專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的快速高通量篩選技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法。
背景技術(shù)：
纖維素是地球上豐富且可再生的生物聚合物。由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所以纖維素降解過(guò)程依靠復(fù)雜的多酶體系即內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶與β -葡萄糖苷酶三種酶的協(xié)同作用才能完成，其中葡萄糖苷酶是此過(guò)程的限速酶。純培養(yǎng)分離技術(shù)與構(gòu)建基因文庫(kù)技術(shù)是用于挖掘環(huán)境樣品中微生物資源的主要策略。目前對(duì)于葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的主要篩選方法是基于功能篩選，已有文獻(xiàn)報(bào)道采用功能篩選法挖掘β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的研究策略是基于熒光法與七葉苷顯色底物平板法。使用熒光底物(如MUGG-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷))篩選葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌費(fèi)力、經(jīng)濟(jì)成本高；使用七葉苷平板法篩選β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌工作量大、效率低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力；而選用對(duì)硝基酚葡萄糖苷 (PNPG)作為底物用于葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的高通量篩選尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。日前pNPG(對(duì)硝基酚-β-葡萄糖苷)主要用于葡萄糖苷酶的酶活測(cè)定，本發(fā)明基于PNPG與β-葡萄糖苷酶可發(fā)生黃色顯色反應(yīng)，并且反應(yīng)產(chǎn)物在400-420nm處有最大吸光值。選用pNPG作為反應(yīng)底物篩選葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌，具有簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)、結(jié)果可信等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前篩選葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法存在耗時(shí)、費(fèi)力、效率低以及成本較高等問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)提供一種基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法，從而有效解決上述存在的問(wèn)題，僅限應(yīng)用于葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的快速高通量初篩，復(fù)篩需進(jìn)一步驗(yàn)證。本發(fā)明將公開(kāi)一種過(guò)程簡(jiǎn)單，操作方便，成本低，菌株初篩快且適合于工業(yè)化大規(guī)模從備選材料中篩選出β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法，它以動(dòng)物糞便或土壤樣品為初篩物，經(jīng)菌株復(fù)活培養(yǎng)、擴(kuò)培、加入PNPG反應(yīng)、顯色后根據(jù)顏色為初步指標(biāo)判斷該菌株是否產(chǎn) β-葡萄糖苷酶。本發(fā)明所述的是一種基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法，其操作步驟如下(1)將待篩選的單菌落在20-50°C，120-220rpm下液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株復(fù)活；(2)復(fù)活菌液在 20-50°C，120-220rpm 下進(jìn)行擴(kuò)培 4_18h ；(3)取一 96孔板添加一定體積菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，按比例轉(zhuǎn)接復(fù)活菌液，20-50°C， 120-220rpm培養(yǎng)4-1 進(jìn)行擴(kuò)培；(4)向96孔板擴(kuò)培菌液中加入一定體積的反應(yīng)底物pNPG(同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照)，20-50 0C，120-220rpm,反應(yīng)一定時(shí)間；(5)添加一定體積Na2CO3溶液終止反應(yīng)；(6)室溫下將反應(yīng)液轉(zhuǎn)接96孔酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀上檢測(cè)其吸光值，以陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照吸收值為參照，可據(jù)數(shù)值大小判斷不同菌株所產(chǎn)的葡萄糖苷酶的酶活力，確認(rèn)初篩結(jié)果。上述基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法中，所述96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌一般指細(xì)菌；菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基一般指細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基。上述基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法中，所述待篩選菌株的復(fù)活與擴(kuò)培具體步驟是向菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接接種液比例為0. 5% -10%。上述基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法中，所述顯色是向擴(kuò)培菌液中添加反應(yīng)底物PNPG的比例一般為-5%，pNPG的終濃度范圍一般為0. I-IOmmol/ L，與pNPG顯色反應(yīng)時(shí)間在10-90min。上述基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法中，所述終止反應(yīng)是向擴(kuò)培菌液中添加0. 5-2. 5倍體積Na2CO3溶液，Na2CO3溶液的終濃度范圍一般為0. 5-2. 5mol/ L0上述基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法中，所述陰性對(duì)照是細(xì)菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接0.5%-10%不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌的菌液；陽(yáng)性對(duì)照是細(xì)菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接 0. 5% -10%濃度為200U/mL的β -葡萄糖苷酶或β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的菌液。上述基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法中，所述細(xì)菌培養(yǎng)基一般指LB培養(yǎng)基、SOB培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基、2 X YT培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、GYT培養(yǎng)基、Μ9培養(yǎng)基、NXCYM培養(yǎng)基、NZNM培養(yǎng)基或NZM培養(yǎng)基。技術(shù)效果1、該法采用簡(jiǎn)單的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，使其篩選方法簡(jiǎn)單、可靠。2、與MUG熒光法、七葉苷平板法相比，采用pNPG顯色成本低廉，耗費(fèi)試劑少。3、該法充分利用酶標(biāo)儀與96孔酶標(biāo)板的高通量特性，使其篩選方法非常快速準(zhǔn)確，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)人員的時(shí)間。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 從牛糞便微生物質(zhì)粒宏基因組文庫(kù)中快速篩選產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的活性克隆將芒草喂養(yǎng)牛糞便微生物質(zhì)粒宏基因組文庫(kù)(含8，115個(gè)單克隆)樣品使用96 孔板保存于_80°C低溫冰箱。配制IOOmL的含Ampicillin(氨芐青霉素)(100mg/mL)LB 培養(yǎng)基并滅菌，隨機(jī)從其文庫(kù)中取部分樣品370個(gè)單菌落進(jìn)行復(fù)活，在96孔板中分別加入10(^1^含々11^(^11111(氨芐青霉素)(1001^/1^)的LB培養(yǎng)基與5 μ L保存菌液，37 °C， 120-150rpm培養(yǎng)10-1 ；復(fù)活菌液進(jìn)行擴(kuò)培，向96孔板每個(gè)微孔中分別加入93 μ L含 Ampicillin (100mg/mL) LB 培養(yǎng)基與待篩菌樣品菌液 4 μ L，37°C，120_150rpm 培養(yǎng) 6_8h ；進(jìn)行顯示反應(yīng)，在96孔板每個(gè)微孔中加入3 μ L IOmM pNPG,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照。 陰性對(duì)照為93 μ L含Ampicillin (100mg/mL)LB培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接4 μ L不產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的菌液，陽(yáng)性對(duì)照為93 μ L含Ampicillin (100mg/mL) LB培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接4 μ L 200U/mL標(biāo)準(zhǔn)濃度的β -葡萄糖苷酶。反應(yīng)液37°C，120-150rpm,反應(yīng)60min ；加入100 μ L IM Na2CO3溶液終止反應(yīng)5min。觀察溶液顏色變化，以溶液顯黃色為初步指標(biāo)判斷該重組子是否含編碼 β -葡萄糖苷酶的功能基因。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)到96孔酶標(biāo)板上使用普通酶標(biāo)儀于405nm處測(cè)定樣品吸光值。同時(shí)，測(cè)定陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照在405nm處的吸光值。結(jié)果表明初篩獲得 3株(M16、B5、L9)陽(yáng)性克隆。對(duì)比施例1 用七葉苷平板法從牛糞便微生物質(zhì)粒宏基因組文庫(kù)中快速篩選產(chǎn) β-葡萄糖苷酶的活性克隆配制40mL的含Ampicillin (氨芐青霉素)(100mg/mL) LB培養(yǎng)基并滅菌，隨機(jī)從其文庫(kù)中取部分樣品370個(gè)單菌落進(jìn)行復(fù)活，在96孔板中分別加入100 μ L含Ampicillin (氨芐青霉素)(100mg/mL)的LB培養(yǎng)基與5 μ L保存菌液，37°C，120-150rpm培養(yǎng)10_12h ；配制 3700mL七葉苷培養(yǎng)基滅菌后制370個(gè)培養(yǎng)平板；各取5 μ L復(fù)活菌液直接點(diǎn)在含有七葉苷培養(yǎng)基的平板上，于37°C倒置培養(yǎng)Μ-4 !后，對(duì)已接種的370個(gè)培養(yǎng)平板進(jìn)行逐個(gè)觀察。 根據(jù)菌落周圍出現(xiàn)黑色水解圈初步判該菌株是否產(chǎn)葡萄糖苷酶。結(jié)果用七葉苷平板法篩選文庫(kù)初篩得到1株(Μ16)陽(yáng)性克隆。實(shí)施例2 白蟻腸道微生物中產(chǎn)β -葡萄糖苷酶功能菌株的快速篩選湖南省植物園朽木林中收集白蟻，在超凈工作臺(tái)中取白蟻腸道微生物并將其溶于無(wú)菌水中，充分震蕩混勻，然后將其梯度稀釋105，IO6倍，再分別吸取0. ImL的稀釋液涂布到 LA平板上，置37°C培養(yǎng)12-24h ；分離得到243株細(xì)菌。配制300mL LB培養(yǎng)基并滅菌，將243株細(xì)菌分別接種于ImL LB液體培養(yǎng)基中， 37°C，180-200rpm培養(yǎng)ΙΟ-ia!進(jìn)行復(fù)活；復(fù)活菌液進(jìn)行擴(kuò)培，即在96孔板中分別加入 93 μ L LB培養(yǎng)基與4μ L復(fù)活菌液，37°C，120_150rpm培養(yǎng)8_12h ；在96孔板中依次加入 3μ L IOmM反應(yīng)底物pNPG，37°C，120-150rpm反應(yīng)40min，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照為93 μ L LB培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接4 μ L不產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的菌液，陽(yáng)性對(duì)照為93 μ L LB 培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接4μ L 200U/mL標(biāo)準(zhǔn)濃度的β -葡萄糖苷酶，37°C，120_150rpm，反應(yīng)30min ； 加入100 μ L IM NaCO3溶液終止反應(yīng)5min。觀察溶液顏色變化，以溶液顯黃色為指標(biāo)判斷菌落含編碼β-葡萄糖苷酶功能基因。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)到96孔酶標(biāo)板上使用酶標(biāo)儀于405nm 處測(cè)定樣品吸光值。同時(shí)，測(cè)定陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照在405nm處的吸光值。以pNPG為顯色底物，96孔板高通量篩選初篩得到89株產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的菌株。對(duì)比施例2 用七葉苷平板法從白蟻腸道微生物中產(chǎn)β -葡萄糖苷酶功能菌株的篩選配制M30mL含七葉苷的LB培養(yǎng)基并滅菌，制作成243個(gè)平板，將243株細(xì)菌分別接種于平板上，于37°C倒置培養(yǎng)對(duì)-4他后，對(duì)已接種的對(duì)3個(gè)培養(yǎng)平板進(jìn)行逐個(gè)觀察，初篩選得到73株功能菌株。實(shí)施例3 從牛瘤胃微生物Cosmid文庫(kù)中快速篩選產(chǎn)生β -葡萄糖苷酶的活性克隆芒草喂養(yǎng)牛瘤胃Cosmid宏基因組文庫(kù)(約5，500個(gè)單克隆)樣品使用96孔板保存于-80°C低溫冰箱。隨機(jī)取部分文庫(kù)樣品O70個(gè))進(jìn)行復(fù)活，在96孔板中分別加入10(^1^含々11^(^11111(氨芐青霉素)(1001^/1^)的LB培養(yǎng)基與5 μ L保存菌液，37°C， 120-150rpm培養(yǎng)10-1 ；復(fù)活菌液進(jìn)行擴(kuò)培，向96孔板每個(gè)微孔中分別加入93 μ L含 Ampicillin (100mg/mL) LB 培養(yǎng)基與待篩菌樣品菌液 4 μ L，37°C，120_150rpm 培養(yǎng) 6_8h ；進(jìn)行顯示反應(yīng)，在96孔板每個(gè)微孔中加入3 μ L IOmM pNPG,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照。 陰性對(duì)照為93 μ L含Ampicillin (100mg/mL) LB培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接4 μ L不產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的菌液，陽(yáng)性對(duì)照為93 μ L含Ampicillin (100mg/mL) LB培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接4 μ L 200U/mL標(biāo)準(zhǔn)濃度的β-葡萄糖苷酶。反應(yīng)液37°C，120-150rpm，反應(yīng)90min ；加入IOOyL IM Na2CO3溶液終止反應(yīng)5min。觀察溶液顏色變化，以溶液顯黃色為初步指標(biāo)判斷菌落含編碼β-葡萄糖苷酶的功能基因。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)到96孔酶標(biāo)板上使用酶標(biāo)儀于405nm處測(cè)定樣品吸光值。以 PNPG為顯示底物，使用96孔板高通量篩選文庫(kù)初篩沒(méi)有得到陽(yáng)性克隆。對(duì)比施例3 用七葉苷平板法從牛瘤胃微生物Cosmid文庫(kù)中篩選產(chǎn)生β -葡萄糖苷酶的活性克隆配制2700mL的含Ampicillin (氨芐青霉素)(100mg/mL) LB培養(yǎng)基并滅菌，配制 270個(gè)培養(yǎng)平板，將270株復(fù)活細(xì)菌分別接種于平板上，于37°C倒置培養(yǎng)后，對(duì)已接種的270個(gè)培養(yǎng)平板進(jìn)行逐個(gè)觀察，初篩沒(méi)有得到有編碼β -葡萄糖苷酶的陽(yáng)性克隆。表1各實(shí)驗(yàn)所消耗的化學(xué)試劑表
實(shí)施例1對(duì)比施例1實(shí)施例2對(duì)比施例2實(shí)施例3對(duì)比施例3所耗培養(yǎng)基約 IOOmL約 37OOmL約 300mL約 M30mL約 IOOmL約 2700mLpNPG4mg4mg4mg七葉苷370g243g270gAmpicillin6g3g6g3gβ-葡萄糖苷酶2 OU2 OU2 OUNa2CO3 (碳酸鈉)IgIgIg 附各種試劑配方LB培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL蒸餾水中，以質(zhì)量體積百分比濃度計(jì)，添加蛋白胨 1. O%，酵母提取物0. 5%, NaCl 1. 0%，121°C滅菌30min，室溫放存。IOmM pNPG的配方為每ImL去離子水中，以質(zhì)量體積百分比濃度計(jì)，添加3. Olmg PNPG，溶解后過(guò)濾除菌，-20°C保存。IM Na2CO3溶液的配方為每IOOmL蒸餾水中，以質(zhì)量體積百分比濃度計(jì)，添加 10. 6g Na2CO3,121°C 滅菌 30min，室溫放存。100mg/mL Ampicillin 配方為稱取 Ig Ampicillin 置于 IOmL離心管中，加 5mL滅菌水，充分混合溶解后，定容至10mL，用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌，小份分裝后，_20°C保存。七葉苷培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL蒸餾水中，以質(zhì)量體積百分比濃度計(jì)，添加蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1. 0%，瓊脂糖1. 0-1. 5%，七葉苷0. 10%，檸檬酸高鐵銨0. 25%，121°C滅菌30min，室溫放存。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供一種基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法，步驟包括(1)將待篩選的單菌落在20-50°C，120-220rpm下液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株復(fù)活；(2)復(fù)活菌液在20-50°C，120-220rpm下進(jìn)行擴(kuò)培4_18h；(3)取一96孔板添加一定體積菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，按比例轉(zhuǎn)接復(fù)活菌液，20-50°C， 120-220rpm培養(yǎng)4-1 進(jìn)行擴(kuò)培；(4)向96孔板擴(kuò)培菌液中加入一定體積的反應(yīng)底物pNPG(同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照)，20-50 0C，120-220rpm,反應(yīng)一定時(shí)間；(5)添加一定體積Na2CO3溶液終止反應(yīng)；(6)室溫下將反應(yīng)液轉(zhuǎn)接96孔酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀上檢測(cè)其吸光值，以陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照吸收值為參照，可據(jù)數(shù)值大小判斷不同菌株所產(chǎn)的葡萄糖苷酶的酶活力，確認(rèn)初篩結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟1所述的篩選菌株為細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟2、3中所述待篩選菌株的復(fù)活與擴(kuò)培具體步驟是向菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接接種液比例為0. 5% -10%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟4中顯色是向擴(kuò)培菌液中添加反應(yīng)底物pNPG的比例一般為_(kāi)5%，pNPG的終濃度范圍一般為0. l-10mmol/L,與pNPG顯色反應(yīng)時(shí)間在 10-90min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法，尤其將pNPG用于β-葡萄糖苷酶的高通量篩選。具體包括(1)菌株復(fù)活；(2)復(fù)活菌液擴(kuò)培；(3)顯色反應(yīng)；(4)吸光值測(cè)定等步驟。本發(fā)明能夠以純培養(yǎng)分離技術(shù)與構(gòu)建基因文庫(kù)技術(shù)從不同樣品中挖掘產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物菌株。本發(fā)明使用pNPG用于β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選，與目前文獻(xiàn)所報(bào)道用于β-葡萄糖苷酶篩選的七葉苷平板法與熒光法相比較，具有方便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK102392072SQ20111040561
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者劉虎虎, 盧向陽(yáng), 田云, 趙飛, 辛盛 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)