專利名稱：短雙歧桿菌及食品中甲胺磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲胺磷農(nóng)藥的微生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種短雙歧桿菌菌株及以該菌株為工作菌株進(jìn)行食品中甲胺磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，農(nóng)藥殘留超標(biāo)已成為我國當(dāng)前食品安全的突出問題之一。僅2010年以來，我國發(fā)生“海南毒豇豆”、“青島檢出1930千克韭菜農(nóng)藥超標(biāo)”等一系列農(nóng)藥殘留引發(fā)的食品安全事件；我國每年因食品中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)造成的中毒事件屢屢發(fā)生，因此，對(duì)食品中農(nóng)藥殘留及時(shí)、準(zhǔn)確地分析檢測(cè)事關(guān)重大，建立快速、簡便、安全、準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)是食品安全發(fā)展的必然需求。甲胺磷是一種高效、持效期長、內(nèi)吸性強(qiáng)的廣譜性的有機(jī)磷殺蟲劑，適用于蔬菜、 茶樹、水稻、小麥等作物，能有效防治多種害蟲。但甲胺磷的過量使用，使其在蔬菜水果中高殘留，給人們的健康帶來巨大的威脅，因此我國已限量使用，檢測(cè)食品中甲胺磷殘留量列為殘留監(jiān)控重點(diǎn)。目前，針對(duì)食品甲胺磷農(nóng)藥殘留一般有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法 (HPLC)、分光光度計(jì)、化學(xué)發(fā)光法、酶抑制法、毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)等。用上述方法檢測(cè)存在儀器設(shè)備復(fù)雜、樣本前處理和測(cè)定操作繁瑣的缺陷，設(shè)備成本大，檢測(cè)費(fèi)用高，對(duì)檢測(cè)人員的要求也高，不適合大量樣本篩檢，不利于在基層食品檢測(cè)部門推廣應(yīng)用。開發(fā)一種操作方便、費(fèi)用低、可靠、可用大量檢測(cè)樣品中甲胺磷的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。而其首要一環(huán)是篩選一種對(duì)甲胺磷普遍敏感且敏感性穩(wěn)定、檢測(cè)限低、生長迅速地指示菌。迄今為止，尚無篩選出甲胺磷敏感性高、特異性高的雙歧桿菌工作菌株及其在食品中甲胺磷殘留檢測(cè)應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是篩選出不易受雜菌污染影響并對(duì)甲胺磷農(nóng)藥敏感的雙歧桿菌菌株，并據(jù)此建立一種簡單、快速、靈敏度高、能夠普遍推廣應(yīng)用的以該菌株為工作菌株進(jìn)行食品中甲胺磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法，該方法采用甲胺磷對(duì)發(fā)酵的抑制作用來確認(rèn)食品樣品中是否含有的甲胺磷殘留，可以有效地檢測(cè)食品中殘留的甲胺磷農(nóng)藥。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一株對(duì)甲胺磷敏感性高并應(yīng)用于甲胺磷檢測(cè)的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve) LJM-006 CGMCC No. 5418。本發(fā)明的短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve) LJM-006,于 2011 年 10 月 28 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5418。本發(fā)明的短雙歧桿菌LJM-006分離于一名浙江省健康青年人糞便中。本發(fā)明的短雙歧桿菌LJM-006菌株具有下述微生物學(xué)特征(1)菌落形態(tài)LJM-006菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質(zhì)地軟、邊緣整齊，直徑1-1. 5mm;
(2)個(gè)體形態(tài)為不規(guī)則G+無芽孢桿菌，有直桿、彎桿、火柴頭狀、啞鈴形狀和大雁狀， 其中以大雁狀為主；
(3)生理生化特征D-核糖(+) ；L-阿拉伯糖(一)；乳糖(+ )；纖維二糖(一)； 松三糖(+ )；棉籽糖(+ )；山梨醇(一)；淀粉(一)；葡萄糖酸鈉(一)；木糖(一)；甘露糖(十)；果糖(十)；半乳糖(十)；蔗糖(十)；麥芽糖(十)；海藻糖(一)；密二糖 (+ )；甘露醇(+ )；菊糖(一)；水楊素(一)；F6PH(酶(+ )；對(duì)氧的反應(yīng)(在好氣固體培養(yǎng)基上不生長)；硝酸鹽還原(一)；觸酶(一)；靛基質(zhì)反應(yīng)(一)；
(4)厭氧下生長良好，有氧環(huán)境中不生長。最適生長溫度37-41°C；最低生長溫度 25-280C ；最高 43-450C ；生長最適 pH 6. 5-7. 0 ；在 ρΗ4· 5-5. 0 或 8. 0-8. 5 不生長。LJM-006菌株與同屬同種標(biāo)準(zhǔn)菌株相比對(duì)甲胺磷敏感性提高了 100倍以上。本發(fā)明還提供一種食品中甲胺磷殘留的檢測(cè)方法，所述方法包括以下步驟
(1)菌株活化將上述短雙歧桿菌LJM-006菌株接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的PH值至6. 8^7. 2，于35 37°C下進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)；
(2)菌懸液制備取步驟(1)所得短雙歧桿菌LJM-006接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，35士2°C厭氧培養(yǎng)M小時(shí)，用滅菌生理鹽水將菌苔洗下，制成懸液，調(diào)整其0D_值至 0. 25 0. 35，置2-8°C冰箱中保存；
(3)檢測(cè)管制備以重量計(jì)，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，檸檬酸二銨 2g，吐溫-80 lmL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6. 5，115°C高壓滅菌15-20分鐘，冷卻溫度為 5(T65°C，并迅速取10 mL上述液體，注入10 mL試管內(nèi)，作為檢測(cè)管，于(T4°C下直立靜置， 密封后(T4°C下保存、備用；
(4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程選擇濃度為0mg/L、0. 25mg/L、0. 5 mg/LU. 0 mg/ LU. 5 mg/L、2.0 mg/L、4. 0 mg/L的甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中Omg/L為陰性對(duì)照。取以上標(biāo)準(zhǔn)品溶液2(Γ100 μ L加入所述檢測(cè)小管內(nèi)，37°C厭氧培養(yǎng)纊12h，測(cè)定樣品反應(yīng)管和陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值；測(cè)定樣品反應(yīng)管和陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值的具體步驟為①收集菌體取步驟(2)所得菌懸液30 mL于各離心管中，4°C、8，000 r/min離心10 min，棄上清液、收集菌體，用PH 6. 5的PBS緩沖液洗滌菌體2次；②菌體破碎離心管中加0.7 mL、pH 6. 5的PBS和0. 3 mL、0· 45% (質(zhì)量體積比，W/V)的CTAB,混勻，作用10 min,結(jié)束后放置冰上備用；③取上述步驟②菌體破碎后液體，即粗酶液0.25 mL加入各0.25 mL的NaF (3 g/ L)、碘乙酸鈉(5 g/L)和果糖-6-磷酸二鈉(80 g/L)，混勻，置于37°C下孵育30 min ；④結(jié)束后，加入1. 5 mL的鹽酸-羥胺(130 g/L)，混勻，室溫靜置10 min ；⑤然后加入各1 mL 的TCA(15%，質(zhì)量體積比)、HCl (4 mol/L)和FeCl3 (5%，質(zhì)量體積比，用0. 1 mol/L HCl配制)，混勻，4°C、10，000 r/min離心15 min后，用722分光光度計(jì)測(cè)定OD值，檢測(cè)光的波長為500 nm，陰性對(duì)照反應(yīng)管以蒸餾水代替，其余操作同上。Bz^l (B值為樣品反應(yīng)管的OD5tltl 值，B0值為陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值)為縱坐標(biāo)Y，甲胺磷濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)X (單位是mg/L)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立甲胺磷含量與B/ B。的線性回歸方程Y= — M.68x + 66.72， 甲胺磷的線性范圍為0. 0廣100mg/L，檢測(cè)下限達(dá)到0. lmg/L，R2為0. 9902 ；(5)樣品前處理取待檢的食品樣品勻漿組織5g，用無菌1%磷酸鹽緩沖液(酸度為 ρΗ6.0 7.2)20 mL稀釋，漩渦混勻，于80°C水浴加熱5 min，冷卻后于5，000 r/min離心15 min，取上清液作為供試樣品液；
(6)樣品檢測(cè)取步驟( 所得供試樣品液2(Γ 00μL加到所述檢測(cè)小管中，密閉封口后于35士2°C厭氧培養(yǎng)纊10小時(shí)，并測(cè)定樣品反應(yīng)管和陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值，根據(jù)所得各樣品的BziBci值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其對(duì)應(yīng)的甲胺磷質(zhì)量濃度，或代入步驟(4)所得回歸方程計(jì)算樣品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值X，求其反對(duì)數(shù)，即為樣品中所含甲胺磷的質(zhì)量濃度。果糖-6-磷酸酮解酶(F6PPK)是雙歧桿菌屬的雙歧代謝途徑中的特征性酶，通過特異的“果糖-6-磷酸支路”(又稱為雙歧支路)對(duì)葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，這與其它細(xì)菌利用醛縮酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶明顯不同。該酶催化果糖6-磷酸鹽分解為乙酰磷酸鹽和4-磷酸赤蘚糖。葡萄糖不經(jīng)過糖酵解途徑而經(jīng)過F6PH(酶進(jìn)行雙歧代謝途徑最終生成乳酸和醋酸，即雙歧支路、果糖-6-磷酸支路，該酶已廣泛應(yīng)用于雙歧桿菌的鑒定與活菌計(jì)數(shù)。本發(fā)明的工作菌株為短雙歧桿菌LJM-006，已于2011年10月觀日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. M18。本發(fā)明所述的食品樣品包括白菜、茄子、黃瓜、南瓜、冬瓜、蘋果、梨子、桃子等蔬菜水果。本發(fā)明使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程是通過下述的方法得到的利用甲胺磷的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配置濃度分別為 0. 25mg/L、0. 5mg/L、l. Omg/LU. 5mg/L、2. 0mg/L、4. O mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中Omg/L為陰性對(duì)照。取以上標(biāo)準(zhǔn)品溶液20yL加入檢測(cè)小管內(nèi)，37°C厭氧培養(yǎng) 8 12h，測(cè)定樣品反應(yīng)管和陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值(F6PH(酶活)，以F6PH(酶活抑制率B/ B0 (B值為樣品反應(yīng)管的OD5tltl值，Btl值為陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值)為縱坐標(biāo)Y，甲胺磷濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到了標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y= —M.68x + 66. 72(Y B/ B0比值，B值為樣品反應(yīng)管的OD5tltl值，Btl值為陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值，X 食品中所含有甲胺磷的對(duì)數(shù)濃度，其單位是mg/L)，線性范圍為0. 0ri00mg/L, R2為0. 9902。本發(fā)明方法中，重復(fù)四次測(cè)定甲胺磷含量己知的蔬菜或水果樣品，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7. 80，表明本發(fā)明方法的檢測(cè)精確度較高。考察本發(fā)明方法的回收率，加入40yL、100mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液于甲胺磷含量己知的蔬菜或水果樣品中，重復(fù)分析四次，經(jīng)計(jì)算得到的回收率為85. 94。通過測(cè)定甲胺磷最低濃度的定量溶液，得到本發(fā)明方法的最低檢測(cè)限為0. lmg/L。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果
(1)本發(fā)明短雙歧桿菌LJM-006具有以下特點(diǎn)①對(duì)甲胺磷敏感性高、特異性好；②菌株穩(wěn)定性好；③專性厭氧菌，發(fā)酵過程中不易受雜菌污染影響；
(2)本發(fā)明方法的原理是基于甲胺磷農(nóng)藥對(duì)雙歧桿菌具有抑制作用，并利用特性，雙歧桿菌對(duì)樣品進(jìn)行發(fā)酵處理，跟蹤發(fā)酵過程，根據(jù)其發(fā)酵特性來判斷樣品中有無甲胺磷農(nóng)藥的殘留；該檢測(cè)判斷方法經(jīng)濟(jì)、簡便、快捷、準(zhǔn)確，適合食品質(zhì)量安全控制，實(shí)用性非常強(qiáng)；
(3)本發(fā)明樣品前處理簡單，能同時(shí)篩檢大量食品樣品；
(4)本發(fā)明檢測(cè)方法簡便易行，具有靈敏度高，精確度高等特點(diǎn)，回收率均大于70%，變異系數(shù)在10%以內(nèi)，符合食品甲胺磷殘留篩檢的準(zhǔn)確度和精密度要求，完全適合食品中甲胺磷殘留的檢測(cè)。


圖1為甲胺磷檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的發(fā)明。除非另有說明，本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1 短雙歧桿菌LJM-006菌株的分離與鑒定
以一名浙江省健康青年人的糞便作為分離樣品，在MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37°C厭氧條件下，4 涂布分離培養(yǎng)，獲得本發(fā)明所述的短雙歧桿菌LJM-006，鑒定為短雙歧桿菌，該菌株已于2011年10月觀日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5418。MRS瓊脂培養(yǎng)基的配方蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，檸檬酸二銨 2g，吐溫-80 lmL，瓊脂15g，蒸餾水1L，調(diào)pH至7. 0，115°C滅菌15分鐘。本發(fā)明的LJM-006菌株具有下述微生物學(xué)特征
(1)菌落形態(tài)LJM-006菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質(zhì)地軟、邊緣整齊，直徑1-1. 5mm ；
(2)個(gè)體形態(tài)為不規(guī)則G+無芽孢桿菌，有直桿、彎桿、火柴頭狀、啞鈴形狀和大雁狀， 其中以大雁狀為主；
(3)生理生化特征D-核糖(+) ；L-阿拉伯糖(+ )；乳糖(+ )；纖維二糖(一)； 松三糖(+ )；棉籽糖(+ )；山梨醇(一)；淀粉(一)；葡萄糖酸鈉(一)；木糖(+ )；甘露糖(一)；果糖(十)；半乳糖(十)；蔗糖(十)；麥芽糖(十)；海藻糖(一)；密二糖 (+ )；甘露醇(+ )；菊糖(一)；水楊素(一)；F6PH(酶(+ )；對(duì)氧的反應(yīng)(在好氣固體培養(yǎng)基上不生長)；硝酸鹽還原(一)；觸酶(一)；靛基質(zhì)反應(yīng)(一)；
(4)厭氧下生長良好，有氧環(huán)境中不生長。最適生長溫度37-41°C；最低生長溫度 25-280C ；最高 43-450C ；生長最適 pH 6. 5-7. 0 ；在 ρΗ4· 5-5. 0 或 8. 0-8. 5 不生長。試驗(yàn)1 敏感性試驗(yàn)
采用紙片瓊脂擴(kuò)散(K-B)法，選取不同濃度的甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)液，以改良MRS瓊脂培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基配方見實(shí)施例1，以本發(fā)明短雙歧桿菌LJM-006為測(cè)試菌，置于37°C培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h后觀察LJM-006菌株的生長情況，用紙片瓊脂擴(kuò)散法做甲胺磷敏感性試驗(yàn)，測(cè)定甲胺磷對(duì)LJM-006菌株的抑菌性能。上述試驗(yàn)做3次重復(fù)，以同屬同種的短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為對(duì)照。表1 敏感性試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一株短雙歧桿菌，其特征在于，所述菌株為短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve) LJM-006,已于2011年10月觀日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏編號(hào)為CGMCC No. M18。
2.一種食品中甲胺磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)菌株活化將權(quán)利要求1所述的短雙歧桿菌LJM-006菌株接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH值至6. 8^7. 2，于35 37°C下進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)；(2)菌懸液制備取步驟(1)所得短雙歧桿菌LJM-006接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，35士2°C厭氧培養(yǎng)M小時(shí)，用滅菌生理鹽水將菌苔洗下，制成懸液，調(diào)整其0D_值至 0. 25 0. 35，置2-8°C冰箱中保存；(3)檢測(cè)管制備以重量計(jì)，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，檸檬酸二銨 2g，吐溫-80 lmL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6. 5，115°C高壓滅菌15-20分鐘，冷卻溫度為 5(T65°C，并迅速取10 mL上述液體，注入10 mL試管內(nèi)，作為檢測(cè)管，于(T4°C下直立靜置， 密封后(T4°C下保存、備用；(4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程選擇濃度為0mg/L、0.25mg/L、0.5mg/LU. 0 mg/ LU. 5 mg/L、2.0 mg/L、4. 0 mg/L的甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，且Omg/L為陰性對(duì)照；取所述甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液2(Γ100 μ L加入所述檢測(cè)小管內(nèi)，37°C厭氧培養(yǎng)纊12h，分別測(cè)定樣品反應(yīng)管和陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值；以Bz^l為縱坐標(biāo)Y，甲胺磷濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立甲胺磷含量與B/ B。的線性回歸方程Y=—對(duì).6 + 66. 72;其中B值為樣品反應(yīng)管的OD5tltl值，B0值為陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值，甲胺磷的線性范圍為0. 0ri00mg/L, 檢測(cè)下限達(dá)到0. lmg/L，R2為0. 9902 ；(5)樣品前處理取待檢的食品樣品勻漿組織5g，用無菌1%磷酸鹽緩沖液20mL稀釋， 漩渦混勻，于80°C水浴加熱5 min，冷卻后于5，000 r/min離心15 min，取上清液作為供試樣品液；(6)樣品檢測(cè)取步驟( 所得供試樣品液2(Tl00yL加到所述檢測(cè)小管中，密閉封口后于35士2°C厭氧培養(yǎng)纊10小時(shí)，并測(cè)定樣品反應(yīng)管和陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值，根據(jù)所得各樣品的BziBci值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其對(duì)應(yīng)的甲胺磷質(zhì)量濃度，或代入步驟(4)所得回歸方程計(jì)算樣品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值X，求其反對(duì)數(shù)，即為樣品中所含甲胺磷的質(zhì)量濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述食品中甲胺磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)所述測(cè)定樣品反應(yīng)管和陰性對(duì)照反應(yīng)管的OD5tltl值的具體步驟為①收集菌體取步驟(2)所得菌懸液30mL于各離心管中，4°C、8，000 r/min離心10 min，棄上清液、收集菌體，用pH 6. 5^7. 5的PBS緩沖液洗滌菌體2次；②菌體破碎離心管中加0.7 mL、pH 6. 5的PBS和0.3 mL、質(zhì)量體積比為0. 45%的 CTAB，混勻，作用10 min，結(jié)束后放置冰上備用；③取上述步驟②菌體破碎后液體，即粗酶液0.25mL加入各0.25 mL的3 g/L NaF,5 g/L碘乙酸鈉和80 g/L果糖-6-磷酸二鈉，混勻，置于37°C下孵育2(T30 min ；④結(jié)束后，加入1.5 mL、130 g/L的鹽酸羥胺，混勻，室溫靜置10 min ；⑤然后加入各1mL、質(zhì)量體積比為15%的TCA、4 mol/L HCl和質(zhì)量體積比為5%的FeCl3,混勻，4°C、8，000 10，000 r/min離心15 20 min后，用722分光光度計(jì)測(cè)定OD值，其中檢測(cè)光的波長為500 nm，陰性對(duì)照反應(yīng)管以蒸餾水代替樣品，其余操作同上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述食品中甲胺磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟⑤所述質(zhì)量體積比為5%的FeCl3由0. 1 mol/L 0. 15 mol/L的HCl配制而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述食品中甲胺磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，其特征在于，步驟( 所述食品樣品包括白菜、茄子、黃瓜、南瓜、冬瓜、蘋果、梨子或桃子。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述食品中甲胺磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法，其特征在于，其中步驟(5) 所述1%磷酸鹽緩沖液的酸度為ρΗ6. (Γ7. 2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種短雙歧桿菌及利用該菌株進(jìn)行食品中甲胺磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。所篩選出的菌株為LJM-006菌株，保藏號(hào)為CGMCC No.5418；LJM-006菌株對(duì)甲胺磷超敏感；以該菌株為工作菌所建立的甲胺磷殘留檢測(cè)方法包括(1)菌株活化；(2)菌懸液制備；(3)檢測(cè)管制備；(4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程；(5)樣品前處理；(6)樣品檢測(cè)等步驟。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、結(jié)果易判斷，與高效液相色譜法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果符合率高，適合樣本篩檢，更符合我國農(nóng)藥殘留檢測(cè)部門的大量樣品篩檢要求。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102517230SQ20111041149
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者劉佳明, 孫晶, 曹建明, 杜季梅 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院