專利名稱：：對玉米根葉甲和歐洲玉米螟的抗性升高的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的玉蜀黍(Zeamay)植物，其對西方玉米根蟲(WesternCornRootworm,WCR)和歐洲玉米螟蟲(EuropeanCornBorer,ECB)都有抗性，且不表達自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)衍生的殺昆蟲性(insecticidal)蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及那些植物的雜種、后代和種子。
背景技術(shù)：
：目前，植物生命的多樣性在前所未有的威脅之下。在農(nóng)業(yè)中，少許改良品種的普遍采用已經(jīng)使重要食物作物的遺傳基礎(chǔ)變窄，而且導致數(shù)百種地方品種的消失。使用植物遺傳多樣性對于滿足未來的發(fā)展需要是至關(guān)重要的。本方法是要增加玉米WCR和ECB抗性性能的生物多樣性。改善玉米的天然宿主植物抗性能為歐洲病蟲害綜合治理(integratedpestmanagement,IPM)提供經(jīng)濟學和生態(tài)學工具。耕地玉米(玉蜀黍)是全世界最重要的經(jīng)濟學和生態(tài)學作物之一。它作為動物飼料、人消費和工業(yè)資源使用的多種可能性已經(jīng)使其耕種變得必不可少。從上世紀90年代起，玉米的高產(chǎn)量性能由于越來越多地牽涉西方玉米根蟲(WCR，玉米根葉甲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte))和歐洲玉米螟蟲(ECB，歐洲玉米螟(OstrinianubilalisHubner))而受到威脅。這兩種有害物通過降低產(chǎn)量穩(wěn)定性而嚴重地影響商業(yè)性玉米生產(chǎn)，而且，另外，受損害的植物常常顯示對由鐮孢菌(Fusariumspp.)引起的繼發(fā)性感染的易感性升高。在EU，玉米占谷物生產(chǎn)的860萬公頃，具有約一百億歐元/年的價值。72%的歐洲玉米收獲作為動物飼料(用于牛、豬、家禽)使用，而剩余部分用于人消費(油、淀粉、面粉)。在法國、意大利、西班牙和德國，近幾十年，玉米面積和產(chǎn)量隨著種植者放棄與谷類進行傳統(tǒng)輪種而顯著增加。因此，在大片地區(qū)中玉米已經(jīng)變?yōu)槲ㄒ坏姆N植作物，在同一片土地上年復一年地連續(xù)種植。在法國，50%的玉米進行連續(xù)種植。在西班牙，約25%的玉米面積在高玉米螟蟲壓力地區(qū)中，而40%在中等壓力地區(qū)中。在德國，約25%的玉米面積受到ECB侵襲。在法國，約40%的玉米面積具有平均每株玉米植物一或多只ECB。在意大利，玉米螟蟲每年侵襲幾乎所有玉米面積，導致7至15%的產(chǎn)量損失。據(jù)估計，潛在歐洲玉米產(chǎn)量的5至7%(=約2.6億歐元)每年由于螟蟲而受到損失，這取決于侵襲強度。每年僅在法國、德國、西班牙和意大利便產(chǎn)生1500萬歐元的處理(殺昆蟲劑和赤眼蜂應(yīng)用)成本(Gianessi等，2003)。對建立潛力的初步研究已經(jīng)顯示了，WCR有可能在歐洲任何種植玉米的地方存活和發(fā)育。第一次觀察到甲蟲后3至5年，有害物會進行繁殖，使得發(fā)生顯著的產(chǎn)量損失。WCR被列為EU檢疫有害物，強制所有歐洲成員國家實施即時措施來阻止有害物的進一步蔓延。專家預測，WCR在歐洲的天然蔓延不能得到終止，而且有害物的進一步蔓延可能會增加損害成本，其與在美國的損害成本相當。針對WCR最有效的措施是立即進行作物輪種，這對于具有高百分比輪種玉米的地區(qū)是不適用的。歐洲早就3億歐元的高損害成本和美國的情況(約10億美元損失和應(yīng)用成本)清楚表明本發(fā)明的經(jīng)濟學重要性。西方玉米根蟲(WCR，玉米根葉甲)是一種北美甲蟲，其初始分布表現(xiàn)為在落基山(RockyMountains,Colorado,USA)東邊的山麓小丘內(nèi)。在1909年在科羅拉多州，它第一次被記錄為玉米有害物。然后它緩慢向東蔓延至內(nèi)布拉斯加州(1929)、堪薩斯州(1945)、密蘇里州(1960)和伊利諾斯州(1964)。連續(xù)種植的玉米(即不進行輪種)很大程度上要為WCR在北美的蔓延負責(Metcalf和Metcalf，1993)?，F(xiàn)在從安大略至北卡羅來納州都能找到它，而且遍及美國中部和東部存在，并且正在加拿大蔓延(安大略和魁北克(Meloche等，2001))。WCR在美國蔓延的速率在44和125km/年之間(Onstad等，2003)。在歐洲，于1992年7月在靠近貝爾格萊德(南斯拉夫)的Surcin機場附近在小塊玉米地(0.5ha)上首次觀察到WCR。認為它可能在1990年便已經(jīng)通過來自北美的軍事航空運輸引入(EPP0，1996)。現(xiàn)在，顯而易見的是，WCR已經(jīng)從其在1992年的初始侵襲點蔓延至數(shù)百公里的范圍，影響該地區(qū)的許多國家。例如，WCR在意大利于1998年，而在法國于2002年首次發(fā)現(xiàn)。具有適合于玉米生產(chǎn)的氣候條件的所有歐洲國家和地區(qū)在以后數(shù)年都有可能受到侵襲。在2007年7月，在德國南部首次觀察到WCR(http://www.biosicherheit.de/de/mais/maiswurzelbohrer/330.doku.html)。WCR顯著影響玉米產(chǎn)量、農(nóng)民收入、農(nóng)村社區(qū)的發(fā)展，而且經(jīng)由殺蟲劑應(yīng)用而引起環(huán)境負荷的風險。還有，作為檢疫有害物的WCR影響玉米在歐洲的貿(mào)易。根蟲成蟲在耕地內(nèi)和耕地間以較低高度(小于地平面上5m)爬行或飛行時發(fā)生WCR的短距離移動。此類型的移動造成低速率的蔓延。在新交配的雌性在空中在高于10m傳播時發(fā)生較大的蔓延，均值為每年40km左右。幼蟲的根進食是損害的主要來源，降低營養(yǎng)物攝取和生長(Gavloski等，1992)。幼蟲不能辨別植物物種的根(Krysan和Miller，1986)，并且會以離它們孵出的地方最近的根為食。根損害還削弱植物，并使它們對潮濕或刮風環(huán)境中的倒伏更易感。這能抑制或者甚至阻止作物收獲。成蟲以開花的玉米花粉、穗絲、葉和幼嫩的發(fā)育種粒為食，但也以來自廣泛備選宿主(包括菊科(Asteraceae)、豆科(Fabaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、禾本科(Poaceae)、茄科(Solanaceae)禾口葫蘆科(Cucurbitaceae))的花粉為食。在匈牙利，據(jù)報告幼蟲損害閾值為每株植株20-30條幼蟲。甚至在用殺昆蟲劑諸如特丁硫磷(terbufos)處理的作物中，以7.5%的作物倒伏發(fā)生損害。在考慮谷物產(chǎn)量時，成蟲以每穗多至20條成蟲的密度以玉米粒為食沒有引起顯著的產(chǎn)量降低，而且可以耐受中等水平的穗絲剪斷(Capinera等，1986)。然而，幼蟲對根的進食損害正是最顯著的。在美國和歐洲試驗中都已經(jīng)顯示了殺昆蟲劑DursbanWG(氯吡硫磷(Chlorpyriphos)75%)提供針對WCR成蟲的好的結(jié)果。出于控制目的，推薦每4周應(yīng)用DursbanWG，直至10月。因此，在該季節(jié)后期，在相對較高的玉米作物中可需要特殊的噴霧機器。這是巴黎附近所使用的控制項目中的關(guān)鍵限制，并且還可以通過提高可變成本來降低毛利潤。已經(jīng)在塞爾維亞實施關(guān)于播種前、播種時或生長季節(jié)期間應(yīng)用的土壤處理的殺昆蟲劑功效的試驗。結(jié)論是播種前用特丁硫磷、林旦(lindane)和聯(lián)苯菊酯(bifenthrin)；播種時用特丁硫磷、氯吡硫磷、林旦和聯(lián)苯菊酯；而生長季節(jié)期間用丁硫克百威(carbosulfan)、特丁硫磷和甲拌磷(phorate)獲得最佳結(jié)果。換言之，特丁硫磷一直保持有效。播種時用處理獲得最佳保護(EPP0，1996)，且理想地，土壤殺昆蟲劑應(yīng)持續(xù)6-10周(Levine和Oloumi-Sadeghi，1991)?？捎玫姆N子處理可缺乏足夠的持續(xù)性，例如“Gaucho”種子處理或“Cruiser”(噻蟲嗪(thiamethoxam))的功效可以是距種植3周。在北美的連續(xù)玉米種植和經(jīng)常使用殺昆蟲劑來控制WCR導致上世紀50年代后期形成對氯代烴類的抗性(Metcalf，1976)和新近對其它殺昆蟲劑(包括氨基甲酸酯類和有機磷酸酯類(0P))的抗性。殺昆蟲劑抗性玉米根蟲的問題繼續(xù)存在，并且在美國每年實施耕地試驗來評估備選土壤殺昆蟲劑在WCR控制方面的效率。另外，管理策略現(xiàn)在強調(diào)更加基于IPM的方法，即利用輪種，勘察(scouting)來確定對控制的需要等。在引起玉米損害的昆蟲有害物中，玉米螟蟲的兩種物種在歐洲是特別重要的歐洲玉米螟蟲(ECB，歐洲玉米螟)和地中海玉米螟蟲(Mediterraneancornborer,MCB，粉莖螟(SesamianonagrioidesLefebvre))ECB是歐洲本土的，而且是法國、德國、意大利和西班牙的主要有害物。歐洲玉米螟蟲顯著影響中部歐洲的玉米產(chǎn)量。近年來，它在德國的分布已經(jīng)以每年多至10km向北延伸入較冷氣候區(qū)中(Langenbruch和Scewczyk，1995)。在中部歐洲，ECB在正常情況下每年完成一代(一化)。在較溫暖的地區(qū)，ECB以兩代或更多代(多化)發(fā)生，這取決于地理緯度和區(qū)域性氣候條件。ECB成蟲在6月末出現(xiàn)，并在開花前不久在輪生期后期將其卵產(chǎn)在植物上。第一齡和第二齡幼蟲在進入莖前以葉和花粉為食。幼蟲在莖和穗柄中的掘進引起由于生長下降的產(chǎn)量損失和由于脫落穗的收獲損失。繼發(fā)性感染病原體引起莖腐爛和倒伏(Jarvis等，1984)，阻礙機械收獲。另外，真菌疾病(尤其是鐮孢菌)的較高發(fā)生率經(jīng)由真菌毒素污染而降低飼料質(zhì)量(Lew等1991)。研究已經(jīng)顯示了在歐洲，每株植物一條ECB幼蟲使玉米產(chǎn)量降低6%。ECB幼蟲在具有高度ECB天然發(fā)生的地區(qū)引起多至30%的產(chǎn)量損失，這是由于導致穗發(fā)育差、莖斷裂、和穗脫落的植物中的進食和掘進。大部分產(chǎn)量損失可以歸因于植物產(chǎn)生正常量的谷物的能力受損，這是由于葉和傳導組織中的幼蟲進食損害的生理學效果。在持續(xù)的秋季風和干燥天氣的情況中，在莖和穗柄中的掘進能增加莖和柄斷裂，導致收獲期間穗的實質(zhì)性損失。具有更具剛性的莖和更大的柄的玉米雜種會降低穗損失。此外，假設(shè)ECB損害促成繼發(fā)性霉菌感染諸如鐮孢菌或玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)，其可導致額外的產(chǎn)量損失，而且不利地影響谷粒質(zhì)量。莖腐爛的這種加強與鉆入莖和穗柄中的ECB幼蟲直接相關(guān)。由于來自掘進和莖腐爛的莖削弱引起的損失在延遲玉米收獲時增加。早期收獲會降低由莖腐爛和ECB引起的損失。在許多玉米種植地區(qū)，ECB群體超過經(jīng)濟閾值，因此，農(nóng)民被迫采取控制措施(Rost,1996)。傳統(tǒng)的ECB管理方法是通過碾碎玉米殘留和犁地來破壞用于越冬的掩蔽物。此外，針對ECB的多種殺昆蟲劑(擬除蟲菊酯或有機磷酸酯殺昆蟲劑)及細菌(蘇云金芽孢桿菌，Bt)和生物制劑(赤眼蜂寄生物)控制方法是可用的。然而，玉米植物上的ECB幼蟲難以抗擊，因為在它們鉆入植物中前它們僅在較短的一段時間暴露于噴霧或拮抗劑，因此處理功效是有限的。許多玉米雜種對玉米螟蟲進食具有一些天然抗性。1996年前，被宣傳為“有玉米螟蟲抗性的”所有安大略玉米雜種就是此類型。它們遭受玉米螟蟲攻擊，但是沒有受到大量的產(chǎn)量損失。因此，搜索對ECB有抗性的種質(zhì)對在歐洲的成功育種是至關(guān)重要的。玉米針對ECB第二代的宿主植物抗性在數(shù)量上得到繼承，并且與至少7個基因組區(qū)域有關(guān)(Jennings等，1974)。Bohn等(2001)發(fā)現(xiàn)了關(guān)于隧洞長度的6個數(shù)量性狀基因座(QTL)和關(guān)于莖損害評定的5個QTL，這解釋早熟歐洲玉米種質(zhì)中約50%的基因型變異。此外，雙列研究和世代均值分析確認主要為加性基因作用和較小程度上為顯性和上位相互作用(Jennings等，1974)。得不到用于標記物輔助選擇的分子標記。據(jù)報告，基于次生代謝物羥肟酸(2，4_二羥基-7-甲氧基-1，4_苯并噁嗪-3-酮(DIMB0A)，其屬于苯并噁嗪類)濃度的抗生在玉米和其它谷類中提供對一些昆蟲和真菌疾病的抗性(Niemeyer等，1995HansenL.M.，2004)。因此，它代表了一般天然植物防御的重要部分。對ECB第一代的抗生(葉進食抗性)主要基于次生代謝物DIMB0A[2，4-二羥基-7-甲氧基-(2H)-1，4-苯并噁嗪-3(4H)_酮]在葉中的濃度(Magg，2004)。另外，對ECB第二代的抗生依賴于許多因素，諸如細胞壁中的去污纖維、纖維素、木質(zhì)素、和生源硅的濃度和組織韌性。種子公司現(xiàn)在出售Bt玉米，即生物技術(shù)的第一批切實的成果之一，其對于美國和加拿大玉米農(nóng)民具有實際的應(yīng)用。Bt玉米雜種生成對某些昆蟲(例如蛾、甲蟲、蚋或蚊)特異性的殺昆蟲毒素，其衍生自細菌蘇云金芽孢桿菌，即全球性存在的一種天然存在土壤細菌。這些雜種提供等于，且通常遠大于最佳定時殺昆蟲劑的針對WCR和ECB的保護。在美國和(針對ECB)在歐洲(西班牙約50000公頃)已經(jīng)向農(nóng)民發(fā)放了生成針對ECB和WCR的殺昆蟲性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因玉米。然而，基于單基因的垂直抗性對昆蟲群體施加強烈的選擇壓力。一般而言，垂直抗性受到一種(或者有時少許)主要抗性(R)基因控制，所述主要抗性基因之每一種對應(yīng)于寄生性匹配基因。植物對一種或數(shù)種病原體品種有高度抗性，但是對其它的易感。由于對昆蟲群體有強烈的選擇壓力，對BT有抗性的生物型可以相當快速地形成。Magg等(2001)對用Bt雜種種植的樣地觀察到每株植物0.08至0.19條存活幼蟲和范圍為18至31%的受損莖百分比。作者推斷萬一抗性失效，非轉(zhuǎn)基因宿主植物抗性能起針對靶有害物的第二道屏障的作用。在非適應(yīng)的美國材料中，在長期宿主植物抗性項目中鑒定寬生物型非特異性水平抗性供體材料。在歐洲的數(shù)個位置在高有害物壓力下(WCR在匈牙利而ECB在德國)對未針對歐洲條件適應(yīng)的此供體材料評估抗性。發(fā)明人現(xiàn)在能夠提供數(shù)種對WCR和ECB有抗性的近交系，其在歐洲條件下顯示高水平的抗性。因此，本發(fā)明涉及一種玉蜀黍植物，其對西方玉米根蟲和歐洲玉米螟蟲都有抗性，其中所述植物不表達自蘇云金芽孢桿菌衍生的殺昆蟲性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“玉蜀黍”包含植物物種玉蜀黍和特別是亞種玉蜀黍亞禾中(ZeamaysL.ssp.mays)，包括Amylacea組、Everta組、Indentata組、Indurata組、禾口Saccharata組。在本發(fā)明中，術(shù)語“玉蜀黍”與術(shù)語“玉米”可互換使用，后一種在美國、加拿大、新西蘭和澳大利亞是通俗名稱?！爸参铩笨梢允浅墒熘参锘蛴酌??！俺墒熘参铩睉?yīng)當理解為指幼苗之后的任何發(fā)育階段的植物?！坝酌纭睉?yīng)當理解為指在早期發(fā)育階段中的幼年的、未成熟的植物。術(shù)語“西方玉米根蟲”(WCR)在本發(fā)明的語境中包含物種玉米根葉甲(Diabroticavirgifera,也禾爾作Diabroticavirgiferavirgifera禾口Diabroticavirgifera7(virgifera)LeConte)。術(shù)語“歐洲玉米螟蟲”(ECB)在本發(fā)明的語境中包含物種歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis，也禾爾作OstrinianubilalisHiibner)。術(shù)語“有抗性的”或“抗性”指對傳染原或病原體的入侵或繁殖，或者對由其毒性產(chǎn)物或任何其它損害因子造成的損害插入屏障的植物機制的總和。因此，植物完全或某種程度上(參看下文)排除或克服傳染原、損害因子、病原體或毒性產(chǎn)物的有害效果。通常，認為抗性源自于遺傳突變。通過對植物遺傳特征搜索認為賦予較低易感性的突變而檢測到的抗性稱作“基因型抗性”。通過在存在病原體的情況中成功培養(yǎng)植物培養(yǎng)物找到的抗性稱作“表型抗性”。一旦檢測出表型抗性，可以通過遺傳手段來進一步分析或證實植物，并可以檢測相應(yīng)的基因型抗性。在本案中，例如可以通過生成導致幼蟲死亡的毒性劑或生成抑制幼蟲在根上進食的驅(qū)蟲劑來介導抗性。與術(shù)語“抗性”形成對比，術(shù)語“耐受”或“耐受性”指植物經(jīng)歷暴露于不利環(huán)境條件，如潛在有害的病原體或由其毒性產(chǎn)物引起的損害而不顯示一種或多種實質(zhì)性不利的效果(例如沒有死亡或遭受嚴重的損害或作物損失)的能力。耐受性在調(diào)節(jié)或適應(yīng)機制中出現(xiàn)。這意味著例如植物受到病原體侵襲，但是它通過提高的生長或代謝(特別在侵襲位置處)來補償所述侵襲及其后果。對WCR和/或ECB有耐受性且受到WCR和/或ECB幼蟲侵襲的玉蜀黍植物可以例如用根生長提高來響應(yīng)根損害。然而，在耐受性的這種情況中根上的活幼蟲數(shù)目沒有減少，與上文所描述的抗性機制形成對比。例如，非抗性商品化玉米雜種"Zamora"顯示對ECB的耐受性，但沒有抗性(參見http://www.saatenunion.con/index.cfm/nav/375/article/2664/product/ZAM0RA.html)。Zamora在西班牙以登記號980481登記。在本案中，可以通過例如稱作“倒伏評定量表”的因素來測定對WCR和/或ECB的抗性?！暗狗倍x為莖作物自其垂直位置永久偏移的狀態(tài)。它是莖由于例如植物根上的幼蟲侵襲而不能支持植物重量的結(jié)果。通常按1至9的量表評定倒伏。得分“1”指直立的植物，得分“5”指相對于地面以45度角傾斜的植物，而得分“9”指植物躺在地面上。下表(表1)代表三項參數(shù)“倒伏評定量表”、“倒伏角[度]”與“抗性]”之間的關(guān)系當然，可以依照上文所限定的關(guān)系來計算任何“中間”倒伏度或抗性百分比。例如，以4.5度的倒伏角代表95%抗性，以9度的倒伏角代表90%抗性等。為了確定植物是否對WCR和ECB都有抗性，在具有WCR侵襲的第一耕地、區(qū)域或樣地中和在具有ECB侵襲的第二耕地、區(qū)域或樣地中種植植物，并對兩塊耕地、區(qū)域或樣地確定倒伏評定。實施例中描述了可能的實驗設(shè)置，但是技術(shù)人員可以應(yīng)用樣地尺寸、繁殖數(shù)目等的變化形式。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的玉蜀黍植物的WCR/ECB抗性是至少約50%、55%、或60%，更優(yōu)選至少約62.5%、65%或70%，特別優(yōu)選至少約75%、80%或85%，特別優(yōu)選至少約87.5%、90%或95%，并且最優(yōu)選約100%，如通過倒伏評定量表所確定的。依照本發(fā)明的植物不表達自蘇云金芽孢桿菌衍生的殺昆蟲性蛋白質(zhì)。術(shù)語“表達”指基因產(chǎn)物的生物合成。例如，在結(jié)構(gòu)基因的情況中，表達牽涉結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA，和mRNA隨后翻譯成一種或多種多肽或蛋白質(zhì)。此外，“表達”可以包括轉(zhuǎn)錄后過程(如mRNA剪接)和翻譯后修飾(如糖基化)以及表達產(chǎn)物靶向入細胞區(qū)室中或細胞外部。如本文中所使用的，術(shù)語“氨基酸序列”指代表氨基酸殘基的縮寫、字母、字符或詞的列表。氨基酸在本文中可以通過其通常已知的三字母符號或者通過獲得IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號來提及。術(shù)語“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因產(chǎn)物”、“表達產(chǎn)物”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指連續(xù)氨基酸殘基的寡聚物或多聚物。術(shù)語“殺昆蟲性”或“殺昆蟲劑”指針對處于所有發(fā)育形式的昆蟲施加活性的物質(zhì)。它們包括針對昆蟲卵和幼蟲使用的殺卵劑和殺幼蟲劑及針對成年昆蟲使用的殺成蟲劑。殺昆蟲性物質(zhì)可以具有專門針對昆蟲或者另外還針對其它動物、植物或病原體的活性。開發(fā)“生物學殺昆蟲劑”的一個例子是使用蘇云金芽孢桿菌，即影響鱗翅目(L印idoptera)(蛾和蝴蝶)和一些其它昆蟲的一種細菌。蘇云金芽孢桿菌是革蘭氏陽性、土壤居住的芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌。孢子形成時，蘇云金芽孢桿菌形成由cry基因編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)的殺昆蟲性S-內(nèi)毒素(Cry毒素)的晶體。Cry毒素具有針對鱗翅目(蛾和蝴蝶)、雙翅目(Diptera)(蠅和蚊)和鞘翅目(Coleoptera)(甲蟲)物種的特異性活性。如此，蘇云金芽孢桿菌起Cry毒素和cry基因的貯存器的作用，用于產(chǎn)生生物學殺昆蟲劑和昆蟲抗性的經(jīng)遺傳修飾作物?？梢越?jīng)由遺傳工程的使用來將一種來自蘇云金芽孢桿菌的毒素(Bt毒素)直接摻入植物中。Bt毒素的一項重要的缺點在于昆蟲在Bt毒素存在于全植物中時快速形成抗性。另一項缺點在于Bt基因的表達可以有所變化。例如，若溫度不是理想的，則此壓力可以降低毒素生成，并使植物更易感。更重要的是，毒素的晚季表達降低已經(jīng)有記錄，可能源自于啟動子的甲基化。由于不斷暴露于毒素，所以為抗性有害物產(chǎn)生進化選擇壓力。早已知道小菜蛾(Diamondbackmoth)已經(jīng)演化出對Bt的抗性。還有一種假設(shè)的風險，即例如轉(zhuǎn)基因玉米會與野生草變體雜交，而Bt基因會在天然環(huán)境中結(jié)束，保留其毒性。最后，直到現(xiàn)在全世界的bt棉花開發(fā)人員也不知道主要耕地中bt棉花植物突然死亡的原因。在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的玉蜀黍植物不表達自細菌衍生的殺昆蟲性蛋白質(zhì)?！凹毦敝冈藛渭毎⑸铩＜毦ǔｉL幾微米(0.5至5左右)，并且具有許多形狀。大多數(shù)細菌物種是球形的(稱作球菌)或桿狀的(稱作桿菌)。稱作弧菌的一些桿狀細菌是略微彎曲的或逗點狀的；其它的可以是螺旋形的(稱作螺旋菌)或緊密卷曲的(稱作螺旋體)。少數(shù)物種甚至具有四面體或立方體形狀。此極其多種形狀是由細菌細胞壁和細胞骨架決定的。許多細菌物種僅以單細胞存在，其它的以特征性樣式聯(lián)合奈瑟氏球菌(Neisseria)形成二倍體(成對)，鏈球菌(Streptococcus)形成鏈，而葡萄球菌(Staphylococcus)以“成串葡萄”簇聚集在一起。細菌也可以是細長的以形成細絲，例如放線細菌(Actinobacteria)。絲狀細菌通常圍繞有鞘(sheath)，其含有許多細胞個體；某些類型(諸如諾卡氏菌屬(Nocardia)物種)甚至形成復雜的、分枝的細絲，其在外形上類似于真菌菌絲體。細菌門包含放線細菌屬(Actinobacteria)、產(chǎn)水菌門(Aquificae)、衣原體門(Chlamydiae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)/綠菌門(Chlorobi)、綠彎菌門(Chloroflexi)、產(chǎn)金菌門(Chrysiogenetes)、藍藻|、二(Cyanobacteria)、月兌鐵桿菌門(Deferribacteres)>異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、網(wǎng)團菌門(Dictyoglomi)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)/酸桿菌(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、粘膠球形菌門(Lentisphaerae)、硝it^MMH(Nitrospirae)(Planctomycetes)>n(Proteobacteria)>螺旋體門(Spirochaetes)、熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria)、熱微菌門(Thermomicrobia)、熱袍菌門(Thermotogae)禾口撫微菌門(Verrucomicrobia)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的玉蜀黍植物不表達轉(zhuǎn)基因殺昆蟲性蛋白質(zhì)。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”(或“重組”)指人為操作的多核苷酸或人為操作的多核苷酸的拷貝或互補物。例如，包含與第二多核苷酸可操作連接的啟動子的轉(zhuǎn)基因表達盒可以包括與第二多核苷酸異源的啟動子，這是由于為人操作(例如通過記載于Sambrook等，MolecularCloning-ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，NewYork，(1989)或CurrentProtocolsinMolecularBiology卷1-3，JohnWiley&Sons,Inc.(1994-1998)的方法)構(gòu)成表達盒的分離的核酸實現(xiàn)的。在另一個例子中，重組表達盒可以包含以如下方式組合的多核苷酸，所述方式的所述多核苷酸極不可能在自然界中找到。例如，人為操作的限制性位點或質(zhì)粒載體序列可以在第二多核苷酸側(cè)翼或者分開啟動子與第二多核苷酸。熟練技術(shù)人員應(yīng)當認可的是，多核苷酸可以以多種方式操作，并且不限于如本文中所描述的例子。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”或“重組”在提及細胞使用時指含有轉(zhuǎn)基因的細胞，或者已經(jīng)通過導入轉(zhuǎn)基因來改變其基因組的細胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”在提及組織或植物使用時分別指包含一個或多個包含轉(zhuǎn)基因或者已經(jīng)通過導入轉(zhuǎn)基因來改變其基因組的細胞的組織或植物?？梢酝ㄟ^數(shù)種方法來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞、組織和植物，包括通過人為干預的方式(諸如通過技術(shù)人員公知的方法)將包含核酸(通常為DNA)的“轉(zhuǎn)基因”導入靶細胞中或者將轉(zhuǎn)基因整合入靶細胞的染色體中。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”或“重組”在提及蛋白質(zhì)使用時指由轉(zhuǎn)基因多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，玉蜀黍植物不表達轉(zhuǎn)基因滅害性(pesticidal)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的范圍中，術(shù)語“滅害性”蛋白質(zhì)指意圖用于預防、破壞、驅(qū)除任何有害物或者減輕任何有害物的損害的任何蛋白質(zhì)。滅害性蛋白質(zhì)可以有針對有害物的活性，所述有害物包括昆蟲、植物病原體、雜草、軟體動物、鳥類、哺乳動物(如嚙齒類)、魚、線蟲和微生物(病毒、細菌、真菌)，它們與人競爭食物，破壞特性，傳播疾病或者是疾病的載體或者是令人討厭的。滅害性蛋白質(zhì)或“滅害劑”可以例如是殺細菌劑、殺真菌劑(用于控制真菌和卵菌)、除草劑(例如用于控制雜草)、殺昆蟲劑(例如殺卵劑、殺幼蟲劑或殺成蟲劑)、殺螨劑、殺軟體動物劑(例如用于控制蛞蝓和蝸牛)、殺線蟲劑、殺嚙齒類劑或殺病毒劑。“轉(zhuǎn)基因滅害性蛋白質(zhì)”指由如上文所定義的轉(zhuǎn)基因編碼且展現(xiàn)出如上文所定義的滅害作用的蛋白質(zhì)，如上文所定義的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的玉蜀黍植物與Zamora玉米相比對WCR的易感性低至少約2倍，更優(yōu)選至少約2.5或3倍，特別優(yōu)選至少約3.5或4倍，特別優(yōu)選至少4.5或5倍，且最優(yōu)選至少約5.5或6或7.5或10倍。還有，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述玉蜀黍植物與Zamora玉米相比對ECB的易感性低至少約2倍，更優(yōu)選至少約2.5或3倍，特別優(yōu)選至少約3.5或4倍，特別優(yōu)選至少4.5或5倍，且最優(yōu)選至少約5.5或6或7.5或10倍。術(shù)語“易感的”或“易感性”對應(yīng)于植物不能抵抗傳染原或病原體的侵入或繁殖，或者由其毒性產(chǎn)物或任何其它損害性因子引起的損害。由于易感性，植物完全或在某種程度上容易受到傳染原、損害性因子、病原體或毒性產(chǎn)物的有害效果影響或者對傳染原、損害性因子、病原體或毒性產(chǎn)物的有害效果敏感。換言之，易感性水平升高對應(yīng)于植物關(guān)于給定病原體或有害物的抗性水平降低，且反之亦然，即易感性水平降低對應(yīng)于抗性水平升高?？梢猿鲇诒景l(fā)明的目的作為參照植物使用的另一種非抗性商品化玉米雜種是“Astor”，其是非抗性商業(yè)注冊的玉米雜種(可購自SildwestsaatGbR，Rastatt，德國，還可參見因特網(wǎng)頁面http://www.saaten-union.de,或者更具體的是http//www.saaten-union,de/index.cfm/portal/l/nav/325/article/1726/page/printl.html)。Astor在法國以名稱“Anjou249”和注冊號CTPS1007587注冊。當然，任何其它非抗性玉米植物可以充當本發(fā)明的參照植物，諸如實施例中所描述的非抗性植物?？梢猿洚攨⒄盏钠渌线m的玉米系是玉米系R6080和玉米系R1437，由此R6080是關(guān)于ECB易感性的有用參照，而R1437是關(guān)于WCR易感性的有用參照。這兩種品系均可購自SiidwestsaatGbR(Rastatt，德國)。R6080還在共同體植物品種局(CommunityPlantVarietyOffice)注冊(授權(quán)號R16016)。在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的玉蜀黍植物與玉米系R1437相比對WCR11的易感性低至少約2倍，更優(yōu)選至少約2.5或3倍，特別優(yōu)選至少約3.5或4倍，特別優(yōu)選至少4.5或5倍，且最優(yōu)選至少約5.5或6或7.5或10倍。還有，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述玉蜀黍植物與玉米系R6080相比對ECB的易感性低至少約2倍，更優(yōu)選至少約2.5或3倍，特別優(yōu)選至少約3.5或4倍，特別優(yōu)選至少4.5或5倍，且最優(yōu)選至少約5.5或6或7.5或10倍。發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的玉蜀黍植物比現(xiàn)有技術(shù)的WCR抗性植物，例如NGSDCRWl(S2)C4-15-252(Kahler等(1985)CropScience25:202)更具對WCR的抗性，所述NGSDCRW1(S2)C4-15-252稱作“黃金標準”，因為所有新抗性資源均與此標準檢查近交系進行比較(Bohn(2007)ZeitschriftMais34(2):40_43)。本發(fā)明的植物與NGSDCRW1(S2)C4-15-252相比對WCR的抗性高至少10%，優(yōu)選至少15%，更優(yōu)選至少20%，甚至更優(yōu)選至少25%，且最優(yōu)選至少30%。適合于測定與非抗性參照植物(如“Zam0ra”、“ASt0r”、R1437或R6080)相比玉米植物對WCR和/或ECB的抗性的一項因素是植物根上的活幼蟲數(shù)目，其中“活幼蟲”指那些能夠發(fā)育成甲蟲的幼蟲。在合適的實驗設(shè)置中，必須在相同環(huán)境條件(位置、耕地大小、穩(wěn)定、濕度、初始有害物侵襲等)下種植依照本發(fā)明的植物和參照植物，最合適的是在兩塊相鄰的耕地中。在實施例中描述了合適的測試安排，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以制定可能的偏差。若植物與參照植物相比對WCR或ECB的易感性低至少約2倍，則根上分別會有少至少約2倍的WCR或ECB幼蟲。例如，非抗性參照植物的根上可以有30條WCR或ECB幼蟲的數(shù)目，而依照本發(fā)明的植物的根上可以有15條WCR或ECB幼蟲的最大數(shù)目。當然，出于統(tǒng)計學原因，應(yīng)當分析增加數(shù)目的玉米植物和玉米參照植物，例如5、10、20、50或100株植物。應(yīng)當理解的是，幼蟲對根的進食損害的程度也是合適的抗性指標。為了對由WCR幼蟲引起的損害評分，通常使用I0WA量表。有兩種不同的可用量表，一種范圍為1至6(“舊”I0WA量表，Hills和Peters(1971)J.Econ.Entomol.64(3):764_765)，而一種范圍為1至3(“新”I0WA量表，Oleson等(2005)J.Econ.Entomol.98(1)1-8)，它們都適合于分析本發(fā)明的植物。優(yōu)選地，使用“新”I0WA量表，因為數(shù)值量表與根損傷量之間的關(guān)系是線性的，并且容許抗性和易感性植物之間更好的區(qū)別。為了依照I0WA量表確定對根系統(tǒng)的損害，在多年來WCR頻繁出現(xiàn)的區(qū)域中種植植物。掘出玉蜀黍植物的根系統(tǒng)，并從根除去盡可能多的土壤。在清洗根以使得所有冠根均相當干凈后，對損害評分，其中依照新I0WA量表的0數(shù)值意味著沒有發(fā)生對根的可見損害或者根僅顯示少許傷痕。根據(jù)新Iowa量表的3數(shù)值意味著根上超過一節(jié)受到完全破壞。關(guān)于損害評分的更多信息可以獲自O(shè)leson等(2005)J.Econ.Entomol.98(1)1-8，通過提及而將其收入本文。本發(fā)明植物的I0WA根得分在0.2和1.2之間，優(yōu)選在0.5和1.2之間，更優(yōu)選在0.7和1.2之間，且最優(yōu)選在0.9至1.2之間。WCR抗性的另一項指標是幼蟲回收，其指明植物根上的幼蟲數(shù)目。如下收集幼蟲，即將全部的根團放置在細篩孔聚乙烯袋中，并在溫室中將它們懸掛在水盤上方。幼蟲會落入水盆中，并可以在95%乙醇中貯存。方法也記載于Hibbard等(2004)J.Econ.Entomol.97(3):871_882，通過提及而將其收入本文。可以如下提取溫室幼蟲，即在垃圾或土壤樣品中使用產(chǎn)生約14°C的溫度梯度的Tullgren漏斗，刺激土壤節(jié)肢動物向下移入收集容器中。與易感性玉蜀黍植物諸如B37xH84、CRW3(S1)C6和CRW2(C5)(它們均由BruceHibbard，USDA-ARS，205CurtisHall,UniversityofMissouri，Columbia，M0，USA開發(fā))相比幼蟲回收降低至少20%，優(yōu)選至少25%或30%，更優(yōu)選35%至40%，甚至更優(yōu)選45%至50%，且最優(yōu)選55%或60%。術(shù)語“根”指植物的地下器官或成分。根可以具有數(shù)種功能和特征它通過將植物錨定至土壤來提供支持，它自土壤吸收和引導水和營養(yǎng)物諸如礦物，并且它可以貯存食物和廢物。在支持和貯存外，根在許多情況中還能夠與微生物互惠聯(lián)合和次生生長。通常，根缺乏節(jié)、枝條和葉。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的玉米植物在對WCR和ECB的抗性外還對秋季粘蟲(FallArmyworm)和/或小地老虎(BlackCutworm)有抗性?！扒锛菊诚x”(草地夜蛾(Spodopterafrugiperda))可以是玉米中更難以控制的昆蟲有害物之一。秋季粘蟲引起嚴重的葉進食損害以及對穗的直接損傷。雖然秋季粘蟲能在幾乎所有發(fā)育階段中損害玉米植物，但是它會在尚未抽穗絲的后期種植上聚集。與歐洲玉米螟蟲一樣，秋季粘蟲受到最有效的控制，雖然幼蟲是小的。早期檢測和殺昆蟲劑應(yīng)用的適當時機是至關(guān)重要的。“小地老虎”(小地老虎(Agrotisipsilon))是可以在許多地區(qū)找到的分布廣泛的物種。侵襲的威脅在免耕(no-till)或多雜草的玉米耕地中，特別在排水不良的區(qū)域中表現(xiàn)為最大。小地老虎以廣泛的耕地和園藝作物為食。玉米和煙草是其優(yōu)選作物的兩種。其它已知的宿主包括蘆筍(asparagus)、豆(bean)、甜菜(beet)、甘藍/卷心菜(cabbage)、蓖麻(castorbean)、棉(cotton)、葡萄(grape)、萵苣(lettuce)、花生(peanut)、古月W.(pepper),(potato)、蘿卜(radish)、菜(spinach)、南瓜(squash)、草#(strawberry)和番茄(tomato)。小地老虎是所有地老虎中最具破壞性的之一。幼蟲自土壤線附近的根切斷植物；通常沒有其它進食損害存在。許多幼蟲連續(xù)幾夜在植物間移動，而一些保持以切割的植物的根和地下莖為食。在另一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的玉蜀黍植物的種子以編號NCIMB41472、NCIMB41473和NCIMB41474保藏于“國立工業(yè)食品與海洋細菌菌種保藏中心，，(NationalCollectionsofIndustrialFoodandMarineBacteria,NCIMB,Aberdeen,UK)(初始保藏日期2007年2月27日)。各系名稱是AT0039,R4535和R7222(參見實施例)。“種子”指受精發(fā)生后發(fā)育的器官，即成熟的胚珠。它由胚、營養(yǎng)材料(胚乳)、和保護層組成。本發(fā)明還涉及依照本發(fā)明的玉蜀黍植物的雜種。術(shù)語“雜種”在本語境中指源自于兩種遺傳方面不同的親本植物(在一種或多種基因中有所不同)之間的雜交的后代個體；特別是通過對不同群體、品種、品系、物種、栽培種、基因型或?qū)伲话悴皇遣煌频闹参镞M行育種所產(chǎn)生的后代。在本語境中，“雜種”指源自于雜交的后代，其中至少一株親本植物是依照本發(fā)明的玉蜀黍植物。優(yōu)選地，兩株親本植物都是依照本發(fā)明的玉蜀黍植物，然而它們遺傳方面是不同的，如上文所解釋的。例如，雜種Suml351衍生自僅一株抗性親本植物(R7240xAJ1494)，而Sum1352衍生自都有抗性的兩株親本植物(R7222xAJ1499)，參見圖6。在植物育種中，通常產(chǎn)生和選擇雜種，因為它們具有親本個體或群體中沒有找到或者不一致存在的想要特性。各群體或各品種之間的這種遺傳材料重排也稱作雜交。因為植物無需大量工作便頻繁雜交，所以它們通常人為產(chǎn)生以便產(chǎn)生改良的植物。這些改良可以包括為消費產(chǎn)生更多或更好的種子、果實或其它植物部分，或者使植物更加耐寒或耐熱?，F(xiàn)在用雜種完成了大量的工作以為農(nóng)業(yè)和園藝作物產(chǎn)生更具疾病抗性的植物。在許多組植物中，已經(jīng)使用雜交來產(chǎn)生更大且更艷麗的花和新的花色。許多植物屬和種在多態(tài)性方面具有其起源，四倍體在許多不同組植物中是常見的，并且這些植物隨著時間能分化成與正常二倍體系不同的物種。四倍體能形成二倍體群體內(nèi)的育種群體，并且在與二倍體群體形成雜種時，所得的后代趨于是不育的三倍體，如此有效地終止兩組植物間的基因混合(除非在罕見的情況中，二倍體產(chǎn)生未減少的配子)。許多雜種是人為產(chǎn)生的，但是也存在天然雜種。特別地，植物雜種通常比任一親本品種更強壯，即存在時被稱為雜種活力(雜種優(yōu)勢)或雜合子優(yōu)勢的一種現(xiàn)象。植物育種人員利用許多技術(shù)來產(chǎn)生雜種。本發(fā)明還涉及依照本發(fā)明的玉蜀黍植物的后代或依照本發(fā)明的玉蜀黍植物的雜種的后代。另外，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明的玉蜀黍植物的種子，依照本發(fā)明的玉蜀黍植物的后代的種子及依照本發(fā)明的玉蜀黍植物的雜種的種子。術(shù)語“后代”在本語境中定義為繁殖(有性或無性)或復制的產(chǎn)物。它包括可以在繁殖或生殖(有性或無性)中使用的克隆、果實、幼苗、自交后代，及這些之任一項的任何繁殖體諸如切割物等。術(shù)語“后代”還涵蓋的是作為有性或無性生殖后代的植物，此類植物的克隆或后代，或所述植物、后代、克隆或后代的任何部分或繁殖體。在“全”植物或“成熟”植物外，本發(fā)明還包含自植物衍生的后代、繁殖材料(諸如葉、根、幼苗、果實、花粉、枝條等)、部分(器官、枝條營養(yǎng)結(jié)構(gòu)(例如葉、莖和塊莖)、根、花、切割物、和花器官/結(jié)構(gòu)，例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花藥和胚珠)、組織(例如維管組織、基本組織、等)、細胞(例如保衛(wèi)細胞、卵細胞、毛狀體等)、細胞培養(yǎng)物、和收獲的材料。如本文中所使用的，術(shù)語“細胞”或“植物細胞”指單細胞或細胞群體。群體可以是包含一種細胞類型的純?nèi)后w。同樣地，群體可以包含超過一種細胞類型。在本發(fā)明中，對細胞群體可以包含的細胞類型的數(shù)目沒有限制。細胞可以是同步的或不是同步的。本發(fā)明意義內(nèi)的植物細胞可以是分離的(例如在懸浮培養(yǎng)中)或者包含在處于任何發(fā)育階段的植物、植物器官或植物組織中。關(guān)于植物的術(shù)語“組織”(或“植物組織”)指多種植物細胞的安排，包括分化的和未分化的植物組織。植物組織可以構(gòu)成植物器官的部分(例如植物葉的表皮)，但是也可以構(gòu)成腫瘤組織(例如胼胝體組織)和培養(yǎng)中的各種細胞類型(例如單細胞、原生質(zhì)體、胚、胼胝體、原球莖樣體等)。植物組織可以在植物中、在器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、或細胞培養(yǎng)中。本發(fā)明的另一個目的包括使用雙單倍體技術(shù)來開發(fā)適應(yīng)的抗性材料和開發(fā)各種分子標志，以便便于有效的基于標志物的選擇規(guī)程。例如，通過組合單基因Bt抗性和定量繼承的對ECB的抗性的不同來源，可以有可能通過在一種基因型中逐步增加潛在基因來開發(fā)具有多種抗性的雜種(Magg，2004)。為了阻止昆蟲抗性的失效，可以僅使用轉(zhuǎn)基因玉米作為IPM方案中的一個成分(Schulz等，1997)。因此，有效的抗性管理系統(tǒng)對于預防ECB對Bt毒素的抗性是至關(guān)重要的。IPM是通過以使經(jīng)濟、健康、和環(huán)境風險最小化的方式組合生物學、栽培、物理、和化學工具來管理有害物的可持續(xù)方法。可以經(jīng)由利用批準的有害物勘察技術(shù)和通過執(zhí)行經(jīng)濟閾值做出有害物管理決定來使經(jīng)濟風險最小化。可以通過遵循滅害劑標簽上提供的所有安全指導來使健康風險最小化。通過在有可能時避免滅害劑使用和通過在必須使用滅害劑時遵循滅害劑標簽上提供的所有環(huán)境或野生生物安全準則來使環(huán)境風險最小化。已經(jīng)構(gòu)建了提供高遺傳分辨率的玉米基因組連鎖圖譜。已經(jīng)將SSR(簡單序列重復)指派給玉米的不同染色體，出于數(shù)種原因，SSR對于基因作圖是非常有用的標記物系統(tǒng)(Bohn等，2001)?？梢杂行У嘏c例如分組分離子分析(BulkedSegregantAnalysis)組合使用作圖標志物(如容易操作的SSR)(Michelmore等，1991)，以便鑒定單一抗性基因(例如Werner等，2000)。并且它們可以作為錨用于為作為QTL分析基礎(chǔ)的各次雜交快速構(gòu)建遺傳圖譜(例如Scheurer等，2001)。遺傳作圖的目的是鑒定與影響數(shù)量性狀的遺傳因素(數(shù)量性狀基因座或QTL，那些是與特定性狀有關(guān)的DNA區(qū)域；它們在許多情況中通過組合基因來提供等位變異)緊密接近的簡單繼承標志物。此定位依賴于產(chǎn)生標志物與QTL等位基因間統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)的方法和選擇性減少該關(guān)聯(lián)(作為標志物與QTL的距離的函數(shù))的方法。在使用近交親本間的雜交來定位QTL時，在F1雜種中產(chǎn)生所有標志物與自同一親本衍生的QTL等位基因間的全部關(guān)聯(lián)。產(chǎn)生雙單倍體(DH)、F2或重組近交系的減數(shù)分裂中的重組減少給定的QTL與遠離其的標志物間的關(guān)聯(lián)。一種備選方法是“關(guān)聯(lián)作圖”，其利用相對較久以前產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的事件。已經(jīng)在人類遺傳學中大量且有效地使用用于檢測QTL的基于關(guān)聯(lián)的方法，然而在大多數(shù)植物(除喬木外)中，基于分離的QTL作圖方法是主要的。但是，關(guān)聯(lián)研究對于基于植物群體中的連鎖不平衡(LD)作圖來分析數(shù)量性狀變得越來越重要(Flint-Garcia等2003)。雖然基于分離的方法在分離群體中直接觀察標志物基因座和靶基因的共繼承，但是在基于關(guān)聯(lián)的方法中分析個體品系的較大群體，以便揭示標志物樣式和性狀表達之間的關(guān)聯(lián)。在針對WCR和ECB的抗性方面可以使用非適應(yīng)的近交系作為供體來開發(fā)適應(yīng)的雙單倍體群體。雙單倍體群體具有如下優(yōu)點，即由于其特殊的遺傳構(gòu)成，與常規(guī)衍生的S2或S3近交系群體相比預期QTL作圖分析的能力更高。另外，由于非分離雙單倍體系的繼承性更高，耕地抗性篩選是更精確的?？梢砸勒铡癐owa列表”(其對根損害進行評分)來對WCR損害進行評分(Oleson等，2005)。對得分的評估是費時的，因此可以應(yīng)用有效的評分方法NIRS技術(shù)、分析別的抗性因素，如可消化性(木質(zhì)素濃度/組成)，出于育種研究目的應(yīng)用分子標志、微衛(wèi)星(SSR)、SNP、STS和ISSR標志物等。本方法用來通過鑒定新的昆蟲抗性基因來提高農(nóng)業(yè)中的生物多樣性，將天然宿主植物抗性改良為在經(jīng)濟學和生態(tài)學方面有希望的用于控制WCR和ECB侵襲的手段，開發(fā)適應(yīng)的抗性良種近交系，其可以用于分析和了解針對WCR/ECB的抗性機制以進行高產(chǎn)量雜種開發(fā)，開發(fā)用于WCR損害的有效評分方法，鑒定緊密連鎖的如下分子標志，其便于有效組合對WCR/ECB的抗性與卓越的農(nóng)藝學性能，及開發(fā)可以作為成分用于高產(chǎn)量抗性雜種的適應(yīng)的良種近交系。用與標志物輔助育種組合的雙單倍體技術(shù)分析對WCR和ECB的宿主植物抗性的遺傳學需要經(jīng)典的育種技術(shù)、耕地測試、分子植物育種技術(shù)應(yīng)用和用于抗性和易感性的有效篩選系統(tǒng)的專業(yè)知識。DH系的開發(fā)和在耕地試驗中對它們測試WCR/ECB抗性得到化學分析和病毒抗性基因作圖支持。具有高的天然ECB壓力的位置容許在天然有害物壓力下的有效大規(guī)模材料篩選項目。使用經(jīng)天然WCR侵襲的耕地來篩選非適應(yīng)的和開發(fā)的適應(yīng)的良種育種群體。現(xiàn)今，WCR抗性的遺傳學和機制是未知的，并且僅有限的關(guān)于ECB抗性的信息是可用的。通過本方法，可以避免或限制未來的WCR和ECB蔓延，并且與分子標志一起的抗性玉米登記(accession)可以充當用于抗性適應(yīng)良種育種群體的有效育種的基礎(chǔ)。改良玉米的天然宿主植物抗性對于整個農(nóng)業(yè)界而言具有創(chuàng)新的影響。它為歐洲提供了用于有害物綜合治理系統(tǒng)的一種經(jīng)濟學和生態(tài)學工具，為歐洲農(nóng)民降低了產(chǎn)量損失的風險。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了對西方玉米根蟲和歐洲玉米螟蟲都有抗性的玉蜀黍植物，其中針對西方玉米根蟲的抗性是通過分子標志手段確定的，且其中所述植物不表達自蘇云金芽孢桿菌衍生的殺昆蟲性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了對西方玉米根蟲和歐洲玉米螟蟲都有抗性的玉蜀黍植物，其中針對歐洲玉米螟蟲的抗性是通過分子標志手段確定的，且其中所述植物不表達自蘇云金芽孢桿菌衍生的殺昆蟲性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供了對西方玉米根蟲和歐洲玉米螟蟲都有抗性的玉蜀黍植物，其中針對西方玉米根蟲和歐洲玉米螟蟲的抗性都是通過分子標志手段確定的，且其中所述植物不表達自蘇云金芽孢桿菌衍生的殺昆蟲性蛋白質(zhì)。技術(shù)人員知道的是，有可能組合分子標志用于測定對西方玉米根蟲和歐洲玉米螟蟲兩者的抗性的用途與用于測定抗性的其它方法(例如本文中所描述的倒伏評定量表)。用于檢測QTL并與分離群體中直接觀察到的基于分離的方法比較以便揭示SSR標志物樣式與性狀表達間的關(guān)聯(lián)的方法為整個農(nóng)業(yè)界提供了高度創(chuàng)新。(TheapproachforthedetectionofQTLsandthecomparisontothesegregation-basedapproachdirectlyobservedinasegregatingpopulationinordertorevealassociationsbetweenSSRmarkerpatternsandtraitexpressionsoffersahighdegreeofinnovationforthewholeagriculturalcommunity.)胃禾中iB^MJIi^j^1]的可能性。有效篩選方法和工具的開發(fā)使發(fā)明人能夠開發(fā)更有效且更快速的抗性雜種，并向市場供應(yīng)非GM0抗性雜種。特別在公眾對GM0產(chǎn)品接受度低的國家，宿主植物抗性幫助農(nóng)民保護產(chǎn)量。另一方面，與GM0抗性組合的宿主植物抗性有助于降低抗性失效的風險。通過此方法，可以避免未來的WCR和ECB蔓延，并且與分子標志一起的抗性/耐受性玉米登記可以充當用于抗性適應(yīng)良種育種群體的創(chuàng)新且有效的育種的基礎(chǔ)。本發(fā)明的一項益處是，一方面，新開發(fā)的且充分表征的植物材料(如適應(yīng)的WCR和ECB抗性近交系和雜種)，和另一方面，關(guān)于連鎖分子標志(其使得能夠通過標志物輔助育種來有效開發(fā)新的抗性近交系和雜種)的知識。“分子標志”在本發(fā)明的意義內(nèi)指就是其核苷酸序列在不同生物體(例如抗性和易感性植物)間有所不同，并且因此可用于區(qū)分這些生物體的特定DNA區(qū)段?？梢允褂眠m應(yīng)的抗性良種近交系來分析和了解針對WCR和ECB的抗性機制以進行未來的高產(chǎn)量雜種開發(fā)?？梢越M合用于評估預篩選的供體材料的廣泛耕地試驗與易于操作的評分系統(tǒng)的建立?；阼b定的非適應(yīng)抗性供體材料，可以產(chǎn)生至少兩種雙單倍體作圖群體，其可以用于抗性的遺傳分析和連鎖分子標志的鑒定。為了鑒定主要抗性基因，組合使用SSR與分組分離子分析。1.對ECB/WCR有杭件的i舌應(yīng)_種育種群體的開發(fā)在德國在誘導隔離群中誘導群體1(P0P1)。將經(jīng)誘導的種子運往冬季苗圃(智利)以進行單倍體選擇和DO繁殖(染色體加倍、成功加倍植物的自交)。在同一時間段中，實施群體2(P0P2)的初始雜交，因此隨后進行誘導雜交。P0P1的世代D1會是可獲得的，并且會準備好世代D1中P0P2的種子。另外，使用有效篩選方法的開發(fā)來在適應(yīng)的和非適應(yīng)的良種育種中篩選抗性。2.在耕地條件下評估作圖群體P0P1和P0P2在天然昆蟲壓力下在重復耕地觀察中評估作圖POP1和P0P2的近交系(位置=4，重復=3)。因此，對WCR侵襲的耕地評估幼蟲污染/分布(卵計數(shù)/kg土壤)以確保對調(diào)查材料的同質(zhì)昆蟲壓力。依照“Iowa量表”對WCR損害評分，所述Iowa量表對根損害評分(Oleson等，2005)。為了評估ECB癥狀，選擇具有高風險的ECB侵襲的地區(qū)中的耕地/環(huán)^Mio3.有效用于^⑶損害白機平分方法的開發(fā)對于WCR，開發(fā)評分方法來實現(xiàn)對調(diào)查近交系的根損害的高通量評分。到現(xiàn)在為止，不得不用手掘出受損害植物的根，這是極其勞動密集的。4.作圖群體的分子遺傳表征對POP1的親本成分篩選多態(tài)性SSR標志物。使用多態(tài)性SSR來作圖，主要聚焦于WCR。收獲200種雙單倍體近交系的葉材料，并自其分離DNA。用大量的抗性和易感性DH系實施別的進一步標志物篩選。使用具有2年性狀評估結(jié)果的200種DH系的標志物結(jié)果(每個200種多態(tài)性SSR)計算對WCR的QTL分析。另一種用于鑒定分子標志的方法是SNP(單核苷酸多態(tài)性)分析，其是本發(fā)明的一種優(yōu)選的方法。SNP指基因組區(qū)域諸如基因內(nèi)的特定位置處的單DNA堿基交換或單堿基插入/刪除。群體中的數(shù)個個體可以例如具有堿基腺嘌呤，而其它個體在基因內(nèi)的同一位置處具有堿基胞嘧啶。這些交換可以指明表型特征諸如疾病抗性?？梢栽贒NA芯片或微陣列上通過例如等位基因特異性雜交或引物延伸來檢測點突變。這些檢測方法基于寡核苷酸，所述寡核苷酸以所謂陣列的形式排列在芯片上，即預先確定的排列，以便經(jīng)由雜交或者經(jīng)由雜交及隨后排列的寡核苷酸的DNA聚合酶依賴性引物延伸來檢測。對于這兩種技術(shù)，在芯片上的特定位置處排列和固定探針，即各種寡核苷酸，而要檢查的樣品的核酸分子以雜交溶液形式存在。使此溶液與芯片接觸并一起溫育，容許樣品的DNA分子(其存在于溶液中)尋找其在生物芯片表面上的合適雜交配偶，即匹配各17分子的寡核苷酸探針，并與其雜交。SNP檢測的另一種方法是多重寡核苷酸連接/聚合酶鏈式反應(yīng)及隨后的毛細管電泳，如記載于本申請的實施例中的。優(yōu)選地，本發(fā)明的玉蜀黍植物具有至少一項位于選自下組的位置處的SNP:染色體5上的197cM_IBM_map；染色體2上的221cM_IBM_map；染色體1上的1008cM_IBM_map；染色體1上的1015cM_IBM_map；染色體1上的659cM_IBM_map；染色體1上的327cM_IBM_map；染色體2上的383cM_IBM_map；染色體3上的192cM_IBM_map；染色體3上的511cM_IBM_map；染色體8上的105cM_IBM_map；染色體4上的251cM_IBM_map；染色體5上的664cM_IBM_map；染色體7上的258cM_IBM_map；染色體5上的250cM_IBM_map；染色體6上的374cM_IBM_map；染色體6上的302cM_IBM_map；染色體6上的277cM_IBM_map；染色體8上的269cM_IBM_map；染色體7上的86cM_IBM_map；染色體8上的241cM_IBM_map；染色體8上的389cM_IBM_map；染色體8上的461cM_IBM_map；染色體9上的238cM_IBM_map；染色體9上的230cM_IBM_map和染色體2上的314cM_IBM_map。優(yōu)選地，本發(fā)明的玉蜀黍植物具有至少2、3、4或5項SNP，更優(yōu)選至少6、7、8、9或10項SNP，甚至更優(yōu)選至少11或12項SNP，且最優(yōu)選至少13或14項位于選自上文給定位置的位置處的SNP。本發(fā)明的玉蜀黍植物可以進一步包含一項或多項位于選自下組的位置處的SNP染色體1上的142cM_cons_map；染色體2上的72cM_cons_map；染色體2上的90cM_cons_map；染色體3上的127cM_cons_map；染色體4上的54cM_cons_map；染色體6上的148cM_cons_map；染色體7上的80cM_cons_map；染色體7上的81cM_cons_map；染色體8上的93cM_cons_map；染色體8上的115cM_cons_map；染色體9上的98cM_cons_map；染色體10上的74cM_cons_map和染色體10上的35cM_cons_map。在本發(fā)明的一個實施方案中，玉蜀黍植物具有位于如下位置處的SNP的組合染色體5上的197cM_IBM_map；染色體2上的221cM_IBM_map；染色體1上的1008cM_IBM_map；染色體1上的1015cM_IBM_map；染色體1上的327cM_IBM_map；染色體2上的383cM_IBM_map；染色體4上的251cM_IBM_map；染色體5上的664cM_IBM_map；染色體7上的258cM_IBM_map；染色體6上的302cM_IBM_map；染色體6上的277cM_IBM_map；染色體8上的269cM_IBM_map；染色體9上的238cM_IBM_map和染色體9上的230cM_IBM_map。它可以進一步包含位于如下位置處的SNP的組合染色體1上的142CM_C0ns_map；染色體4上的54cM_cons_map；染色體6上的148cM_cons_map；染色體7上的80cM_cons_map和染色體10上的74cM_cons_map。在本發(fā)明的另一個實施方案中，玉蜀黍植物具有位于如下位置處的SNP的組合染色體5上的197cM_IBM_map；染色體1上的659cM_IBM_map；染色體2上的383cM_IBM_map；染色體3上的192cM_IBM_map；染色體3上的511cM_IBM_map；染色體8上的105cM_IBM_map；染色體5上的250cM_IBM_map；染色體6上的374cM_IBM_map；染色體7上的86cM_IBM_map；染色體8上的241cM_IBM_map；染色體8上的389cM_IBM_map；染色體8上的461cM_IBM_map和染色體2上的314cM_IBM_map。它可以進一步包含位于如下位置處的SNP的組合染色體2上的72cM_cons_map；染色體2上的90cM_cons_map；染色體3上的127cM_cons_map；染色體7上的81cM_cons_map；染色體8上的93cM_cons_map；染色體8上的115cM_cons_map；染色體9上的98cM_cons_map和染色體10上的35cM_cons_map。18最優(yōu)選地，本發(fā)明的玉蜀黍植物具有位于位置染色體5上的197cM_IBM_map和染色體2上的383cM_IBM_map處的SNP的組合。優(yōu)選地，染色體5上的位置197cM_IBM_map處的SNP是A/T交換；染色體2上的位置221cM_IBM_map處的SNP是C/T交換；染色體1上的位置1008cM_IBM_map處的SNP是A/C交換；染色體1上的位置1015cM_IBM_map處的SNP是A/T交換；染色體1上的位置659cM_IBM_map處的SNP是C/T交換；染色體1上的位置327cM_IBM_map處的SNP是A/C交換；染色體2上的位置383cM_IBM_map處的SNP是A/C交換；染色體3上的位置192cM_IBM_map處的SNP是A/G交換；染色體3上的位置511cM_IBM_map處的SNP是C/G交換；染色體8上的位置105cM_IBM_map處的SNP是C/T交換；染色體4上的位置251cM_IBM_map處的SNP是G/T交換；染色體5上的位置664cM_IBM_map處的SNP是A/G交換；染色體7上的位置258cM_IBM_map處的SNP是C/T交換；染色體5上的位置250cM_IBM_map處的SNP是A/G交換；染色體6上的位置374cM_IBM_map處的SNP是A/G交換；染色體6上的位置302cM_IBM_map處的SNP是A/G交換；染色體6上的位置277cM_IBM_map處的SNP是A/G交換；染色體8上的位置269cM_IBM_map處的SNP是A/T交換；染色體7上的位置86cM_IBM_map處的SNP是C/G交換；染色體8上的位置241cM_IBM_map處的SNP是G/T和/或C/G交換；染色體8上的位置389cM_IBM_map處的SNP是C/G和/或C/T交換；染色體8上的位置461cM_IBM_map處的SNP是A/C交換；染色體9上的位置238cM_IBM_map處的SNP是A/C交換；染色體9上的位置230cM_IBM_map處的SNP是C/G交換，而染色體2上的位置314cM_IBM_map處的SNP是A/T交換。優(yōu)選地，染色體1上的位置142CM_COnS_map處的SNP是G/T交換；染色體2上的位置72cM_cons_map處的SNP是A/T交換；染色體2上的90cM_cons_map處的SNP是A/G交換；染色體3上的127cM_cons_map處的SNP是A/G交換；染色體4上的54cM_cons_map處的SNP是A/C交換；染色體6上的148cM_cons_map處的SNP是C/T交換；染色體7上的80cM_cons_map處的SNP是C/G交換；染色體7上的81cM_cons_map處的SNP是A/G交換；染色體8上的93cM_cons_map處的SNP是G/T交換；染色體8上的115cM_cons_map處的SNP是A/G交換；染色體9上的98cM_cons_map處的SNP是C/T交換；染色體10上的74cM_cons_map處的SNP是A/C交換，而染色體10上的35cM_cons_map處的SNP是C/T交換。如下檢測SNP的存在，即比較通過其在抗性植物和易感性植物染色體上的位置鑒定的特定基因座的序列與親本植物中的同一基因座的序列，并測定與預期等位基因頻率的偏差。若一個等位基因與另一個等位基因相比顯示高至少兩倍的頻率，且若等位基因頻率間的差異為至少0.2，則認為與預期等位基因頻率的偏差是顯著的。以cM_IBM_map描述本發(fā)明SNP的位置是基于IBM22005Neighbours圖譜，其在http://www.maizegdb.org/map.php#rep下可獲得，并且其還i己載于Schaeffer等(2006)PlantandAnimalGenomeConferenceXIV(P372):200。以cM_cons_map描述本發(fā)明SNP的位置是基于共有圖譜，其由公司TraitGenetics開發(fā)。關(guān)于所使用的分子標志及其位置的更多信息可獲自TraitGenetics，AmSchwabeplanIb，06466Gatersleben，Germany。技術(shù)人員知道如何基于此信息來確定SNP的位置。術(shù)語“cM”在用于描述SNP的遺傳基因座時指單位“厘摩”，其在遺傳學中作為度量用于描述沿著染色體的距離，例如染色體上的兩個基因間的相對距離。1厘摩對應(yīng)于染色體上的一處遺傳基因座的標志物會由于交換而與第二處基因座的標志物分開的機率為1%。本發(fā)明還涉及一種鑒定對西方玉米根蟲和歐洲玉米螟蟲都有抗性或者對西方玉米根蟲有抗性的植物的方法，其通過在自所述植物分離的遺傳材料中檢測至少一種上文所列出的單核苷酸多態(tài)性來進行。優(yōu)選地，通過選自下組的方法來確認具有至少一種單核苷酸多態(tài)性的植物的抗性根據(jù)1-9倒伏評定量表來確定倒伏，通過使用0-3IOWa量表來確定根損害或者測定幼蟲回收。本發(fā)明還涉及通過此方法鑒定的植物。使用以下實施例來例示本發(fā)明，但是不應(yīng)解釋為限制性的。實施例1;ffCR/ECB抗件玉米系的牛成用于抗性系的育種方法如下重組親本材料，后續(xù)自交世代處于WCR和ECB幼蟲依照文獻中所記載的火箭筒(bazooka)技術(shù)進行的同時人工侵襲。系A(chǔ)T0039、R4535、和R7222的親本材料(參見下表)是遺傳方面廣泛，但雜合方面明確限定的合成物，其中25%的部分為HPR外來植物。IPR外來植物衍生自熱帶/亞熱帶遺傳材料。IPR供體是“(天然)宿主植物抗性”供體，其已經(jīng)隨著人工侵襲一起進行過育種以展現(xiàn)出針對大量玉米有害物的穩(wěn)定抗性?；鸺布夹g(shù)是一種用于在玉米植物上靶向應(yīng)用某種量的幼蟲的方法。它由J.A.Mihm博士于1979年開發(fā)。還可參見Wiseman，B.R;Widstrom，N.W.Comparisonofmethodsofinfestingwhorl-stagecornwithfallarmy-wormlarvae.JournalofEconomicalEntomology卷73，第440頁-第442頁，1980。依照植物與昆蟲之間的天然關(guān)系在代表玉米植物供幼蟲進食最佳生長的時間點時發(fā)生幼蟲應(yīng)用。生成了下列玉蜀黍系(表2)BSSS定義為Iowa硬莖合成物，如記載于Hallauer和Miranda(Hallauer，A.R.；MirandaFilho,J.B.Quantitativegeneticsinmaizebreeding.第2版Ames:IowaStateUniversityPress,1988)的。BSSS是用于溫帶玉米種植的公知的雜合方面重要的基因集合。2耕地的詵擇在那些多年來有害物頻繁出現(xiàn)并在正常年份中引起實質(zhì)性經(jīng)濟損失的地區(qū)中選擇測試區(qū)域。為了選擇區(qū)域，考慮支持高侵襲壓力的所有參數(shù)，諸如玉米后玉米種植、無輪種(返種)土壤工作或犁地等。另外，對于WCR位置，在冬季中采集土壤樣品，以便通過自土壤清洗WCR卵或者通過對實驗室中孵出的幼蟲進行計數(shù)來選擇最受侵襲的位置。3實驗設(shè)置在匈牙利針對WCR、在德國針對ECB和在美國針對WCR和ECB實施近交植物的測試。在美國的位置處，應(yīng)用額外的WCR或ECB幼蟲以提高侵襲壓力。一般測試安排是隨機化區(qū)組安排。在5米土塊長度的兩排中且以3倍再現(xiàn)實施實驗。為了控制抗性的穩(wěn)定性，用選定的雜種以4倍再現(xiàn)實施約80平方米的土塊大小的所謂帶測試。在歐洲測試4處位置兩處位置在匈牙利，其中一處位置顯示重度WCR侵襲，而在另一處位置中沒有可見的根損害，但是在陷阱中找到一些成年昆蟲。采用這兩處位置進行生產(chǎn)。另兩處位置在德國，其中一處位置顯示晚期/中等ECB攻擊，而采用一處位置進行生產(chǎn)。4對WCR的測試評估自6月中旬起，在每處測試位置安裝數(shù)個信息素陷阱，并以3天的時間間隔分析WCR甲蟲。此規(guī)程容許對侵襲壓力進行評估。在開花時，關(guān)于由于WCR幼蟲引起的根損害導致的倒伏實施目視評定?；谶@些結(jié)果，掘出一些選定的植物來對根評定。依照在美國常用的Iowa量表來實施此評定。已經(jīng)建立了Iowa量表用于評估由玉米根上的玉米根葉甲幼蟲進食引起的損害量?？梢酝ㄟ^掘出采取約25cm直徑至15cm深度的根系統(tǒng)來完成此評估。通過溫和搖動和/或拍打(小心不要弄斷任何冠根)來自根部除去盡可能多的土壤。然后清洗根系統(tǒng)以使得所有冠根都相當干凈?？梢酝ㄟ^使用諸如下列各項的量表來評估對根系統(tǒng)的損害(“破壞的”指“對植物沒有功能價值”)1=沒有可見的損害或僅很少的次要進食傷痕；2=存在可見的進食傷痕，但是植物沒有被吃掉至4cm內(nèi)的根，或者具有一條或兩條縮短的根，如果系統(tǒng)的剩余部分相對沒有損害的話；3=植物的數(shù)條根被吃掉至4cm內(nèi)，但是根整節(jié)的等同物從未受到破壞；4=根的一節(jié)受到破壞或者等同物受到完全破壞；5=根的兩節(jié)受到完全破壞；6=三節(jié)或更多節(jié)受到完全破壞(不是例示性的，但是與五的評定類似)。收獲前不久，關(guān)于由于WCR幼蟲引起的根損害導致的倒伏實施另一次評定。實施收獲，如必要的話。5針對ECB的測試評估自7月中旬起，以定期的時間間隔對測試區(qū)域檢查ECB侵襲。在區(qū)別侵襲時，實施評定。在收獲前不久實施最重要的評定。實施收獲，如必要的話。下表顯示了結(jié)果的匯總(表3)n=結(jié)果的數(shù)目11=倒伏的水平(量表1=高度有抗性的至9=高度易感的)6評估不同篩詵位置的有害物壓力為了評估不同篩選位置的有害物壓力，2008年6月開端在每處位置上建立4個信息素陷阱，并對陷阱中抓獲的甲蟲量定期計數(shù)，并計算4個信息素陷阱的均值。圖9中顯示了位置Villany、Szentl6rinc和Dalmand上的評估結(jié)果。所有位置的天然有害物壓力都是高的，范圍為Villany中的1374至Szentl6rinc中的1876和Dalmand中的多至1896。文獻報告陳述，若每株植物找到0，5至1，0只成年甲蟲，則發(fā)生經(jīng)濟損害。觀察到的甲蟲數(shù)目指明所有三處篩選位置的高有害物壓力或高經(jīng)濟損害。7雜種植物的WCR抗性為了證明/確認SWS雜種的西方玉米根蟲抗性，用預期的易感性競爭者雜種檢驗物(DKC5143、PR37F73、PR35P12、DK440、PR38R92、DKC3511和PR36K67)和1種SWS易感性雜種檢驗物(ZAM0RA)和5種用具有西方玉米根蟲抗性的親本成分開發(fā)的實驗雜種開始評估試驗。在三處位置(DalmancUVillany和Szentl6rinc)上種植雜種，其中以每排平均20粒種植的種子在3m樣地中進行4次重復。在每次重復(=排)中，挖掘5株單植物，并測量Iowa根得分(0-3)來評估由西方玉米根蟲幼蟲引起的根損害。下表顯示了在三處匈牙利位置(Dalmand、Szentl6rinc和Villany)上獲得的每種雜種的平均根得分(表4)遺傳率或遺傳度定義為遺傳方差對表型方差的比例。如下計算運算遺傳率，即確定方差分量，并通過以下公式計算遺傳率1，0的遺傳率意味著WCR抗性的差異完全基于遺傳學，而0的數(shù)值意味著差異完全基于環(huán)境。使用Plabstat(即即一種用于使用以下模型來評估植物育種試驗的計算機軟件)來計算實驗的運算遺傳率G=基因型L=位置R=重復Y=G+L+RL+GL+GRL計算遺傳率為位置Dalmand:0.66位置Szentl6rinc:0.21位置Villany:0.52所有位置0.72基因型、位置和重復之間的差異均是高度顯著性的(a=0.01)。所有測試SWS抗性雜種與所有測試易感性雜種相比顯示更低的根損害得分。SWS抗性雜種(1.11)與所有易感性雜種的平均值(1.55)相比顯示低平均28.4的根損害。具有根得分1.01的最好雜種SUM2170與最易感的雜種ra37F73(l.66)相比顯示低39.2%的根損害。8沂交系的WCR抗件為了證明/確認SWS近交系的西方玉米根蟲抗性，在2008年用一種易感性檢驗物(AC3512)和一種普遍知道的抗性來源(NGSDCRWl(S2)C4-15-252)及兩種SWS近交系開始評估試驗。AC3512是沒有涉及西方玉米根蟲抗性的任何遺傳背景的SWS良種近交系(易感性檢驗物)。NGSDCRW1(S2)C4-15-252是西方玉米根蟲抗性近交系，其是經(jīng)由4輪對合成NGSDCRffl(S2)C4的輪回選擇開發(fā)的。NGSDCRW1(S2)C4-15-252稱作“黃金標準”，所有新的抗性來源都與此標準檢驗物近交系進行比較(Bohn，M.2007.DerMaiswurzelbohrerindenUSA,ZeitschriftMais34，2:40-43)。R7222和AT3030是具有高度西方玉米根蟲抗性的SWS近交系。因此，在具有可靠的且均質(zhì)天然的西方玉米根蟲壓力的三處匈牙利位置(Dalmand、Villany和Szentl6rinc)上，分別以2次重復(R7222，AT3030)和4次重復(AC3512，NGSDCRff(S2)-15-252)在3m排中種植4種近交系。在每次重復中，挖掘5株單植物，并測量Iowa根得分(0-3)來評估由西方玉米根蟲幼蟲引起的根損害。對AC3512和NGSDCRffl(S2)C4-15-252的總共60株單植物和R7222和AT3030的總共30株單植物評分。下表顯示了根據(jù)Iowa量表0-3的4種近交系的根得分均值(表5)如所預期的，AC3512對西方玉米根蟲是易感的(得分均值2.01)，而黃金標準NGSDCRffl(S2)C4-15-252顯示至少一些耐受性，平均根得分1.34。高度抗性的近交系R7222與AC3512相比顯示低52.2%的平均根損害，并且與黃金標準相比甚至仍顯示低28.4%的平均根損害。9分子標志的作圖a)試驗評估在2008年，在耕地試驗中測試兩種雙單倍體群體(H06103=R2721/R7222；H06107=AJ1472/AL0158)來分析WCR和ECB抗性的遺傳機制。這兩種群體是在沒有WCR/ECB抗性的良種親本(R2721；AL0158)和具有觀察到的對WCR/ECB的抗性的親本(R7222；AJ1472)間雜交的。因此，在受到重度WCR侵襲(天然侵襲)的匈牙利4處位置(Dalmand、Villany、Szentl6rinc、NagysZenas)和具有重度ECB損害(自以前年份的評估知道)的德國2處位置(Oderbruch、Kraichgau)和法國1處位置(Reitwiller)上測試群體H060107的37種基因型(DH系)和H060103的143種基因型(DH系)和兩種作圖群體的4種親本。在每處位置上，在2008年春季種植以每次20顆谷粒/4m排的4次重復。在WCR位置上，評估根倒伏和根損害(Iowa量表0-3)。因此，用鏟挖掘每排的5株植物，并在用高壓清潔器清潔后，通過目視逐根評分。如用Iowa量表(0-3)測定的不同位置/重復(Rl_4)中的群體平均值是(表6)圖10中顯示了根據(jù)Iowa量表的群體H06107和H06103的單一系分布。b)分組分離子分析為了鑒定與ECB/WCR抗性有關(guān)的分子標志，使用SNP標志物進行分組分離子分析。SNP是最豐富的基因組標志物，并且因此SNP基因型分型是一種用于對遺傳變異進行全基因組分析的關(guān)鍵技術(shù)。對于分子標志分析，使用由APPLIEDBI0SYSTEMS開發(fā)的SNP分析平臺SNPlex。此系統(tǒng)使用多重寡核苷酸連接/聚合酶鏈式反應(yīng)和毛細管電泳來分析二等位單核苷酸多態(tài)性基因型。它自單一96孔板產(chǎn)生4608個數(shù)據(jù)點。與內(nèi)置質(zhì)量控制特征、數(shù)據(jù)分析工具和自動化測定設(shè)計一起，這種通量現(xiàn)在容許在極短的一段時間內(nèi)以高精確性實施大規(guī)模研究。SNPlex基因型分型系統(tǒng)由一組預先優(yōu)化的、通用測定試劑組成，所述試劑獨立于所研究的特定SNP利用。測定法僅有的SNP特異性成分是連接探針，其參與寡核苷酸連接(0LA)。目前，可以在一次0LA反應(yīng)中同時解決多至48種SNP。用于SNPlex基因型分型系統(tǒng)的測定工作流程牽涉下列7步(1)使用等位基因特異性和基因座特異性引物進行的等位基因特異性0LA反應(yīng)；(2)通過核酸外切消化過量的探針和接頭來純化0LA產(chǎn)物；(3)使25用通用引物進行通用PCR反應(yīng)來擴增連接產(chǎn)物；(4)在經(jīng)鏈霉親合素包被的微量滴定板中捕獲經(jīng)生物素標記的PCR產(chǎn)物；(5)熒光Zipchute探針對單鏈PCR產(chǎn)物的結(jié)合；(6)雜交的Zipchute探針的洗脫；和(7)在ABI3730x1測序儀中通過毛細管電泳進行的熒光檢測。使用GeneMapperf.0遺傳分析軟件來實施分析。GeneMapper使用經(jīng)驗參數(shù)(諸如信號強度和簇分離)來確定SNP的繪圖特征是否在測定規(guī)格內(nèi)。在第一種方法中，用4種親本(兩份)、6種技術(shù)對照和來自這兩種群體的82種基因型形成一塊96孔板。使用兩處最具信息的位置(Dalmand/Szentlijrinc)的WCRIowa量表根得分來選擇基因型。使用覆蓋總共288種不同SNP的6種不同SNPlex測定法來測定兩種群體的親本成分的標志物多態(tài)性，并且還用來評估易感性和抗性基因型之間的等位基因頻率差異。因此，使易感性和抗性基因型分組。對于抗性分組，僅使用具有<1.2的Iowa根損害均值的基因型，而作為易感的，使用具有>1.5的根得分的所有基因型。將具有1.2和1.5之間的根得分的基因型分類為耐受的，并且因此自分組分離子分析排除。易感性分組H06103:12種基因型抗性分組H0610326種基因型易感性分組H06107:6種基因型抗性分組H061079種基因型在數(shù)條染色體上，觀察到與預期等位基因頻率的顯著偏差(參見表7)。若一個等位基因與另一個等位基因相比顯示高至少兩倍的頻率，且若差異為至少0.2，則說明與預期等位基因頻率的偏差。在依照共有圖譜的群體H06103的染色體1(6種SNP標志物，86cM-197cM)和染色體6(3種SNP標志物，56cM-68cM)上和在依照共有圖譜的群體H06107的染色體8(7種SNP標志物，65cM-115cM)上檢測主要效果。表7與群體H06103和H06107的易感性(S)和抗性(R)分組的預期等位基因頻率具有偏差(用*標示)的SNP標志物。X交換指明SNP標志物的核苷酸交換；Chr和cM_cons_map顯示SNP標志物在共有圖譜上的染色體位置10具有人工病原體停襲的玉米棺物對WCR的杭件在美國密蘇里州哥倫比亞東部9km的密蘇里大學(UniversityofMissouri,MU)Bradford研究和推廣中心由BruceE.Hibbard(USDA-ARS,205CurtisHall,UniversityofMissouri,Columbia,M0,USA)遵循與Hibbard等(2007)J.PlantRegist.1:151-152類似的評估方案來進行研究。為研究選擇的三處耕地(Bradford4，Brookings,Rollins)在上年度種植大豆，因此在所使用的樣地中不會找到野生西方玉米根蟲。將卵在稀釋的(0.15%)瓊脂中懸浮，并校準應(yīng)用以使得每30.5cm約1200粒卵在受侵襲植物的任一側(cè)發(fā)生。用為此特別制作的拖拉機器械注射瓊脂(Moellenbeck等(1994)J.Kans.Entomol.Soc.67:46-52)。另兩塊耕地(Bradford1和Poultry)含有西方玉米根蟲的天然侵襲，其用每30.5cm500粒卵提升。Bradford農(nóng)場和Poultry農(nóng)場位置具有墨西哥粉粒壤土類型，其被測定為2%砂粒、70%粉粒、和28%粘土。Rol1ins位置具有Haymond壤土，其為50%砂粒、38.5%粉粒、12.5%粘27土。雖然Brookings，SouthDakota位置沒有土壤測試，但是已經(jīng)使用該土地進行成功的根蟲試驗達多年之久。在5處不同耕地上以5次重復進行耕地試驗，而溫室試驗具有2種不同處理(草/無草保護作物)，具有5次樣地重復，其中每次2次取樣重復。使用草保護作物來模擬雜草。文獻報告陳述，如果主要的食物來源(玉米根)不可獲得或者玉米品種不是優(yōu)選的進食位置，那么西方玉米根蟲幼蟲使用雜草作為食物來源以進一步發(fā)育?？偣矞y試不同起源的10種雜種，一些具有已經(jīng)知道的易感性(B37xH84)或抗性(MIR604)。事件MIR604是由SyngentaSeeds開發(fā)用于賦予針對西方玉米根蟲和北方玉米根蟲的耕地保護的經(jīng)過遺傳修飾的(GM)玉米。它還表達充當選擇標志的標志蛋白，即PMI，其容許植物利用甘露糖作為碳源。在第二齡早期和第三齡早期為幼蟲取樣(Hibbard等(2004)J.Econ.Entomol.97(3):871_882)定時以進行幼蟲回收。將全部的根團溫和地放置在細篩孔聚乙烯袋中，并懸掛在關(guān)閉冷卻的溫室中的水盤上方。將落入水盆中的西方玉米根蟲幼蟲在95%乙醇中貯存，直至它們可以進行加工。挖掘分開的樣地，清洗，并通過使用基于切斷根節(jié)數(shù)目的Iowa量表0-3來對損害評定(Oleson等(2005)J.Econ.Entomol.981-8)。在所有5塊耕地上對根損害評分，而僅在耕地Rollins、Bradford1和Bradford2上評估幼蟲回收。通過使用Tullgren漏斗來提取溫室幼蟲。Tullgren漏斗在垃圾或土壤樣品中產(chǎn)生約14°C的溫度梯度，刺激土壤節(jié)肢動物向下移入收集容器中。表82008年Bradford研究和推廣中心(M0，USA)具有用西方玉米根蟲卵進行的人工侵襲的重復耕地試驗的根損害得分和幼蟲回收的均值表92008年Bradford研究和推廣中心(M0，USA)具有用西方玉米根蟲卵進行的人工侵襲的重復耕地試驗的不同耕地的根損害(RD)和幼蟲回收(LR)數(shù)目的均值表10在具有兩種處理(具有/沒有作為保護作物的草的樣地)的試驗中在用西方玉米根蟲卵人工侵襲的溫室樣地上種植的10種雜種的幼蟲回收均值在具有針對西方玉米根蟲的預期抗性的所有所測試的常規(guī)雜種中，SUM2162顯示最低的根損害得分(表1和表2)。僅雜種MIR604(其通過GM0性狀賦予保護)具有較低的根損害評定。SUM2068和SUM2162的幼蟲回收與在具有GM0雜種MIR604的樣地上觀察到的幼蟲回收相當。與試驗的最易感的雜種，即MIR604的非GM0型式(等值線)相比，SUM2068顯示低59.4%的幼蟲回收，并且對SUM2162觀察到甚至更多的降低，為60.9%。與其它被分類為抗性的雜種(CRW3(SI)C6、NSSlxCRW3(SI)C6、PI583927、CRW2(C5)、AR17056_16)相比，SUM2068和SUM2162在幼蟲回收方面是卓越的(與最好的其它抗性雜種NSSlxCRW3(SI)C6相比，SUM2068的幼蟲回收要低20.4%MSUM2162的幼蟲回收要低23.3%)。幼蟲回收數(shù)目在耕地和溫室實驗中是一致的。還有，在這些試驗中，雜種SUM2068和SUM2162與所有所測試的常規(guī)雜種相比顯示最低的幼蟲回收數(shù)目(表3)。在溫室實驗中，SUM2162與“沒有草”保護作物處理中的MIR604顯示相同的低幼蟲回收數(shù)目。附圖簡述圖1來自已經(jīng)在針對WCR和/或ECB的抗性方面進行過測試的近交系的結(jié)果。在長度為5米的兩排中以隨機化區(qū)組安排播種近交系。重復實驗。植物的絕對數(shù)和“倒伏的”植物(即對WCR和ECB易感的植物)的百分比表示在Y軸上。評估基于1(抗性)至9(易感性或敏感性)的倒伏評定量表。圖形顯示了植物總數(shù)、易感性(敏感性)植物數(shù)目和抗性植物總數(shù)及各種植物群體相對于植物總數(shù)的百分比。將抗性植物進一步細分成對WCR和ECB都有抗性的植物和僅對WCR或EBC有抗性的植物。圖2與圖1相同的呈現(xiàn)，但用雜種植物。圖3用WCR侵襲雜種植物。對雜種進行所謂的帶測試(striptest)，即將它們在受到WCR污染的耕地(帶)上種植。在此耕地的一部分上安排網(wǎng)帳篷，并通過對被帳篷下的信息素陷阱吸引的WCR甲蟲數(shù)目計數(shù)來對侵襲定量。圖3a顯示了與其它位置相比發(fā)生相對較低WCR侵襲的HSB位置處的侵襲。圖3b顯示了存在相對較高WCR侵襲壓力的HBB位置處的侵襲。下方的線顯示了在各個時間點時計數(shù)的甲蟲數(shù)目，而上方的線顯示了整個時間段里的累積侵襲。圖4易感性(左側(cè)照片)和抗性(右側(cè)照片)雜種的照相呈現(xiàn)，其中易感性雜種由于根損害而“倒伏”，而抗性雜種以垂直位置保持。圖5根損害的照相呈現(xiàn)，其中易感性雜種(左側(cè)照片)顯示了生長受妨礙強烈的根，而抗性雜種(右側(cè)照片)顯示了正常的根生長。圖6:不同雜種(Astor、Sum1351、Zamora、Sum1352)的WCR損害結(jié)果。單獨地或另外與殺昆蟲劑物質(zhì)噻蟲胺(clothianidin)(PonchoPro，63g/50000顆玉米粒)一起用殺真菌劑TMTD(二硫化四甲基秋蘭姆(tetramethylthiuramdisulfide),30gTMTD/50000顆玉米粒)處理雜種。呈現(xiàn)由于WCR損害而“倒伏”的植物的百分比。評估是基于倒伏評定量表?！癆stor”是非常易感的雜種植物?！癦amora”是由于極好的根系統(tǒng)而在某些條件下顯示對WCR的耐受性的雜種。雜種Sum1351衍生自僅一種抗性親本植物(R7240xAJ1494)，而雜種Sum1352衍生自都有抗性的兩種親本植物(R7222xAJ1499)。圖7產(chǎn)量結(jié)果(帶測試)。在由四排(每排測量25米)構(gòu)成的一塊土地上重復實驗四次。雜種Astor和Zamora比雜種SUM1351和SUM1352顯示更好的產(chǎn)量，因為后兩種還不是良種材料。圖8不同位置上的產(chǎn)量結(jié)果(帶測試)。德國位置Lichtenau僅顯示輕微的ECB侵襲，而匈牙利位置HBB顯示高WCR侵襲壓力。認為位置HSB顯示中等WCR侵襲。SUM1352雜種在高WCR襲位置中比非常易感的雜種Astor顯示更好的產(chǎn)量結(jié)果。圖92008年在匈牙利位置Villany(a)、Dalmand(b)和Szentl6rinc(c)上來自4處信息素陷阱的抓獲WCR甲蟲的平均數(shù)。圖10群體H06107(a)和H06103(b)關(guān)于WCR抗性的單一系分布。用0_3的新Iowa量表評估根損害。呈現(xiàn)了位置Dalmand和Villany的均值。參考文獻Bohn,M.，Groh,S.，Khairallah,M.M.，Hoisington,D.A.，Utz,H.F.andMe1chinger,A.E.(2001)Re-evaluationoftheprospectsofmarker-assistedselectionforimprovinginsectresistanceagainstDiatraeaspp.intropicalmaizebycrossvalidationandindependentvalidation.Theor.Appl.Genet.，1031059-1067Capinera，J.L.，Epsky，N.D.，andThompson,D.C.(1986)Effectsofadultwesterncornrootworm(Coleoptera:Chrysomelidae)earfeedingonirrigatedfieldcorninColorado.JournalofEconomicEntomology,791609-1612.EPP0(1996)SituationofDiabroticavirgiferainSerbia(YU).FromlnternationalWorkshop"WesternCornRootworminEurope95”，G6d6ll6(HU)，1995-11-08.EPP0ResportingService(1996/006).EPP0(1998)DiabroticavirgiferatrappednearVeneziaairport(Italy)From:0sservatorioperIeMalattiedellePiantediVerona,ServizioFitosanitarioRegionaledelVeneto，1998-08.EPP0ReportingService(1998，98/161).FengmingY，LISonggang，XUChongren，LINChangshan1996AntifeedantPropertyofDIMB0AandItsEffectonGrowthandDevelopmentoftheAsianCornBorer，Ostriniafurnacalis(GUENEE),P.D.1996-03-20Vol.32No.2pp.254-260；www.pku.edu.cn/academic/xb/96/y96218.htmlFlint-GarciaSA,ThornsberryJM,BucklerES(2003)Structureoflinkagedisequilibriuminplants.AnnuRevPlantBiol54:357—374Gavloski，J.E.，Whitfield，G.H.andEllis，CR.(1992)Effectoflarvaeofwesterncornrootwormandofmechanicalrootpruningonsapflowandgrowthofcorn.JournalofEconomicEntomology，85:1434_144LGianessi，L.，Sankula，S.andReigner，N.2003.PlantbiotechnologyPotentialimpactforimprovingpestmanagementinEuropeanagriculture.MaizeCaseStudy.TheNationalCenterforFoodandAgriculturalPolicy,Washington.HansenL.M.，RoleofDIMB0Ainthepartialresistanceofwinterwheattothegrainaphid(SitobionavenaeF.)；SecondEuropeanAllelopathySymposium,2004年6月，Pulawy,PolandJarvis,J.L.，Clark,R.L.，Guthrie,W.D.，Berry,E.C.，Russell,W.A.1984.There1ationshipbetweensecond-generationEuropeancornborersandstalkrotfungiinmaizehybrids.Maydica24:247-263.Jennings,C.W.，Russell,W.A.，andGuthrie,W.D.(1974)GeneticsofResistanceinMaizetoFirstandSecond-BroodEuropeanCornBorer.CropScience14394-398Krysan,J.L.andMiller,T.A.(1986)MethodsforthestudyofDiabrotica.SpringerVerlag，NewYork，第260頁Langenbruch，G.A.andSzewczyk,D.1995.Maisziinsler(Ostrinianubialis)anMaisimSiidenNordrhein-Westfalens.NachrichtenblattDeutscherPflanzenschutzdienst.47:326.Levine，E.andOloumi-Sadeghi，H.(1991)ManagementofDiabroticiterootwormsincorn.AnnualreviewofEntomology,36229~255.Lew,H.，Adler，A.，EdingerE.1991.MoniliformandtheEuropeancornborer(Ostrinianubialis).Mycotox.Res.7A:71_76.Magg，T.2004.Resistanceofmaize(ZeamaysL.)againsttheEuropeancornborer(OstrinianubilalisHb.)anditsassociationwithmycotoxinsproducedbyFusariumspp.DissertationanderUniversitatHohenheim.Meloche，F(xiàn).，F(xiàn)ilion，P.TremblayG.&LeSageL.(2001)[AdvanceofDiabroticavirgiferavirgifera(Coleoptera:Chrysomelidae)incornfieldsinQuebecandsamplinginsoybeanplantsinOttawa,Ontario]Phytoprotection,82:35-38.Metcalf，R.L.(1976)Organochlorineinsecticides，survey,andprospects.In:Metcalf，R.L.&McKelvey,J.J.(Eds.)Thefutureforinsecticides.Needsandprospects.ProceedingsofaRockefellerFoundationConferenceBellagio，Italy,April22-27，1974.JohnWiley，London，第223頁-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