺的袋置于冰上，在胰腺冷卻器內(nèi)以運輸?shù)揭葝u分離實驗室。
[0114]在所述供體組織(胰腺)可灌注和/或連接到LifePort?灌注機器的實施方式中，用于機器灌注的示例性胰腺插管方法可以包含:1.對胰腺清潔和插管推薦兩個操作者組-X在分離實驗室進行胰腺插管以在機器灌注前降低靜態(tài)冷缺血損傷；3.使胰腺暴露于靜態(tài)冷缺血最小化到小于2小時，靜態(tài)冷缺血時間是從開始原位沖洗到開始機器灌注的時間；4.將胰腺從運輸冷卻器轉(zhuǎn)移到不銹鋼手術盤中；把后者置于冰上并且從運輸袋分配約20-30mL的SPS-1溶液到所述盤以幫助保持胰腺濕潤和冷；5.除去主動脈插管；除去所有的混雜組織，同時密切關注維持胰腺完整性；鑒定和暴露SMA和CT血管；6.在中線切開主動脈片段，以暴露SMA和CT孔，此時所述SMA和CT孔應該在與主動脈口分開的位置清楚看到(1.5cm x4cm);7.在合適位置放置和固定適當尺寸的環(huán)形密封套管，正確的尺寸應該包含沒有阻塞的SMA和CT孔，并且使其通過套管的頂部清晰孔而清楚可見；8.測試泄漏；向20cc注射器填充用于灌注的溶液，連接注射器到套管的一端，除去套管內(nèi)的空氣，并且覆蓋套管的另一端，溶液溫和注入胰腺中，并·且鑒定已暴露血管的任意泄露；9.在胰腺的胃十二指腸和肝側邊緣上仔細鑒定和連接所有暴露的泄露動脈分支(使用合適的全棉臍帶線和/或絲結)；10.插管到胰腺管；從蝶翼輸液器中移出針并且使用其管作為所述管的套管；使用微外科手術剪在胰腺管的十二指腸起始位點上開口并且插入套管；通過緊密縫合到十二指腸壁而將后者固定在合適位置上；11.測量和記錄胰腺重量(減去插管重量)、質(zhì)量(減去插管質(zhì)量)、體積、周長、和/或浮力。
[0115]胰腺的肝和胃十二指腸側上所有暴露血管的鑒定和緊密連接都很重要。灌注前通常結扎約12-約14血管以就整個器官中流動而言消除‘最小抗性’通路的可能性，并且使流出物僅從門靜脈出現(xiàn)。所打開血管的泄露損害器官灌注的均勻性，進而造成通過器官表面的壓力和溫度梯度，以及次優(yōu)胰腺保存。
[0116]應用胰腺機器灌注的示例性方法可包含以下(圖2):1.用冰和冷水混合物填充冰容器(參考LifePort?操作手冊)，把容器置于運輸器主要附件中；2.將器官盒置于盒孔中，在泵座上安裝灌注回路管框架，并且關閉鋁鎖臂，連接壓力傳感器與壓力換能器；3.按下電源(POWER)以打開運輸器的用戶控制并按照外顯示方向以使運輸器可用于灌注；4.加入IL冷灌注溶液到器官盒；在控制面板上設定輸注壓力為約IOmmHg,證明如外顯示器所示的冰容器溫度低于約8° C;5.按下洗滌(WASH)以開啟泵和使灌注液循環(huán)通過回路；確?；芈分谐ニ锌諝?；6.將腺(有連接的十二指腸)置于盒內(nèi)，并且把器官套管置于支架的套管座(mount)，連接套管入口孔與輸注線，并且打開套管出口孔；7.按下初次(PRME)以從套管和輸注線中除去空氣，并且然后蓋上套管；根據(jù)檢測的抗性，后者會停止流動和泵；8.按下停止(STOP);按下輸注(INFUSE)以起始胰腺灌注模式，監(jiān)測泵以開始旋轉(zhuǎn)并且增加其速度，直到達到壓力設定點(如約IOmm Hg);9.確保在外顯示器和數(shù)據(jù)站實時觀察和記錄流動參數(shù)，外部面板所示的灌注參數(shù)是:壓力設定點(收縮壓，_Hg)、流速(mL/min)、抗性(mmHg/ (mL/min))、溫度(° C，在運輸器的絕緣冷部分內(nèi)，即冰容器)，以讀取輸注溫度(° C)，并且舒張壓(mmHg)壓迫外顯示器右側的滾動箭頭以通過這些其他參數(shù)順序拴牢；10.使胰腺灌注需要的時間量，例如小于約24h(或范圍約4h-約24h，例如約8h-約16h)，或約24h或更長，或者在約24h-約48h范圍內(nèi)；停止泵，并且保存數(shù)據(jù)文件(包含所有灌注參數(shù)動態(tài))；11.從盒中除去胰腺；測量灌注后胰腺重量、質(zhì)量、周長、浮力、體積，并且記錄；測定器官內(nèi)流動積累的水平(水腫％)。
[0117]實施例
[0118]切除來自年輕豬(〈6月齡)的胰腺，用保存溶液沖洗，低溫保存1-24小時，通過導管輸注膠原酶延長以將腺體分離成腺泡(外分泌)組織和胰島(內(nèi)分泌)，并且最終在密度梯度上進行消化以純化胰島。實施后一過程，從而沒有嘗試胰島的全部純化。圖3顯示上面過程產(chǎn)生70-80%純胰島。通過(可見和/或?qū)嵙Ⅲw鏡)監(jiān)測計算胰島包圍的面積與培養(yǎng)基中外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積之比來評價胰島的純度。圖4顯示了 24小時低溫機器灌注(HMP)后，在由年輕胰腺所制備不成熟胰島的分離后培養(yǎng)中觀察到的塑性。所述組織在專門Wilson-Wolfe燒瓶(明尼蘇達州威爾森沃爾夫制造公司)中37° C培育，其中所述組織位于硅膠膜表面以幫助與環(huán)境的氧交換。圖4的各個圖顯示分離后I周培養(yǎng)中各個時間點的內(nèi)分泌表觀(用雙硫腙染成紅色)和外分泌表觀(未染色的灰褐色)一圖4(A-H):A:24 小時(xlOO) ;B:24 小時(xlOO) ;C:48 小時(xlOO) ;D:48 小時(x200) ;E:5 天(xlOO);F:6 天(xlOO);G:6 天(x200);H:6 天(xlOO)。
[0119]有趣的是，在培養(yǎng)的前24小時內(nèi)，所述胰島的總體形態(tài)改變(比較圖4A和4B中24h培養(yǎng)胰島的更松散、更片段化的特性，與緊接分離后第O天胰島的“葡萄樣”簇相比較)。組織從24小時的松散分解外觀轉(zhuǎn)換成第6天包含外分泌和內(nèi)分泌細胞的更濃縮聚集結構。這與來自成年種類的胰島通常性質(zhì)明顯不同，其在整個培養(yǎng)期間單獨維持胰島和分離后結構。在培養(yǎng)成年胰島中，污染外分泌組織易于通過自溶崩解和消失，留下個體胰島的甚至更純制品。相反，來自未成熟豬的組織似乎重新聚集成與自然胰腺共存的、包含內(nèi)分泌和外分泌細胞的更大且新型結構-因此的術語“pancreatite”。這些結構后續(xù)以各種體外和體內(nèi)(圖5)活力測試進行，并且顯示了在響應葡萄糖攻擊的胰島素分泌方面有全部功能。圖5顯示了通過移植豬pancreatite置于腎小囊下而治愈了免疫受損小鼠的糖尿病病癥。傳統(tǒng)組織學的進一步分析會確證這些pancreatite的結構組成。
【權利要求】
1.一種制備胰島的方法，所述方法包含: 在存在外分泌物質(zhì)的培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)胰島。
2.如前述權利要求所述的方法，其特征在于，所述方法還包含通過用消化酶處理胰腺組織以從胰腺組織分離胰島。
3.一種制備pancreatite的方法,所述方法包含: 用酶消化處理包含胰島的供體組織以獲得包含胰島的細胞產(chǎn)物；和 將包含胰島的細胞產(chǎn)物接種到存在外分泌物質(zhì)的培養(yǎng)基中。
4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述胰島包含未成熟胰島。
5.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基存在于膜上，例如透氣膜，優(yōu)選聚碳酸酯透氣娃膠膜培養(yǎng)瓶。
6.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述胰島存在的量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約20%，其中，所述胰島的量通過胰島包圍的面積與培養(yǎng)基中所存在外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積之比來計算，例如所述胰島存在的量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約30%，或其中所述胰島存在的量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約40%。
7.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述胰島存在的量小于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約70%，例如所述胰島存在的量小于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約60%，或其中所述胰島存在的量小于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的 約50%。
8.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述外分泌物質(zhì)存在的量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約60%，其中，所述外分泌物質(zhì)的量通過外分泌組織包圍的面積與培養(yǎng)基中所存在外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積之比來計算，例如所述外分泌物質(zhì)存在的量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約70%，或其中所述外分泌物質(zhì)存在的量大于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約80%。
9.如權利要求1-7所述的方法，其特征在于，所述外分泌物質(zhì)存在的量小于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約50%，其中，所述外分泌物質(zhì)的量通過外分泌物質(zhì)包圍的面積與培養(yǎng)基中所存在外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積之比來計算，例如所述外分泌物質(zhì)存在的量小于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約40%，或其中所述外分泌物質(zhì)存在的量小于培養(yǎng)基中存在的外分泌組織和內(nèi)分泌組織總面積的約30%。
10.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述胰島獲自選自下組的供體:非成年供體、年輕供體、哺乳動物供體、人供體、豬供體、牛供體、和靈長類供體。
11.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述外分泌物質(zhì)獲自供體胰腺。
12.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述胰島與胰腺組織分離后，所述胰島與外分泌物質(zhì)組合。
13.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述外分泌物質(zhì)和胰島獲自單個供體胰腺。
14.如權利要求1-12所述的方法，其特征在于，所述外分泌物質(zhì)是合成的、或獲自非胰島來源的供體胰腺。
15.—種包含pancreatite的組合物,所述組合物由前述權利要求中任一項所述方法制備，或者通過離體組 合分離胰島與分離外分泌物質(zhì)獲得。
【文檔編號】C12N5/071GK103429733SQ201180060765
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年10月21日 優(yōu)先權日:2010年10月22日
【發(fā)明者】M·J·泰勒, S·C·巴伊庫 申請人:細胞與組織系統(tǒng)股份有限公司