專(zhuān)利名稱(chēng)：Il-6r基因snp位點(diǎn)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及IL-6R基因SNP位點(diǎn)的用途及其試劑盒和檢查方法。
背景技術(shù)：
類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以對(duì)稱(chēng)性、多關(guān)節(jié)、小關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀硇宰陨砻庖咝约膊?，以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要病理特征。作為一種常見(jiàn)的，慢性的，系統(tǒng)炎癥性自身免疫性疾病，其發(fā)病率約為0. 4% 左右，80%患者發(fā)病年齡在20 45歲，男女之比為 1 2.4。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)展至晚期可致關(guān)節(jié)強(qiáng)直和畸形，功能?chē)?yán)重受損甚至殘廢，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，因此該疾病每年給社會(huì)造成巨大的財(cái)力物力損失。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與環(huán)境、細(xì)菌、病毒、遺傳、性激素及精神狀態(tài)等因素密切相關(guān)。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism, SNP)是指存在于某一(些) 群體、正常個(gè)體的基因組DNA中單堿基的序列差異，并且在人群中的分布頻率至少要在以上(Brookes AJ. Gene，1999，234 (2) 177-186)，人類(lèi)遺傳基因的多態(tài)性在遺傳信息上的本質(zhì)表現(xiàn)，90%以上是由SNP所引起的。因?yàn)槠涠鄳B(tài)信息量大，目前已成為繼限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)志和微衛(wèi)星即短串聯(lián)重復(fù)(STR)標(biāo)志后的第三代遺傳標(biāo)志。從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)到臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，SNP都存在巨大的應(yīng)用價(jià)值。SNP的研究為基因診斷，尤其是疾病的早期診斷提供更多依據(jù)有重要意義。SNP由于其分布廣、密度高而被期望在諸如癌癥、糖尿病、高血壓、憂郁癥和哮喘等復(fù)雜疾病的研究中起重要作用，這些復(fù)雜疾病是多個(gè)遺傳變異位點(diǎn)與環(huán)境因子共同作用的結(jié)果，由于發(fā)病原因復(fù)雜，涉及的基因數(shù)量多，已成為國(guó)際上疾病基因組學(xué)研究的重點(diǎn)。目前已有實(shí)驗(yàn)將SNP應(yīng)用于腫瘤預(yù)后及易感性的判斷，例如肺癌致癌物的易感性存在個(gè)體差異，即肺癌的基因易感性，研究較多的是代謝酶基因多態(tài)性，如人細(xì)胞色素P450-CYP450和髓過(guò)氧化酶MPO等。法國(guó)研究者證實(shí)，MPO基因啟動(dòng)子(463G/A)多態(tài)性導(dǎo)致該基因較低的表達(dá)，可以降低肺癌患病的危險(xiǎn)性 (Chewier I，Stucker 1，Houllier AM，et al. pharmacogenetics，2003，13(2) :729-739)。 日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了 HER-2基因編碼區(qū)的一個(gè)SNP與胃癌的發(fā)展及惡性程度有關(guān)(Kuraoka K， Matsumura S, Hamai Y,et al. Int J Cancer,2003,107(4) :593-596)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性的診斷或類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的個(gè)體化治療提供一種解決方法。為此，本發(fā)明公開(kāi)了 IL-6R基因SNP位點(diǎn)在制備診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性的檢測(cè)試劑盒中的用途。在一些實(shí)施例中，所述IL-6R基因SNP位點(diǎn)為IL-6R基因-183A/G(rs4845617)和 D358A/C (rs2228145)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能通過(guò)能夠檢測(cè)SNP位點(diǎn)的任何方法或技術(shù)在個(gè)體的核酸中進(jìn)行在本文所公開(kāi)的一個(gè)或幾個(gè)SNP標(biāo)記上存在的核苷酸的分析。例如，一個(gè)人能用本發(fā)明所述的方法通過(guò)進(jìn)行Taqman法、質(zhì)譜法、DNA微陣列法、測(cè)序法、微測(cè)序、雜交、限制性片段分析、寡核苷酸連接檢測(cè)、等位基因特異性PCR-HRM或聯(lián)合應(yīng)用上述方法檢測(cè)SNP位點(diǎn)生物標(biāo)記。當(dāng)然，這一列表僅是示例性的，并且絕不用于限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用任何合適的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這種檢測(cè)。本發(fā)明第二方面公開(kāi)了 IL-6R基因SNP位點(diǎn)單倍型或IL-6R和IL-6基因SNP位點(diǎn)單倍型在制備診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性的檢測(cè)試劑盒中的用途。正如本領(lǐng)域所熟知，“單倍型”是指遺傳標(biāo)記的任何組合。單倍型能包含兩個(gè)或更多的等位基因。發(fā)現(xiàn)本文所述的單倍型(或“風(fēng)險(xiǎn)單倍型”)在具有患類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中比在健康個(gè)體中更頻繁和更顯著。因此，這些單倍型對(duì)于檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎風(fēng)險(xiǎn)，或者個(gè)體對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的敏感性具有預(yù)測(cè)價(jià)值?！帮L(fēng)險(xiǎn)單倍型”因此旨在包括本文所述的與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎高度相關(guān)和顯著相關(guān)的標(biāo)記上的一種單倍型或單倍型組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的檢測(cè)SNP位點(diǎn)的序列的方法來(lái)進(jìn)行單倍型的檢測(cè)。在一些實(shí)施例中，IL-6R基因SNP位點(diǎn)單倍型為IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs4845617和 rs2228145單倍型，為G_A、A-A或G-C單倍型。其中G-A單倍型增加RA患病風(fēng)險(xiǎn)，A-A和G-C單倍型降低RA患病風(fēng)險(xiǎn)。IL-6R和IL-6基因SNP位點(diǎn)單倍型為IL-6和IL-6R兩個(gè)基因的五個(gè)SNP位點(diǎn) IL-6-rsl800796/rsl800797/rsl800795/IL-6R-rs4845617/IL-6R-rs2228145 單倍組合，為 C-G-G-G-A、G-G-G-A-C、G-G-G-G-A, C-G-G-A-C, G-G-G-A-A 或 G-G-G-G-C 單倍組合；其中 C-G-G-G-A、G-G-G-A-C 和 G-G-G-G-A 單倍組合增加 RA 患病風(fēng)險(xiǎn)；C-G-G-A-C、G-G-G-A_A 和 G-G-G-G-C單倍組合降低RA患病風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施例中，所述檢測(cè)試劑盒在人類(lèi)受試者中進(jìn)行類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感性評(píng)價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)的體外方法中使用，其中所述試劑盒包含用于進(jìn)行下列步驟的適當(dāng)?shù)墓ぞ遖)評(píng)價(jià)至少一種與所述的人類(lèi)受試者的基因組DNA樣品中的IL-6R基因SNP位點(diǎn)的類(lèi)型和/或水平；和b)將所述的人類(lèi)受試者的在a)中評(píng)價(jià)的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)與健康的和/或患病的人的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，來(lái)做出所述的人類(lèi)受試者的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)。在一些實(shí)施例中，所述試劑盒在鑒定人類(lèi)受試者中的與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性相關(guān)的SNP單倍型的體外方法中使用，所述試劑盒包含用于進(jìn)行下列步驟的適當(dāng)?shù)墓ぞ遖)檢測(cè)所述的人類(lèi)受試者的核酸樣品中的IL-6R基因或IL-6R和IL-6基因的至少一種SNP，其中所述至少一種SNP預(yù)示著類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感性；和b)鑒定所述的人類(lèi)受試者的SNP單倍型，其中所述SNP單倍型包含所述在a)中檢測(cè)的所述至少一種SNP。 術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)試劑盒”和“試劑盒”是同義詞并可互換使用。 在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)是指檢測(cè)試劑盒時(shí)，術(shù)語(yǔ)“適當(dāng)?shù)墓ぞ摺笔侵溉魏斡糜谶_(dá)
到所指明的目的的任何技術(shù)手段。作為這種適當(dāng)?shù)墓ぞ叩姆窍拗菩岳?，能列舉試劑和/或材料和/或流程和/或說(shuō)明書(shū)和/或軟件等。本發(fā)明所述的所有試劑盒可包含適當(dāng)?shù)陌b和說(shuō)明書(shū)用于在本文所公開(kāi)的方法中使用。試劑盒可進(jìn)一步包含適當(dāng)?shù)木彌_液和聚合酶，如耐熱聚合酶，例如Taq聚合酶。這種試劑盒也包含對(duì)照引物和/或探針。根據(jù)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑盒，包括基因組DNA抽提試劑、PCR反應(yīng)體系試劑和HRM熒光染料試劑，所述PCR反應(yīng)體系包括dNTP、MgCl2、Taq DNA 聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液和引物，其特征在于所述引物為分別針對(duì)IL-6R基因SNP位點(diǎn) rs4845617 和 rs2228145 的引物對(duì)，或分別針對(duì) IL-6 基因 SNP 位點(diǎn) rsl800796、rsl800797 和rsl800795的引物對(duì)。在可檢測(cè)出SNP位點(diǎn)的前提下，HRM熒光染料試劑可被Taqman法、 質(zhì)譜法、DNA微陣列法、測(cè)序法、微測(cè)序等試劑替換。在一些實(shí)施例中，針對(duì)IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs4845617的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 1 2所示，針對(duì)IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs2228145的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 3 4所示；針對(duì)IL-6基因SNP位點(diǎn)rsl800796的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 5 6所示，針對(duì)IL-6基因SNP位點(diǎn)rsl800797的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 7 8所示， 針對(duì)IL-6基因SNP位點(diǎn)rsl800795的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 9 10所示。在一些實(shí)施例中，所述Taq DNA聚合酶優(yōu)選為熱啟動(dòng)PCR聚合酶，其中最優(yōu)選為 realstart Si。在一些實(shí)施例中，所述HRM熒光染料為Eva Green、Syto9、Resolight和 SupperGreen 中之一。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性的檢測(cè)方法，包括下列步驟a)基因組DNA的抽提；b) PCR 檢測(cè)PCR 反應(yīng)體系包含 10 30ng 基因組 DNA，1 X PCR Buffer, 0. 25U Taq DNA聚合酶，0. 2mM dNTP，0. 3 μ M上下游引物，1 XHRM熒光染料，Mg2+濃度根據(jù)HRM熒光染料的種類(lèi)不同變化；PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性95°C 2min，變性94°C lOsec，退火延伸60°C 30sec, 共30-40個(gè)循環(huán)；c) HRM檢測(cè)條件為96°C 30sec,50°C 30sec，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從83°C到90°C，溫度上升率0. 05 0C /s ；d)基因分型依據(jù)熔解曲線峰型的改變進(jìn)行基因分型；其中所述上下游引物為分別針對(duì)IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs4845617和rs22^145的引物對(duì)，和/或分別針對(duì)IL-6基因SNP位點(diǎn)rsl800796、rsl800797和rsl800795的引物對(duì)。在一些實(shí)施例中，所述Taq DNA聚合酶優(yōu)選為熱啟動(dòng)PCR聚合酶，其中最優(yōu)選為 realstart在一些實(shí)施例中，所述HRM熒光染料為Eva Green, Syto9, Resolight和 SupperGreen 中之一，其中優(yōu)選為 Eva Green。在一些實(shí)施例中，所述HRM熒光染料為Eva Green時(shí)，PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度>
1.5mM，其中優(yōu)選為2. 5mM或3. OmM ;在一些實(shí)施例中，所述HRM熒光染料為L(zhǎng)c Green時(shí)，PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度
2.5 3. OmM，其中優(yōu)選為2. 5mM ；
在一些實(shí)施例中，所述HRM熒光染料為SupperGreen時(shí)，PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度 1. 5 3. OmM，其中優(yōu)選為1. 5mM ；此外，本文所公開(kāi)的SNP和單倍型可對(duì)患者分層(Stratification)。鑒定為發(fā)生類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)增加或降低的個(gè)體的亞群能被用于，尤其是，用于定向臨床試驗(yàn)項(xiàng)目和遺傳藥理學(xué)治療，其中對(duì)于多態(tài)性的了解用于幫助鑒定最適合用特定藥物制劑進(jìn)行治療的患者。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)位于IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs4845617和 rs2228145與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。因此在此基礎(chǔ)上提出一種通過(guò)SNP來(lái)檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感風(fēng)險(xiǎn)性的方法和試劑盒，并且經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證，本檢測(cè)方法具有可行性，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒具有良好靈敏性、穩(wěn)定性和特異性。本發(fā)明的試劑盒對(duì)正常人群進(jìn)行類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性的篩查，能有效起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、早期診斷的作用。


圖1為退火溫度的優(yōu)化凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。1材料與方法1. 1研究對(duì)象收集蘭州大學(xué)第二醫(yī)院2008年10月以來(lái)住院后經(jīng)臨床確證類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者全血標(biāo)本405例(枸櫞酸鈉抗凝:3ml)。所有全血標(biāo)本均在收集后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行血漿分離， 4000rmp離心5分鐘，取Iml血漿于1. 5mlEP管內(nèi)，其余全血分裝2管。分裝標(biāo)本均保存在-40°C。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者或家屬均知情同意。1. 2主要試劑全血基因組DNA提取試劑盒北京百泰克；QuickGene DNA whole blood kit S Fujifilm ；Realstart Taq DNA polymerase 南京 GenScript ；Pfu DNA Polymerase 南京 GenScript ；dNTP Mixture,IOmM each 南京 GenScript ；Taq DNA Polymerase 大連 TaKaRa ；dNTP Mixture, 2. 5mM each 大連 TaKaRa ;Hot Taq DNA Polymerase BBI ；Taq DNA Polymerase BBI ；Taq DNA Polymerase ；|匕京天牛艮；HotStart Taq PCR MasterMix ；|匕京天根；TrueStart Hot Start Taq DNA Polymerase Fermentas ；EvaGreen Dye (20 X) Biotium ； Fast EvaGreen Master Mix for qPCR and HRM Biotium ；SupperGreen Dye (20 X)廈門(mén)百維信；LCGreen plus Dye(IOX)Idaho ；Anti-CCP ELISA kit 上海滬峰；Anti-MCV ELISA kit上海滬峰；Roche capillary Roche ；DNA marker BBI ；SDNAClear Nucleic Acid Stain BBI ；Agarose上海生工；Water-DEPC上海生工；RF檢測(cè)試劑盒上海捷門(mén)；1. 3主要儀器
Rotor-Gene 6000 熒光定量 PCR 儀 Corbett (澳大利亞)；Lightcycler 1. 5 熒光定量PCR儀Roche (瑞士)；黑金剛梯度PCR儀北京東勝創(chuàng)新；QuickGene-Mini80核酸提取儀 Fujifilm(日本)；Centrifuge 5似4 臺(tái)式高速離心機(jī) Eppendorf (德國(guó))；PE_2400PCR 儀PE (美國(guó))；2F-258全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上海嘉鵬；微量核酸電泳系統(tǒng)Bio-Rad(美國(guó))； Nanodrop 2000微量核酸蛋白檢測(cè)儀；Thermal scientific (美國(guó))實(shí)施例IPCR-HRM檢測(cè)體系1. 1基因組DNA的提取(參考試劑盒說(shuō)明書(shū))1.2引物設(shè)計(jì)與合成選擇IL-6基因1086-597G > A (rsl800797)進(jìn)行PCR-HRM檢測(cè)體系的建立。通過(guò)美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館Pubmed引擎(http//www. ncbi.nlm.nih. gov/sites/snp)檢索到其側(cè)翼序列，在線軟件 Primer3 (http://frodo.wi.mit. edu/primer3)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。IL-6 基因引物TGGCAAAAAGGAGTCACACA/CTGTGAGCGGCTGTTGTAGA ；通過(guò) UCSC-PCR(http://genome. ucsc.edu)驗(yàn)證其特異性后交南京金斯特公司合成，引物濃度調(diào)整到20 μ M-20°C保存。另合成IL-6基因-597G > A位點(diǎn)突變基因(長(zhǎng)度96bp)作為陽(yáng)性對(duì)照。1. 3檢測(cè)體系酶系統(tǒng)的選擇酶系統(tǒng)分別以不同生物技術(shù)公司出售的Taq酶和hot Start Taq酶進(jìn)行常規(guī)PCR 反應(yīng)，以Biotium公司生產(chǎn)的HRM專(zhuān)用試劑盒Eva Green Master Mix作為對(duì)照進(jìn)行比對(duì)， 在擴(kuò)增效率好，特異性高的基礎(chǔ)上，選擇成本較低酶系統(tǒng)。1. 4檢測(cè)體系熒光染料的選擇PCR熒光染料的選擇是在PCR擴(kuò)增體系酶系統(tǒng)確定的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇，判斷依據(jù)是PCR擴(kuò)增效率(觀察熒光擴(kuò)增曲線的陡度和S曲線)、PCR產(chǎn)物的特異性(觀察熔解曲線和熔解峰并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證)。1. 5檢測(cè)體系PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化A. Mg2+ 的優(yōu)化Mg2+濃度從1. 5mmol/L(mM)開(kāi)始到4. OmM,每個(gè)梯度增加0. 5mM,共有六個(gè)梯度即 1. 5mM、2. OmM,2. 5mM、3. OmM,3. 5mM和4. OmM。最適Mg2+濃度依據(jù)PCR擴(kuò)增效率和產(chǎn)物的特異性進(jìn)行確定。B.退火溫度的優(yōu)化退火溫度從開(kāi)始，每次增加1°C，依據(jù)PCR擴(kuò)增效率和產(chǎn)物特異性進(jìn)行確定。C.引物濃度的優(yōu)化引物濃度從0. 2-0. 9 μ M選擇三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，一旦出現(xiàn)擴(kuò)增效率低，就需要進(jìn)行上下游引物比例的調(diào)整。D.模板上樣量的優(yōu)化按照模板不超過(guò)總體積1/10的原則，選擇0. 5-1. O μ L進(jìn)行優(yōu)化，選擇擴(kuò)增效率最佳的模板濃度。必要時(shí)可稀釋模板。Ε. PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化首先進(jìn)行兩步法和三步法的選擇，再依據(jù)擴(kuò)增效率、產(chǎn)物特異性、產(chǎn)物熔解溫度和 GC含量進(jìn)行優(yōu)化，必要時(shí)加入Enhancer。1. 6檢測(cè)體系HRM熔解條件的優(yōu)化
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PCR后直接進(jìn)入HRM。在第一次擴(kuò)增后進(jìn)行普通熔解曲線(Melting :70 95°C )， 判斷PCR產(chǎn)物Tm的范圍，以士3°C確定HRM的高分辨熔解范圍；第二次根據(jù)PCR產(chǎn)物高分辨熔角軍產(chǎn)生的雜合峰調(diào) HRM 條件(first hold temperature :10 120second，second hold temperature 30 60second，HRM :Tm_3°C Tm+3°C )，最后確定 HRM 條件。1. 7PCR-HRM檢測(cè)體系的確定與驗(yàn)證A.特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過(guò)溶解曲線峰的單一性、瓊脂糖電泳和測(cè)序進(jìn)行判斷。B.批內(nèi)重復(fù)性同一標(biāo)本在同一批檢測(cè)中重復(fù)檢測(cè)5-10次，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線的重合度以及 Tm值的變異來(lái)判斷。(最終以能否正確進(jìn)行基因分型為標(biāo)準(zhǔn))C.批間重復(fù)性(再現(xiàn)性)同一標(biāo)本在不同批次檢測(cè)中重復(fù)檢測(cè)3次以上，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線和熔解分型的相似程度來(lái)判斷。(最終以能否正確進(jìn)行基因分型為標(biāo)準(zhǔn))D.測(cè)序驗(yàn)證將PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Chromas軟件分析。結(jié)果1、酶系統(tǒng)以biotium的Eva Green Master Mix作為參照，與天根生物技術(shù)公司的普通Taq 酶進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)盡管天根Taq酶擴(kuò)增效率高，但其PCR產(chǎn)物特異性不如EvaGreen Mix,而且存在引物二聚體。說(shuō)明在進(jìn)行PCR-HRM時(shí)，最好選擇熱啟動(dòng)酶，以保證PCR產(chǎn)物的均一性。熱啟動(dòng)酶realstart在擴(kuò)增效率、PCR產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量方面都優(yōu)于 Truestart,而后者無(wú)論在哪一方面都是低效，不能很好的與EvaGreen染料匹配。相對(duì)而言，Realstart熱啟動(dòng)酶與EvaGreen熒光染料匹配擴(kuò)增效率、PCR產(chǎn)物特異性如上圖所示，基本一致，但價(jià)格方面要低于EvaGreen Mix，所以將Realstart酶系統(tǒng)與 EvaGreen匹配組合成PCR-HRM檢測(cè)系統(tǒng)是最佳選擇。2、熒光染料三種熒光染料EvaGreen、Supper Green和Lc Green與realstart酶系統(tǒng)結(jié)合進(jìn)行PCR-HRM，就其檢測(cè)效能而言，都能達(dá)到HRM技術(shù)的檢測(cè)要求，但三種染料的檢測(cè)分辨率依次增強(qiáng)，價(jià)格也是依次升高。所以同等條件下，Eva Green為最適選擇。3、檢測(cè)體系PCR擴(kuò)增條件A. Mg2+ 的優(yōu)化從擴(kuò)增曲線和熔解曲線可以看出，熒光染料EvaGreen除1. 5mM的Mg2+不能擴(kuò)增出產(chǎn)物外，其余濃度均能擴(kuò)出PCR產(chǎn)物。其中2. 5mM和3. OmM的擴(kuò)增效率、產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量接近，處于最佳狀態(tài)。從擴(kuò)增曲線和熔解曲線可以看出，熒光染料Lc Green除2. OmM的Mg2+不能有效擴(kuò)增出產(chǎn)物，2. 5mM的Mg2+擴(kuò)增效率、產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量均優(yōu)于3. OmM的Mg2+，處于最佳狀態(tài)。從擴(kuò)增曲線和熔解曲線可以看出，熒光染料Supper Green除1. 5mM_3· OmM的Mg2+ 均能有效擴(kuò)增出產(chǎn)物，但就擴(kuò)增效率、產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量三個(gè)方面綜合考慮，1. 5mM的Mg2+ 處于最佳狀態(tài)。
B.退火溫度的優(yōu)化從圖1梯度PCR結(jié)果可以看出60°C時(shí)目的條帶很亮，非特異帶沒(méi)有，僅見(jiàn)引物二聚體。同加入熒光染料進(jìn)行熔解曲線分析60°C時(shí)熔解峰最高，說(shuō)明此溫度為最適退火溫度。C.引物濃度的優(yōu)化退火溫度優(yōu)化時(shí)的引物濃度是0. 5 μ M，出現(xiàn)引物二聚體，故上qPCR時(shí)調(diào)整到 0. 3 μ M，擴(kuò)增效果極佳。D.模板上樣量的優(yōu)化從擴(kuò)增曲線和PCR產(chǎn)物的特異性來(lái)看，IOng模板量是足夠進(jìn)行10 μ L體系的PCR反應(yīng)。Ε. PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性 96°C 3min，變性 95°C 6sec，退火60°C 6sec，延伸 72°C 15sec 35個(gè)循環(huán)。4、檢測(cè)體系HRM熔解條件通過(guò)不同的變性時(shí)間(holdl)和雜合退火時(shí)間(hold2)的摸索，發(fā)現(xiàn)變性時(shí)間大于30sec足以使PCR產(chǎn)物完全變性，除非PCR產(chǎn)物Tm值和產(chǎn)量均很高，適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)時(shí)間。雜合退火時(shí)間30seC足夠形成容易辨認(rèn)的雜合，提高溫度雖然能形成更多的雜合，但雜合峰不易辨認(rèn)。故最終以變性時(shí)間和雜合退火時(shí)間均為30sec作為首選。HRH的溫度范圍，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行70-90°C的Melting尋找到PCR產(chǎn)物的Tm之后。5、PCR-HRM檢測(cè)體系驗(yàn)證A.批內(nèi)重復(fù)性以富士核酸提取試劑盒提取的1 號(hào)標(biāo)本為例對(duì)新建PCR-HRM檢測(cè)體系進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)(重復(fù)五次)，熔解曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后完全重合，說(shuō)明重復(fù)性極好，相對(duì)百泰克試劑盒而言，重合度更高，因此分辨率也就更高。Tm值的均值80. 60士0. 049.B.批間重復(fù)性(再現(xiàn)性)以富士核酸提取盒提取的四個(gè)標(biāo)本為例對(duì)新建的PCR-HRM檢測(cè)體系進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)(重復(fù)三天)，熔解曲線的熔解峰型和標(biāo)準(zhǔn)化溶解曲線圖形基本沒(méi)有變化，基因分型結(jié)果完全一致。C.測(cè)序驗(yàn)證隨機(jī)抽取三種基因分型樣本每種各兩例進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果與PCR-HRM技術(shù)基因
分型結(jié)果完全一致。由此，我們可以獲得一種檢測(cè)試劑盒，包括基因組DNA抽提試劑、PCR反應(yīng)體系試劑和Eva Green熒光染料試劑，所述PCR反應(yīng)體系包括dNTP、MgCl2, realstart酶、PCR反應(yīng)緩沖液和針對(duì)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)。實(shí)施例22. 1基因組DNA的提取(參考試劑盒說(shuō)明書(shū))；2. 2引物設(shè)計(jì)與合成針對(duì)IL-I β 基因-511C>T、-31T>C 和+3954C>T 三個(gè) SNP 位點(diǎn)，TNF 基因-863C > A和-857C > T兩個(gè)SNP位點(diǎn)，TNFRl基因-383A > C和TNFR2基因T676G兩個(gè)SNP位點(diǎn)，IL-6 基因-597G > A、-572 和-174G > C 三個(gè) SNP 位點(diǎn)，IL-6R 基因-183 和 D358A 兩個(gè)位點(diǎn)，IL-IRN C > T基因共13個(gè)位點(diǎn)應(yīng)用第一章建立的PCR-HRM檢測(cè)體系進(jìn)行類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的基因多態(tài)性檢測(cè)。通過(guò)美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館Pubmed引擎(http://WWW. ncbi.nlm. nih. gov/sites/snp)檢索到每個(gè)位點(diǎn)的側(cè)翼序列，輸入在線軟件I^rimerf (http://frodo. wi. mit. edu/primer3)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。通過(guò)UCSC-PCR(http://genome, ucsc. edu)驗(yàn)證其特異性后交上海生工生物技術(shù)公司合成，引物濃度調(diào)整到20μΜ-20 保存。各位點(diǎn)引物序列及PCR產(chǎn)物如下IL-1B-511染色體及位置2ql4位點(diǎn)多態(tài)性C/T(rsl6944)引物:P1 CCCAGCCAAGAAAGGTCAAT Tm :56. 7°C GC% :50P2 TGAGGGTGTGGGTCTCTACC Tm :59. 1°C GC% :60PCR 產(chǎn)物100bp Tm :85. 47°C GC% 54CCCAGCCAAGAAAGGTCAATtttctcctcagaggctcctgcaattgacagagagctcc :、，gaggcagagaacagcacccaaGGTAGAGACCCACACCCTCAIL-1B-31染色體及位置2ql4位點(diǎn)多態(tài)性T/C(rsll43627)引物P1 TTTCTCAGCCTCCTACTTCTGC Tm :60. 1°C GC% :50P2 CTTGTGCCTCGAAGAGGTTT Tm :57. 7°C GC% 50PCR 產(chǎn)物:86bp Tm :81. 57°C GC% :46. 5TTTCTCAGCCTCCTACTTCTGCttttgaaagcataaaaacagcgagggagaaactggcagataccAAACCTCTTCGAGGCACAAGIL-1B+3954染色體及位置2ql4位點(diǎn)多態(tài)性C/T(rsll436;34)引物P1 GGCCTGCCCTTCTGATTTTA Tm :58. 5°C GC% :50P2 CGTGCACATAAGCCTCGTTA Tm :58. 5°C GC% 50PCR 產(chǎn)物:95bp Tm :81. 11°C GC% :45. 3GGCCTGCCCTTCTGATTTTAtacctaaacaacatgtgctccacatttcagaacctatcttctt
gacacatgggaTAACGAGGCTTATGTGCACGTNF-863, -857染色體及位置6p21. 3位點(diǎn)多態(tài)性C/A(rsl800630)，C/T(rsl799724)引物:P1 AGACCTCTGGGGAGATGTGA Tm :53. 1°C GC% :55P2 CGTCCCCTGTATTCCATACC Tm :56. 9°C GC% 55PCR 產(chǎn)物159bp Tm :88. 92°C GC% :57. 9AGACCTCTGGGGAGATGTGAccacagcaatgggtaggagaatgtccagggctatggaagtcgagtatggggaccccc ； ι cttaa : ‘gaagacagggccatgtagagggccccagggagtgaaag
agcctccaggacctccaGGTATGGAATACAGGGGACGTNFR1-383染色體及位置12pl3. 2位點(diǎn)多態(tài)性A/C(rs2234649)引物P1CTTGGTGTTTGGTTGGGAGT Tm :57. 8°C GC% :50P2AGGAAGAGCTGGAGGAGGAG Tm :58. 0°C GC% 60PCR 產(chǎn)物:153bp Tm :89. 62 °C GC % :58. 2CTTGGTGTTTGGTTGGGAGTggtcggattggtgggttgggggcacaaggcagccagtctgggactcctgtgcttgtgactggactacaaagagttaaagaacgttgggcctcctcctcccgcctcctgtggcCTCCTCCTCCAGCTCTTCCTTNFR2 T676G染色體及位置1ρ36.3-p36. 2位點(diǎn)多態(tài)性G/T(rsl06l622)引物:P1 CTCCTCCTCCAGCTGTAACG Tm :59. 2°C GC% :60P2 GTGTTGGGATCGTGTGGAC Tm :54. 0°C GC% :57. 9PCR 產(chǎn)物:139bp Tm :90. 74°C GC% :61. 9CTCCTCCTCCAGCTGTAACGtggtggccatccctgggaatgcaagca ggatgcagtctgcacgtccacgtcccccacccggagtatggccccaggggcagtacacttaccccagccagtGTCCACACGATCCCAACACIL-6-597染色體及位置7p21位點(diǎn)多態(tài)性G/A(rsl800797)，引物:P1 TGGCAAAAAGGAGTCACACA Tm :54. 3°C GC% :45 (SEQ ID No. 7)P2 CTGTGAGCGGCTGTTGTAGA Tm 58. 0°C GC% 55 (SEQ ID No. 8)PCR 產(chǎn)物:96bp Tm :84. 98°C GC% :52. 1TGGCAAAAAGGAGTCACACActccacctggagacgccttgaagtaactgcacgaaatttgagg！λ , . tggcaggcagtTCTACAACAGCCGCTCACAGIL-6-572染色體及位置7p21位點(diǎn)多態(tài)性G/C(rsl800796)引物:P1 GAGACGCCTTGAAGTAAC Tm :56. 68°C GC% :50 (SEQ ID No. 5)P2 TGAGTTCTTCTGTGTTCTG Tm :55. 88°C GC% :42. 1 (SEQ ID No. 6)PCR 產(chǎn)物:93bp Tm :84. 79°C GC% :52. 7GAGACGCCTTGAAGTAACtgcacgaaatttgagg ;; tggccaggcagttctacaacagcc 丨人." ctcacagggagagcCAGAACACAGAAGAACTCAIL-6-174染色體及位置7p21位點(diǎn)多態(tài)性G/C(rsl800795)0182]引物:P1 GCCTCAATGACGACCTAAGC Tm :58. 4°C GC% :55 (SEQ ID No. 9)
0183]P2 GGGGCTGATTGGAAACCTTA Tm :58. 3°C GC% 50 (SEQ ID No. 10)
0184]PCR 產(chǎn)物IOlbp Tm :82. 88GC% :47. 5
0185]GCCTCAATGACGACCTAAGCtgcacttttcccctagttgtgtcttgccatgctaaaggac
0186]gtcacattgcacaatcttaaTAAGGTTTCCAATCAGCCCC
0187]IL-6R D358A
0188]染色體及位置lq21
0189]位點(diǎn)多態(tài)性A/C(rs2228145)
0190]引物P1 TCCTCCTATTCCTTTTTCTCCA Tm :55. 5°C GC% :40. 9 (SEQ ID No. 3)
0191]P2 GGAATGTGGGCAGTGGTACT Tm :58. 7°C GC% 55 (SEQ ID No. 4)
0192]PCR 產(chǎn)物103bp Tm :78. 51°C GC% :38. 8
0193]TCCTCCTATTCCTTTTTCTCCAtattctcctcttcctcctctatcttcaattttttttttaacct
0194]agtgcaag ； , ttcttcttcAGTACCACTGCCCACATTCC
0195]IL-6R-183
0196]染色體及位置1 q21.3
0197]位點(diǎn)多態(tài)性A/G(rs4845617)
0198]引物:P1 gcCGCTCTGAGTCATGTGCGAGTG Tm :60. 61°C GC% :59. 1 (SEQ ID No. 1)
0199]P2 GGCTCTCTACACACACTGCGAG Tm :59. 74°C GC % :59. 1 (SEQ ID No. 2)
0200]PCR 產(chǎn)物1 IObp Tm :84. 8°C GC% :68. 8
0201]CGCTCTGAGTCATGTGCGAGTGggaagtcgcactgacactgagccgg : .、、 ccagagggagagg
0202]agccgagcgcggcgcggggccgagggaCTCGCAGTGTGTGTAGAGAGCC
0203]IL-IRN
0204]染色體及位置2ql3
0205]位點(diǎn)多態(tài)性C/T(rs425l96l)
0206]引物:P1 CGTGTCATTCATGCTTCCGGTG Tm :59. 24°C GC% :54. 7
0207]P2 cCAGGTCTGCAGCCAACCAGTTGTG Tm :62. 79°C GC% :58. 3
0208]PCR 產(chǎn)物:139bp Tm :79. 38 °C GC % :52. 5
0209]CGTGTCATTCATGCTTCCGGTGagccctaagtctaagatagggcagatagcacaggtcca
0210]ttttgcagctgtcaaaatgaggtctgaagggcagaagtggtgtgcccacacacaCACAACTGGTT
0211]GGCTGCAGACCTG
0212]2. 3PCR-HRM技術(shù)檢測(cè)基因多態(tài)性
0213]采用實(shí)施例1建立的PCR-HRM檢測(cè)體系作為基礎(chǔ)進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)，引物濃度為0. 3 μ M，反應(yīng)體系12 μ L，金斯特Taq酶系統(tǒng)組成為0. 2U熱啟動(dòng)酶，2. 5mM的Mg+，0. 2mM 的 dNTP，lXPCR Buffer, 20 X EvaGreen, 11 0. 5 μ L0 擴(kuò)增條件為預(yù)變性 96°C 3min，變性 95°C 6sec，退火60°C 6sec，延伸72°C 15sec ；35個(gè)循環(huán)。EvaGreen Mix擴(kuò)增條件為預(yù)變性 960C 3min，變性 96°C 6sec，退火 60°C 6sec，延伸 72°C 15sec35 個(gè)循環(huán)。高 GC 的 IL-6R-183 擴(kuò)增條件為預(yù)變性96°C 3min，變性95°C lOsec，退火60°C lOsec，延伸72°C 15sec 35個(gè)循環(huán)。高分辨熔解選擇HRM通道，按Rotor geneeOOO儀器默認(rèn)條件進(jìn)行。熔解溫度范圍按不同擴(kuò)增子Tm士3°C確定。2. 4基因分型及測(cè)序驗(yàn)證基因分型依靠?jī)x器分析軟件HRM標(biāo)準(zhǔn)化圖形，參考熔解圖和擴(kuò)增圖進(jìn)行判斷，對(duì)不同類(lèi)型熔解曲線的標(biāo)本隨機(jī)抽樣2-3份進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，必要時(shí)雙相測(cè)序或復(fù)查。2. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析將檢測(cè)數(shù)據(jù)輸入Spssl3. 0軟件，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算各SNP的基因型頻率和基因頻率以及單倍型和單倍組合，并應(yīng)用在線分析軟件SHEsisOittp:// analysis, bio-χ. cn/myAnalysis. php)與對(duì)照組進(jìn)行病例-對(duì)照分析。此外，還進(jìn)行性別分層分析。結(jié)果選取76例正常對(duì)照與病例組進(jìn)行病理-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如下表1. 1 IL-IB和IL-1RN在病例組和對(duì)照組的基因分布比較
權(quán)利要求
1.IL-6R基因SNP位點(diǎn)在制備診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性的檢測(cè)試劑盒中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述IL-6R基因SNP位點(diǎn)為rs4845617和 rs22281450
3.IL-6R基因SNP位點(diǎn)單倍型或IL-6R和IL-6基因SNP位點(diǎn)單倍型在制備診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性的檢測(cè)試劑盒中的用途。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述IL-6R基因SNP位點(diǎn)單倍型為IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs4845617和rs2228145單倍型，G_A、A-A或G-C單倍型。
5.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述IL-6R和IL-6基因SNP位點(diǎn)單倍型為 IL-6 和 IL-6R 兩個(gè)基因的五個(gè) SNP 位點(diǎn) IL-6_rsl800796/rsl800797/rs 1800795/ IL-6R-rs4845617/IL-6R-rs2228145 單倍組合，為 C-G-G-G-A、G-G-G-A-C, G-G-G-G-A, C-G-G-A-C, G-G-G-A-A 或 G-G-G-G-C 單倍組合。
6.如權(quán)利要求1或3中所述檢測(cè)試劑盒，包括基因組DNA抽提試劑、PCR反應(yīng)體系試劑和HRM熒光染料試劑，所述PCR反應(yīng)體系包括dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液和引物，其特征在于所述引物為分別針對(duì)IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs4845617和rs2228145 的引物對(duì)，和/或分別針對(duì)IL-6基因SNP位點(diǎn)rsl800796、rsl800797和rsl800795的引物對(duì)。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述針對(duì)IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs4845617的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 1 2所示，針對(duì)IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs2228145的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 3 4所示；針對(duì)IL-6基因SNP位點(diǎn)rs 1800796的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 5 6所示；針對(duì)IL-6基因SNP位點(diǎn)rsl800797的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 7 8所示；針對(duì)IL-6基因SNP位點(diǎn) rsl800795的引物對(duì)的核酸序列如SEQ ID No. 9 10所示。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述TaqDNA聚合酶為real start酶。
9.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述HRM熒光染料為EvaGreen、 Syto9> Resolight 禾口 SupperGreen 中之一。
10.一種類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性的檢測(cè)方法，包括下列步驟a)基因組DNA的抽提；b)PCR檢測(cè)PCR 反應(yīng)體系包含 10-30ng 基因組 DNA，IXPCR Buffer,0. 25UTaq DNA 聚合酶，0. 2mM dNTP，0. 3μΜ上下游引物，IXHRM熒光染料，Mg2+濃度根據(jù)HRM熒光染料的種類(lèi)不同變化；PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性95°C 2min，變性94°C lOsec，退火延伸60°C 30sec，共 30-40個(gè)循環(huán)；c)HRM檢測(cè)條件為96°C 30sec,50°C 30sec，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從83°C到90°C，溫度上升率 0. 05 0C /s ；d)基因分型依據(jù)熔解曲線峰型的改變進(jìn)行基因分型；其中所述上下游引物為分別針對(duì)IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs4845617和rs22^145的引物對(duì)，和/或分別針對(duì)IL-6基因SNP位點(diǎn)rsl800796、rsl800797和rsl800795的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及IL-6R基因SNP位點(diǎn)的用途及其試劑盒和檢查方法。IL-6R基因SNP位點(diǎn)在制備診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性的檢測(cè)試劑盒中的用途。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)位于IL-6R基因SNP位點(diǎn)rs4845617和rs2228145與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。因此在此基礎(chǔ)上提出一種通過(guò)SNP來(lái)檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感風(fēng)險(xiǎn)性的方法和試劑盒，并且經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證，本檢測(cè)方法具有可行性，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒具有良好靈敏性、穩(wěn)定性和特異性。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒可對(duì)正常人群進(jìn)行類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性的篩查，能有效起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、早期診斷的作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102517383SQ201110412140
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者尤崇革, 施星臣, 施鑫鶴, 謝小冬 申請(qǐng)人:尤崇革, 謝小冬