專利名稱：防止在玉米根蟲(根螢葉甲)中形成抗性的包括Cry34Ab/35Ab和Cry3Aa蛋白的組合的制作方法
防止在玉米根蟲(根螢葉甲)中形成抗性的包括Cry34Ab/35Ab和Cry3Aa蛋白的組合
背景技術(shù)：
人類為食物和能量應(yīng)用而種植玉米。玉米是一種重要的作物。它在世界許多地區(qū)是食物、食品、和動物飼料的重要來源。昆蟲進(jìn)食和損害植物，并由此破壞這些人類努力。每年花費(fèi)數(shù)十億美元來控制昆蟲害蟲，并且它們造成的損害另外損失數(shù)十億。昆蟲害蟲引起的損害是世界玉米作物損失的一個主要因素，盡管使用了保護(hù)措施諸如化學(xué)殺蟲劑。鑒于這一點，已經(jīng)通過遺傳工程將昆蟲抗性改造到作物諸如玉米中以控制昆蟲損害和降低對傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑的需要。在美國，每年有超過I千萬英畝的玉米感染玉米根蟲物種聯(lián)合體(cornrootwormspecies complex)。玉米根蟲物種聯(lián)合體包括北方玉米根蟲(Diabrotica barberi)、南方玉米根蟲(D.undecimpunctata howardi )、和西方玉米根蟲(D.virgifera virgifera)。(其它物種包括 Diabrotica virgifera zeae (墨西哥玉米根蟲)、Diabrotica balteata (巴西玉米根蟲)、和巴西玉米根蟲聯(lián)合體(Diabrotica viridula和Diabrotica speciosa)。這些根螢葉甲物種(Diabrotica species)的土棲幼蟲以玉米植物的根為食,引起倒伏。倒伏最終降低玉米產(chǎn)量，而且常常導(dǎo)致植物死亡。通過以玉米穗絲為食，成年甲蟲降低授粉，并因此對每株植物的玉米產(chǎn)量產(chǎn)生有害影響。另外，根螢葉甲屬的成蟲和幼蟲攻擊葫蘆科作物(cucurbit crops)(黃瓜、甜瓜(melons)、南瓜(squash)、等)和商業(yè)生產(chǎn)的許多蔬菜和田地作物以及宅園中種植的那些。合成有機(jī)化學(xué)殺蟲劑已經(jīng)成為用于控`制昆蟲害蟲的主要工具，但是生物學(xué)殺蟲劑(諸如自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thruingiensis,Bt)衍生的殺蟲蛋白)已經(jīng)在一些地區(qū)發(fā)揮重要作用。經(jīng)由用Bt殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)化來生成昆蟲抗性植物的能力已經(jīng)改革了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，并且提高了殺蟲蛋白及其基因的重要性和價值。來自一些蘇云金芽孢桿菌(B.t.)菌株的殺蟲晶體蛋白是本領(lǐng)域公知的。參見例如 Hofte 等人，Microbial Reviews, Vol.53, N0.2, pp.242-255 (1989)。這些蛋白質(zhì)通常由細(xì)菌作為大約130kDa毒素原生成，然后在被昆蟲攝取后受到昆蟲中腸中的蛋白酶的切割以產(chǎn)生大致60kDa核心毒素。這些蛋白質(zhì)稱作晶體蛋白，因為用一些B.t菌株的孢子能觀察到獨(dú)特晶體內(nèi)含物。這些晶體內(nèi)含物常常由數(shù)種獨(dú)特蛋白質(zhì)構(gòu)成。已經(jīng)用于生成轉(zhuǎn)基因昆蟲抗性作物的一組基因是來自蘇云金芽孢桿菌(B.t.)的德爾塔-內(nèi)毒素。德爾塔-內(nèi)毒素已經(jīng)在作物植物(諸如棉花、馬鈴薯、稻、向日葵、以及玉米)中成功表達(dá)，而且已經(jīng)證明對昆蟲害蟲提供卓越的控制。(Perlak，F(xiàn).J.等人(1990) Bio/Technology 8,939-943 ；Perlak, F.J.等人(1993)Plant Mol.Biol.22:313-321 ；Fujimoto H.等人(1993)Bio/Technology 11:1151-1155 ;Tu 等人(2000)NatureBiotechnologyl8:1101-1104 ;PCT 申請?zhí)?WO 01/13731 jBing J W 等人(2000)EfficacyofCry IF Transgenic Maize,14th Biennial International Plant Resistance toInsectsfforkshop, Fort Collins, Col0.X迄今為止，已經(jīng)使用數(shù)種Bt蛋白創(chuàng)建了昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物，它們已經(jīng)成功登記和商品化。這些包括玉米中的CrylAb、CrylAc、CrylF、Cry3Aa、和Cry3Bb,棉花中的CrylAc和Cry2Ab，及馬鈴薯中的Cry3A。還有玉米中的SMART STAX，它包含CrylA.105和Cry2Ab。表達(dá)這些蛋白質(zhì)的商業(yè)產(chǎn)品表達(dá)單一蛋白質(zhì)，想要兩種蛋白質(zhì)的組合殺蟲譜的情況(例如組合玉米中的CrylAb和Cry3Bb以分別提供對鱗翅目害蟲和根蟲的抗性)或蛋白質(zhì)的獨(dú)立作用使得它們作為用于延遲在易感昆蟲群體中形成抗性的工具是有用的情況(例如組合棉花中的CrylAc和Cry2Ab以提供對煙草蚜蟲的抗性管理)除外。導(dǎo)致快速和廣泛采用這種技術(shù)的昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物的一些性質(zhì)也產(chǎn)生害蟲群體會對由這些植物生成的殺蟲蛋白形成抗性的擔(dān)憂。已經(jīng)提出數(shù)種策略來保持基于Bt的昆蟲抗性性狀的效用，包括以高劑量部署各蛋白質(zhì)并與庇護(hù)(refuge)組合，及與不同毒素交替或共同使用(McGaughey 等人(1998), “B.t.Resistance Management”，NatureBiotechnol.16:144_146)。為在昆蟲抗性管理(IRM)堆疊中使用而選擇的蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)是有活性的，使得對一種蛋白質(zhì)形成的抗性不賦予對第二蛋白質(zhì)的抗性(即沒有對各蛋白質(zhì)的交叉抗性)。例如，如果為對“蛋白A”的抗性 選擇的害蟲群體對“蛋白B”敏感，那么會得出結(jié)論，沒有交叉抗性且蛋白A和蛋白B的組合會有效延遲對單獨(dú)的蛋白A的抗性。在抗性昆蟲群體缺失下，可以基于假設(shè)涉及交叉抗性潛力的其它特征來進(jìn)行評估。已經(jīng)提出利用受體介導(dǎo)的結(jié)合來鑒定很可能不展現(xiàn)交叉抗性的殺蟲蛋白(vanMellaert等人，1999)。這種辦法中內(nèi)在交叉抗性缺失的關(guān)鍵預(yù)示在于殺蟲蛋白在敏感昆蟲物種中不競爭受體。如果兩種Bt毒素競爭同一受體，那么如果該受體在該昆蟲中突變，使得毒素之一不再結(jié)合該受體并因此不再對昆蟲有殺蟲活性，那么情況可能是昆蟲也會對第二毒素(其競爭性結(jié)合同一受體)有抗性。就是說，昆蟲據(jù)說對兩種Bt毒素有交叉抗性。然而，如果兩種毒素結(jié)合兩種不同受體，那么這可能指示昆蟲不會同時對那兩種毒素有抗性。在蘇云金芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種相對較新的殺蟲蛋白系統(tǒng)，如W097/40162中公開的。這種系統(tǒng)包含兩種蛋白質(zhì)一一種大約15kDa,另一種約45kDa。還可參見美國專利N0.6，083，499和N0.6，127，180。這些蛋白質(zhì)現(xiàn)在已經(jīng)分派到它們自己的類，而且相應(yīng)地分別得到 Cry 名稱 Cry34 和 Cry35。參見 Crickmore 等人的網(wǎng)站(biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)0現(xiàn)在已經(jīng)公開了這種類型的系統(tǒng)的許多其它相關(guān)蛋白質(zhì)。參見例如美國專利N0.6，372，480 ；W0 01/14417 ;和WO 00/66742。還已經(jīng)公開了經(jīng)過植物優(yōu)化的編碼此類蛋白質(zhì)的基因，其中基因改造成使用植物中最優(yōu)化表達(dá)的密碼子。參見例如美國專利 N0.6，218，188。Cry34/35系統(tǒng)的確切作用模式還有待確定，但是它看來在昆蟲腸細(xì)胞的膜中形成孔。參見 Moellenbeck 等人，Nature Biotechnology, vol.19, p.668 (July 2001) ；Masson等人，Biochemistry，43( 12349-12357)(2004)。確切作用機(jī)制仍然不清楚，盡管知道Cry34和Cry35蛋白的3D原子坐標(biāo)和晶體結(jié)構(gòu)。參見美國專利N0.7，524，810和N0.7，309, 785。例如，不清楚這兩種蛋白質(zhì)之一或二者是否結(jié)合典型類型的受體，諸如堿性磷酸酶或氨肽酶。此外，因為昆蟲對Cry蛋白形成抗性存在不同的機(jī)制(諸如通過改變受體的糖基化[參見Jurat-Fuentes 等人(2002) 68AEM 5711-5717]、通過去除受體蛋白[參見 Lee 等人(1995)6IAEM 3836-3842]、通過突變受體或通過其它機(jī)制[參見Heckel等人，J.1nv.Pathol.95(2007)192-197])，所以不可能先驗地預(yù)測Cry34/35與其它Cry蛋白之間是否會有交叉抗性。預(yù)測Cry34/35系統(tǒng)的競爭性結(jié)合還因Cry34/35 二元系統(tǒng)涉及兩種蛋白質(zhì)的事實而進(jìn)一步復(fù)雜化。再次，不清楚這些蛋白質(zhì)是否和如何有效結(jié)合昆蟲腸/腸細(xì)胞，及它們是否和如何彼此相互作用或結(jié)合。用于控制鞘翅目的其它選擇包括Cry3Bb毒素、Cry3C、Cry6B、ET29、ET33及ET34、TIC407、TIC435、TIC417、TIC901、TIC1201、ET29 及 TIC810、ET70、ET76 及 ET80、TIC851、等等。還已經(jīng)提出了 RNAi 辦法。參見例如 Baum 等人,Nature Biotechnology, vol.25,n0.11(Nov.2007)pp.1322-1326。發(fā)明概述本發(fā)明部分涉及Cry34Ab/35Ab與Cry3Aa的組合。本發(fā)明部分涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即Cry34Ab/Cry35Ab和Cry3Aa對于防止玉米根蟲(根螢葉甲(Diabrotica spp.))群體形成抗性(對單獨(dú)的任一殺蟲蛋白系統(tǒng))是有用的。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員借助此公開內(nèi)容會認(rèn)識到的，生成這些殺蟲Cry蛋白的植物對減輕會形成對單獨(dú)的任一這些殺蟲蛋白系統(tǒng)有抗性的玉米根蟲群體的擔(dān)憂會是有用的。本發(fā)明部分得到下述發(fā)現(xiàn)的支持，即這些Cry蛋白系統(tǒng)的各成分沒有彼此競爭對玉米根蟲腸受體的結(jié)合。本發(fā)明還部分涉及三種(或更多種)毒素系統(tǒng)的三重堆疊或“金字塔”，其中Cry34Ab/Cry35Ab和Cry3Aa作為基礎(chǔ)對。如此，生成這兩種殺蟲蛋白系統(tǒng)的植物(和種植此類植物的土地)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。附圖簡述對圖的詳細(xì)描述特別指附圖，其中:

圖1。作為輸入放射性`標(biāo)記的Cry毒素的函數(shù)，125I_Cry35Abl (A)和125I_Cry3Aa(B)對自西方玉米根蟲幼蟲制備的BBMV的結(jié)合。特異性結(jié)合=總結(jié)合-非特異性結(jié)合，誤差條=SEM (均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。結(jié)合實驗證明了 125I_Cry35Abl和125I_Cry3Aa都能夠特異性結(jié)合BBMV (圖1A和IB)。1251-Cry35Abl 和 1251-Cry3Aa 分別具有結(jié)合親和力 Kd=2.31 ± 1.26,24.0±9.7 (nM),而且分別具有結(jié)合位點濃度 Bmax=31.69±6.38，146.3±39.9 (pmole/ug BBMV)0圖2。在不同濃度的未標(biāo)記競爭者的情況中，125I_Cry3Aa對自西方玉米根蟲幼蟲制備的BBMV的結(jié)合。同源競爭結(jié)合的誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，而異源競爭的誤差條未顯示。實驗結(jié)果證明了當(dāng)摩爾濃度升高至500nM (100倍過量于125I_Cry3Aa)時，Cry3Aa能夠完全置換自身(圖2)。然而，單獨(dú)的Cry35Abl或Cry35Abl+Cry34Abl (1:3)混合物均不能置換1251-Cry3Aa。這些數(shù)據(jù)指示了單獨(dú)的Cry35Abl或Cry35Abl+Cry34Abl (1:3)不與Cry3Aa分享受體。序列簡述SEQ ID NO:1:全長,天然Cry35Aa蛋白序列SEQ ID NO:2:胰蛋白酶截短的Cry3Aa核心蛋白序列SEQ ID NO:3:全長,天然 Cry34Abl 蛋白序列SEQ ID N0:4:全長,天然 Cry35Abl 蛋白序列SEQ ID NO:5:胰凝乳蛋白酶截短的Cry35Abl核心蛋白序列
SEQ ID NO:6:cry34Ab DNASEQ ID NO:7:cry35Ab DNASEQ ID NO:8:cry3Aa DNA發(fā)明詳述Cry34Ab/35Ab蛋白的序列可以自例如蘇云金芽孢桿菌隔離群PS149B1獲得。對于依照本發(fā)明使用的其它基因、蛋白質(zhì)序列、和來源隔離群，參見例如Crickmore等人的網(wǎng)站(lifesc1.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro, html)。本發(fā)明包括Cry34Ab/35Ab殺蟲蛋白與Cry3Aa毒素的組合保護(hù)玉米免于由可能對單獨(dú)的任一這些Cry蛋白系統(tǒng)形成抗性(對另一種則不形成抗性)的玉米根蟲群體的玉米根蟲進(jìn)食引起的損害和產(chǎn)量損失的用途。如此，本發(fā)明教導(dǎo)昆蟲抗性管理(IRM)堆疊以防止玉米根蟲對Cry3Aa和/或Cry34Ab/35Ab 形成抗性 。本發(fā)明提供用于控制根蟲害蟲的組合物，其包含生成Cry3Aa毒素蛋白和Cry34Ab/35Ab毒素系統(tǒng)的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步包含經(jīng)過轉(zhuǎn)化以生成Cry3Aa蛋白和Cry34Ab/35Ab 二元毒素的宿主，其中所述宿主為微生物或植物細(xì)胞。另外，本發(fā)明提供控制根蟲害蟲的方法，包括使所述害蟲或所述害蟲的環(huán)境與有效量的含有Cry3Aa蛋白且進(jìn)一步含有Cry34Ab/35Ab 二元毒素的組合物接觸。本發(fā)明的一個實施方案包含玉蜀黍植物，其包含編碼Cry34Ab/35Ab 二元毒素的植物可表達(dá)基因和編碼Cry3Aa蛋白的植物可表達(dá)基因，及此類植物的種子。本發(fā)明的又一個實施方案包含玉蜀黍植物，其中編碼Cry34Ab/35Ab 二元毒素的植物可表達(dá)基因和編碼Cry3Aa蛋白的植物可表達(dá)基因已經(jīng)漸滲入所述玉蜀黍植物中，及此類植物的種子。如實施例中描述的，使用放射性標(biāo)記的Cry35Ab核心毒素蛋白的競爭性受體結(jié)合研究顯示Cry3Aa核心毒素蛋白在CRW昆蟲組織樣品中不競爭結(jié)合Cry35Ab所結(jié)合的。參見圖2。這些結(jié)果指示Cry3Aa和Cry34Ab/35Ab蛋白的組合是減輕CRW群體中對單獨(dú)的任一蛋白質(zhì)系統(tǒng)形成抗性的有效手段。如此,部分基于上文和本文中別處描述的數(shù)據(jù),可使用Cry34Ab/35Ab和Cry3Aa蛋白生成IRM組合來防止或減輕CRW形成抗性。例如，可將其它蛋白質(zhì)添加至這種組合以擴(kuò)展昆蟲控制譜。還可以在一些優(yōu)選的“三重堆疊”或“金字塔”中與用于控制根蟲的又一種蛋白質(zhì)(諸如Cry3Ba和/或Cry6Aa)組合使用主題對/組合。針對根蟲的RNAi又是另一種選擇。參見例如 Baum等人,Nature Biotechnology, vol.25,N0.ll(Nov.2007)pp.1322-1326。此外，根據(jù)本文中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)和教導(dǎo)，可以代入Cry3Ba和/或Cry6Aa，代替本文中示例的Cry3Aa，作為與Cry34A/35A配對的基礎(chǔ)組合。如此，主題組合提供多種針對根蟲的作用模式。本發(fā)明的部署選項包括在根螢葉甲成問題的玉米種植地區(qū)使用Cry3Aa和Cry34Ab/35Ab蛋白。另一個部署選項會是使用Cry3Aa和Cry34Ab/35Ab蛋白之一或二者，并與其它性狀組合。根據(jù)USSN 61/388，273 (2010 年 9 月 30 日提交)(涉及 Cry34Ab/35Ab 和 Cry6Aa蛋白的組合)、USSN 61/476, 005 (2011 年 4 月 15 日提交)(涉及 Cry34Ab/35Ab 和 Cry3Ba蛋白的組合)、和USSN 61/477，447 (2011年4月20日提交)(涉及Cry3Aa和Cry6Aa的組合)的公開內(nèi)容，本發(fā)明的一些優(yōu)選的“三重堆疊”或“多重作用模式堆疊”包括Cry3Aa蛋白，其與Cry34Ab/35Ab蛋白組合,又與Cry6Aa蛋白和/或Cry3Ba蛋白一起。包含cry3Ba基因、cry34Ab/35Ab基因、和第三或第四毒素系統(tǒng)(例如cry3Aa和/或cry6Aa基因)的轉(zhuǎn)基因植物(包括玉米)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如此，此類實施方案以至少三種作用模式靶向昆蟲。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會，Bt毒素(即使在某一類內(nèi)，諸如Cry3Aa和Cry34Ab/35Ab)可以有一定程度的變化?；蚝投舅?。術(shù)語“分離的”指非天然發(fā)生構(gòu)建物中的多核苷酸，或純化的或其它非天然發(fā)生狀態(tài)的蛋白質(zhì)。依照本發(fā)明有用的基因和毒素不僅包括公開的全長序列，而且包括這些序列的片段、變體、突變體、和融合蛋白，它們保留本文中具體示例的毒素的特征性殺蟲活性。如本文中使用的，術(shù)語基因的“變體”或“變異”指編碼相同毒素或編碼具有殺蟲活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中使用的，術(shù)語“等同毒素”指針對靶害蟲與要求保護(hù)的毒素具有相同或本質(zhì)上相同的生物學(xué)活性的毒素?？梢越粨Q這些蛋白質(zhì)的域/亞域以生成嵌合蛋白。參見例如美國專利N0.7，309, 785和7，524，810?！?85專利還教導(dǎo)截短的Cry35蛋白。本文中也示例截短的毒素。如本文中使用的，遵照“Revision of the Nomenclature for theBacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins，，，N.Crickmore, D.R.Zeigler,J.Feitelson, E.Schnepf, J.Van Rie, D.Lereclus, J.Baum,和 D.H.Dean。Microbiologyand Molecular Biology Reviews (1998)Vol 62:807-813,邊界代表大約 95% (Cry3Aa 和Cry34Ab 和 Cry35Ab)、78% (Cry3A 和 Cry34A 和 Cry35A)、和 45% (Cry3 和 Cry34 和 Cry35)序列同一性。依照本發(fā)明，同樣適用于Cry6，如果例如在三重堆疊中使用的話。對本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)顯然的是，編碼活性毒素的基因可以經(jīng)由數(shù)種手段來鑒定和獲得。本文中示例的具體基因或基因部分可以自保藏于培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)的隔離群獲得。這些基因或其部分或變體也可以`合成構(gòu)建，例如通過使用基因合成儀。基因的變異可以使用用于生成點突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地構(gòu)建。還有，這些基因的片段可以使用商品化外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶依照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程生成。例如，可以使用酶(諸如Bal31)或定點誘變自這些基因的末端系統(tǒng)切除核苷酸。編碼活性片段的基因也可以使用多種限制性酶來獲得?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些蛋白質(zhì)毒素的活性片段。保留示例毒素的殺蟲活性的片段和等同物會在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還有，由于遺傳密碼的冗余，多種不同DNA序列可編碼本文中公開的氨基酸序列。創(chuàng)建這些編碼相同或本質(zhì)上相同的毒素的備選DNA序列完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)內(nèi)。這些變體DNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文中使用的，提到“本質(zhì)上相同的”序列指具有對殺蟲活性沒有實質(zhì)影響的氨基酸替代、刪除、添加、或插入的序列。編碼保留殺蟲活性的蛋白質(zhì)的基因的片段也包括在此定乂中。用于鑒定依照本發(fā)明有用的編碼毒素的基因和基因部分的又一種方法是經(jīng)由使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測核苷酸序列。這些序列可以借助適宜的標(biāo)記物來檢測，或者可以制成內(nèi)在發(fā)熒光的，如記載于國際申請?zhí)朩093/16094。如本領(lǐng)域公知的，如果探針分子和核酸樣品通過在兩分子間形成強(qiáng)鍵而雜交，那么可以合理假設(shè)探針和樣品具有實質(zhì)性同源性。優(yōu)選地，通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，如記載于例如Keller，G.H., Μ.M.Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp.169-170。鹽濃度和溫度組合的一些例子如下(以嚴(yán)格性升高的次序):2X SSPE或SSC，于室溫；1X SSPE或 SSC，于 42。C ;(λ IX SSPE 或 SSC，于 42。C ;0.IX SSPE 或 SSC，于 65。C。探針的檢測提供用于以已知方式確定是否發(fā)生雜交的手段。此類探針分析提供用于鑒定本發(fā)明的毒素編碼基因的快速方法。依照本發(fā)明用作探針的核苷酸區(qū)段可使用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來合成。這些核苷酸序列還可作為PCR引物用于擴(kuò)增本發(fā)明的基因。變體毒素。本文中已經(jīng)具體示例了本發(fā)明的某些毒素。由于這些毒素僅僅是本發(fā)明毒素的示例，應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，本發(fā)明包含與示例毒素具有相同或相似殺蟲活性的變體或等同毒素(和編碼等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素會與示例毒素具有氨基酸同源性。在一些實施方案中，這種氨基酸同一性通常會大于75%、或優(yōu)選大于85%、優(yōu)選大于90%、優(yōu)選大于95%、優(yōu)選大于96%、優(yōu)選大于97%、優(yōu)選大于98%、或優(yōu)選大于99%。氨基酸同一性通常會在毒素的關(guān)鍵區(qū)中最高，關(guān)鍵區(qū)負(fù)責(zé)生物學(xué)活性或涉及決定最終負(fù)責(zé)生物學(xué)活性的三維構(gòu)型。在這點上，某些氨基酸替代是可接受的且可預(yù)期的，如果這些替代在對活性不是至關(guān)重要的區(qū)域中或是不影響分子三維構(gòu)型的保守氨基酸替代的話。例如，可以將氨基酸歸入下述類別:非極性的，不帶電荷的極性的，堿性的，和酸性的。其中一個類別的氨基酸用同一類型的另一種氨基酸替換的保守替代落在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要該替代沒有實質(zhì)性改變化合物的生物學(xué)活性。表I提供屬于每一個類別的氨基酸實例的列表。表I
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物，其生成Cry34蛋白、Cry35蛋白、和Cry3A殺蟲蛋白。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)一步生成選自Cry3B和Cry6A的第四殺蟲蛋白。
3.依照權(quán)利要求1-2任一項的植物的種子，其中所述種子包含所述DNA。
4.一種植物田地，其包含多個依照權(quán)利要求1-2任一項的植物。
5.權(quán)利要求4的植物田地，所述田地進(jìn)一步包含非Bt庇護(hù)植物，其中所述庇護(hù)植物占所述田地中所有作物植物的少于40%。
6.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述庇護(hù)植物占所述田地中所有作物植物的少于30%。
7.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述庇護(hù)植物占所述田地中所有作物植物的少于20%。
8.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述庇護(hù)植物占所述田地中所有作物植物的少于10%。
9.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述庇護(hù)植物占所述田地中所有作物植物的少于5%。
10.權(quán)利要求4的植物田地，其中所述田地沒有庇護(hù)植物。
11.權(quán)利要求5的植物田地，其中所述庇護(hù)植物成片或條。
12.—種種子混合物，其包含來自非Bt庇護(hù)植物的庇護(hù)種子和多個權(quán)利要求3的種子，其中所述庇護(hù)種子占該混合物中所有種子的少于40%。
13.權(quán)利要求12的種子混合物，其中所述庇護(hù)種子占該混合物中所有種子的少于30%。
14.權(quán)利要求12的種子混合物，其中所述庇護(hù)種子占該混合物中所有種子的少于20%。
15.權(quán)利要求12的種子混合物，其中所述庇護(hù)種子占該混合物中所有種子的少于10%。
16.權(quán)利要求12的種子混合物，其中所述庇護(hù)種子占該混合物中所有種子的少于5%。
17.—種種子袋或容器，其包含多個權(quán)利要求3的種子，所述袋或容器具有零個庇護(hù)種子。
18.—種管理昆蟲形成對Cry蛋白的抗性的方法，所述方法包括種植種子以生成權(quán)利要求5或10的植物田地。
19.權(quán)利要求5-11任一項的田地，其中所述植物占地超過10英畝。
20.權(quán)利要求1-2任一項的植物，其中所述植物為玉蜀黍植物。
21.權(quán)利要求1-2任一項的植物的植物細(xì)胞，其中所述Cry35蛋白與選自SEQIDNO:4和SEQ ID NO: 5的序列至少95%相同，所述Cry3A殺蟲蛋白與選自SEQ ID ΝΟ:1和SEQ IDNO: 2的序列至少95%相同，且所述Cry34蛋白與SEQID NO: 3至少95%相同。
22.權(quán)利要求1-2任一項的植物，其中所述Cry35蛋白包含選自SEQID N0:4和SEQID NO: 5的序列，所述Cry3A殺蟲蛋白包含選自SEQ ID ΝΟ:1和SEQ IDNO: 2的序列，且所述Cry34A 蛋白包含 SEQ ID NO:3。
23.一種生成權(quán)利要求21的植物細(xì)胞的方法。
24.—種控制根蟲昆蟲的方法,其通過使所述昆蟲與Cry34蛋白、Cry35蛋白、和Cry3A殺蟲蛋白接觸。
25.權(quán)利要求1的植物，其中所述Cry34蛋白為Cry34A蛋白，所述Cry35蛋白為Cry35A蛋白，且所述Cry3A蛋白為Cry3Aa蛋白。
26.權(quán)利要求1的植物，其中所述Cry34蛋白為Cry34Ab蛋白且所述Cry35蛋白為Cry35Ab 蛋白。
27.權(quán)利要求2的植物， 其中所述Cry3B蛋白為Cry3Ba蛋白且所述Cry6A蛋白為Cry6Aa 蛋白。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述Cry34蛋白為Cry34A蛋白，所述Cry35蛋白為Cry35A蛋白，且所述Cry3A蛋白為Cry3Aa蛋白。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述Cry34蛋白為Cry34Ab蛋白且所述Cry35蛋白為Cry35Ab 蛋白。
全文摘要
本發(fā)明部分涉及Cry34Ab/35Ab與Cry3Aa的組合。本發(fā)明部分涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即Cry34Ab/Cry35Ab和Cry3Aa的組合對于防止玉米根蟲(根螢葉甲)群體形成抗性(對單獨(dú)的任一殺蟲蛋白系統(tǒng))是有用的。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員借助此公開內(nèi)容會認(rèn)識到的，生成這些殺蟲Cry蛋白的玉米植物對減輕會形成對單獨(dú)的任一這些殺蟲蛋白系統(tǒng)有抗性的玉米根蟲群體的擔(dān)憂會是有用的。生成這兩種殺蟲蛋白系統(tǒng)的植物(和種植此類植物的土地)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
文檔編號C12N5/04GK103108540SQ201180031054
公開日2013年5月15日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者K.E.納瓦, T.米德, K.J.芬希爾, H.李, T.D.海伊, A.T.伍斯利, M.B.奧爾森 申請人:陶氏益農(nóng)公司