專利名稱：一種從牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽的方法。
背景技術(shù)：
有“海洋牛奶”之稱的牡蠣，占我國海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的三分之一，有著價格低廉、產(chǎn)量豐富，蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)點。長久以來，人們就認(rèn)識到牡蠣的利用價值，對其進(jìn)行了大力開發(fā)，出現(xiàn)了一系列的牡蠣制品，如凍干牡蠣肉，牡蠣超微粉，牡蠣牛磺酸，牡蠣殼活性鈣，牡蠣肽等。隨著工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，新產(chǎn)品的不斷出現(xiàn)，牡蠣的應(yīng)用也越來越廣泛，但對牡蠣的應(yīng)用最好莫過于利用其高蛋白質(zhì)含量生產(chǎn)多肽。人體很多活性物質(zhì)都是以肽的形式存在的，沒有肽，就沒有活性，就沒有生命。肽涉及人體的激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長和生殖各領(lǐng)域，其重要性在于調(diào)節(jié)體內(nèi)各個系統(tǒng)和細(xì)胞的生理功能，激活體內(nèi)有關(guān)酶系，促進(jìn)中間代謝膜的通透性，或通過控制DNA轉(zhuǎn)錄或影響特異的蛋白合成，最終產(chǎn)生特定的生理效應(yīng)。肽是涉及人體內(nèi)多種細(xì)胞功能的重要物質(zhì)。肽可以合成細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能活動。肽在人體作為神經(jīng)遞質(zhì)，傳遞信息。肽可在人體作為運輸工具，將人體所食的各種營養(yǎng)物質(zhì)與各種維生素、生物素、鈣及對人體有益的微量元素輸送到人體各細(xì)胞、器官和組織。肽是人體重要的生理調(diào)節(jié)物，它可全面調(diào)節(jié)人體生理功能， 增強和發(fā)揮人體生理活性，它具有重要的生物學(xué)功能。肽對人的細(xì)胞活性、功能活動、生命存在非常重要。然而用傳統(tǒng)的方式生產(chǎn)多肽，其分子量無法控制，功能性難以體現(xiàn)，分子量無法控制，生產(chǎn)的多肽有苦味，這種多肽不但沒有保健作用，而且有副作用。在科技飛速發(fā)展的今天，用傳統(tǒng)的方式合成肽已經(jīng)落后了，已不適應(yīng)現(xiàn)代科技對生產(chǎn)多肽的要求，引領(lǐng)多肽生成的方法是酶法。利用酶法水解制備的蛋白水解產(chǎn)物富含具有多種生理活性的多肽和氨基酸。這些肽具有優(yōu)良的持水性、凝膠性、乳化性、溶解性、滲透性及抗氧化性，已在世界范圍內(nèi)引起關(guān)注，成為科技界、醫(yī)學(xué)界、營養(yǎng)學(xué)界、食品界、企業(yè)界研究、開發(fā)、生產(chǎn)的熱點，酶法多肽產(chǎn)業(yè)是跨世紀(jì)的一種新的朝陽產(chǎn)業(yè)，發(fā)展前景非常可觀。國內(nèi)針對牡蠣的應(yīng)用開發(fā)已開展了很多研究工作，如陳騫、楊瑞金、顧聆琳“牡蠣糖原的研究(I)——牡蠣糖原的分離提取和化學(xué)組成”《食品科學(xué)》，2005，26 (6) :99-101。 又如汪秋寬、何云海、徐玲等“牡蠣糖蛋白的純化分離研究”，《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報》，2007， 38(2) :211-214。再如劉亞南、張志勝、佟海菊等“響應(yīng)面法優(yōu)化中性蛋白酶提取牡蠣?；撬崦附夤に嚄l件”，《食品科學(xué)》，2011，7 :25。但是，這些研究工作及牡蠣產(chǎn)品大多只關(guān)注牡蠣中牛磺酸的生理功能及營養(yǎng)價值或牡蠣的全營養(yǎng)功能方面，而且在生產(chǎn)過程中采用的是傳統(tǒng)繁雜的分離技術(shù)及工藝方法，產(chǎn)品中的活性成分含量相對較低。又如王一兵、柯珂、何碧娟等“廣西近江牡蠣酶解工藝研究”《食品研究與開發(fā)》，2011,32 :16，其采用胰蛋白酶制備的方法是超聲波方法，還需要特殊的設(shè)備。又如汪秋寬、宋琳琳、徐玲等“牡蠣抗氧化活性肽的酶解工藝研究”《大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報》，2009，24( 95)中的工藝研究目的在于 “以木瓜蛋白酶和中性蛋白酶為工具酶，尋找最佳的抗氧化活性產(chǎn)物”，結(jié)果表明當(dāng)時間為150min、酶用量為6%、溫度為45°C、pH為7. 0時，木瓜蛋白酶酶解液的抗氧化活性最強。這些文獻(xiàn)公開的技術(shù)，主要針對生牡蠣，且其操作步驟復(fù)雜、煩瑣；所得產(chǎn)物分子量范圍與本發(fā)明的產(chǎn)物特征均不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)方式生成的多肽所產(chǎn)生的缺陷，進(jìn)而對酶催化水解進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，從而提供一種簡單、有效、安全且產(chǎn)率較高的從牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽的方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽的方法，具體包括如下步驟1)溶酶稱取一定量牡蠣提取物粉末，加入一定量的適合溫度的水完全溶解。稱取木瓜蛋白酶加入牡蠣溶液中，攪拌均勻，用酸度計測定PH值，并用醋酸調(diào)節(jié)pH值至弱酸性；所述溶酶所用水加入倍數(shù)為牡蠣提取物的重量的8 12倍，優(yōu)選10倍；所述木瓜蛋白酶加入量為牡蠣提取物的重量比優(yōu)選7% 20%，最佳用量為 12% ；所述調(diào)節(jié)混合溶液的pH值至5. 6 6. 4，優(yōu)選5. 8 6. 0。2)酶解將上述溶液放于一定溫度的水浴鍋中加熱，恒溫酶解，而后升溫，恒溫滅酶 30min。所述恒溫酶解溫度為45 V 65°C，優(yōu)選55°C 65°C .最佳60 V。所述恒溫酶解時間為60min 120min，優(yōu)選90min 120min。最佳為90min。所述恒溫滅酶溫度為90°C 100°C。本發(fā)明提供的牡蠣提取物酶解方法能有效地提取牡蠣中的多肽，該方法與現(xiàn)有技術(shù)的提取方法相比，其優(yōu)點在于1)操作簡單，成本低廉；2)安全可靠，不會造成環(huán)境污染；3)不減蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值，可保持多肽營養(yǎng)純天然綠色屬性，不含任何化學(xué)物質(zhì)；4)酶解出來的多肽，沒有任何苦味和異味，不會引起過敏。改善原食品蛋白質(zhì)的一些過敏原，可增加原食品蛋白質(zhì)沒有的重要的生物學(xué)功能。5)產(chǎn)率穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有很高的應(yīng)用價值。6)本發(fā)明制備工藝所得到的酶解產(chǎn)物的特征氨基酸主要為精氨酸，其次是組氨酸和谷氨酸。其多肽分子量主要集中在SOOODa以下，其中以1400Da以下的居多，在85%左右，且各種肽的分子量比較集中，主要為小分子多肽，營養(yǎng)價值很高?？梢娖浞肿恿咳菀卓刂疲泻艽蟮臐撛趦r值。


圖1是木瓜蛋白酶溫度-多肽產(chǎn)量曲線圖。圖2是木瓜蛋白酶pH-多肽產(chǎn)量曲線圖。圖3是木瓜蛋白酶時間_多肽產(chǎn)量曲線圖。
圖4是木瓜蛋白酶加酶量-多肽產(chǎn)量曲線圖。圖5是木瓜蛋白酶加水倍數(shù)-多肽產(chǎn)量曲線圖。圖6、7、8、9、10是正交實驗的直觀分析圖。圖11是牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽的相對分子量大小分布圖。
具體實施例方式以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例一不同溫度對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og (牡蠣提取物粉末按照中國專利941011 . 0公開的方法制備)，確定酶解時間為90min，酶解pH值為6.0，加木瓜蛋白酶為10%即0. 5g，加水 50ml。分別在溫度451、501、551、601、651下酶解901^11，取出在溫度為90°C到100°C 水浴中滅酶30min，離心QOOOr/min，15min)取上清液定容至100ml。實施例二不同PH對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og,確定酶解時間為90min，酶解溫度為55°C，加木瓜蛋白酶為10%即0. 5g，加水倍數(shù)為10倍(即50ml)，分別在pH值為5. 6、5. 8、6. 0、6. 2、6. 4 下酶解90min，取出在溫度為90°C到100°C水浴中滅酶30min，離心(轉(zhuǎn)速4000r/min，時間 15min)取上清液定容至100ml。實施例三不同時間對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og，確定酶解溫度60°C，酶解pH值為6. 0，加木瓜蛋白酶為 10% 即 0. 5g，加水倍數(shù)為 10 倍(即 501111)，分別酶解601^11、751^11、901^11、105111士11、 120min，取出在溫度為90°C到100°C水浴中滅酶30min，離心(轉(zhuǎn)速4000r/min，時間15min) 取上清液定容至100ml。實施例四不同加酶量對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og,確定酶解溫度60°C，酶解pH值為6. 0，加木瓜蛋白酶分別為牡蠣提取物粉末重量的1%>2%,4%,6%,8%,10%,12%,14%,16%,18%,20% ο 加水倍數(shù)為牡蠣提取物粉末10倍(50ml)，酶解90min，取出在溫度為90°C到100°C水浴中滅酶30min，離心(轉(zhuǎn)速4000r/min，時間15min)取上清液定容至100ml。實施例五不同加水倍數(shù)對木瓜蛋白酶作用下的牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽效果的影響稱取牡蠣提取物粉末約5. Og,確定酶解溫度60°C，酶解pH值為6. 0，加木瓜蛋白酶為牡蠣提取物粉末重量的10%，加水倍數(shù)為牡蠣提取物粉末重量的8、9、10、11、12倍，酶解 90min，取出在溫度為90°C到100°C水浴中滅酶30min，離心(轉(zhuǎn)速4000r/min，時間15min) 取上清液定容至100ml。分別取實施例一、二、三、四、五中制備的牡蠣提取物酶解液，采用凱式定氮法測定樣品中的酸溶蛋白質(zhì)，甲醛法測定游離性氨基酸態(tài)氮含量，計算粗多肽含量。實施例六粗多肽含量測定及實施例一、二、三、四、五的測定結(jié)果
1、酸溶蛋白質(zhì)的測定方法(凱式定氮法):量取樣品10. 0ml，加入10. Oml 30%的三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置5min。用移液管取10. Oml于離心管中，在4000r/min下離心10分鐘，取全部上清液，加入消化管中，往消化管中滴加催化劑(硫酸鉀硒粉=99 1)適量，搖勻，再加入濃硫酸20ml，消化2小時。取出定容，取20ml消化液于蒸餾管中蒸餾，用2%硼酸溶液吸收，吸收液用0. lmol/L的鹽酸滴定?？瞻讓φ諏嶒灢患訕悠废?，其他操作與樣品相同。計算公式式=(^2)€χ0.0140χ625χ100
1Μ/100Xl-酸溶蛋白質(zhì)含量g/100gVl-樣液定氮所耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，ml ；V2-空白對照定氮所耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，ml ；C-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L ；M-酶解時所稱樣品的質(zhì)量，g。2、游離性氨基酸態(tài)氮含量測定方法(甲醛法)于200ml燒杯中吸取20. Oml酶解液，加60ml蒸餾水，開啟磁力攪拌器，待攪拌穩(wěn)定后把酸度計的復(fù)合電極小心放入燒杯中，用0. lmol/L的氫氧化鈉溶液滴定到酸度計指示PH值為8. 2，準(zhǔn)確加入10. OOml的甲醛溶液，混勻，再用0. lmol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至PH值為9. 2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。同樣量取80ml蒸餾水，先用0. 05mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)pH值至8. 2，再加入100. lmol/L的甲醛溶液，用0. lmol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH值至9. 2，作為試劑空白對照。計算公式式JA=-X100
M15Xl-游離性氨基酸態(tài)氮g/100gVl-樣液定氮所耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，ml ；V2-空白對照定氮所耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，ml ；C-氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L ；M-酶解時所稱樣品的質(zhì)量，g。3、粗多肽含量計算X = Xl-X2*6. 254、測定結(jié)果實施例一、二、三、四、五中制備的牡蠣提取物酶解液中多肽的測定結(jié)果見圖1、圖 2、圖3、圖4及圖5所示。從圖1 圖5可以看出，牡蠣提取物酶解最佳的適合條件是1)最佳酶解溫度優(yōu)選55°C 65°C ；最佳60°C。2)最佳酶解時間優(yōu)選90min 120min，最佳為90min。3)最佳酶解pH值5. 6 6. 4 ；優(yōu)選5. 8 6. 04)最佳加酶量優(yōu)選7% 20%，最佳用量為12%5)最佳加水倍數(shù)優(yōu)選8 12倍，優(yōu)選10倍。
實施例七正交試驗分析結(jié)果通過單因素分析，我們知道牡蠣提取物酶解生產(chǎn)多肽的酶選用木瓜蛋白酶，酶解溫度，時間，PH值，加酶量，加水倍數(shù)等，但各因素的相互作用仍然不是很明確，為了確定酶解的最適條件，設(shè)計5因素4水平的正交試驗，以多肽產(chǎn)量作為評價指標(biāo)。選擇溫度、時間，加酶量、pH、加水倍數(shù)5個主要的工藝參數(shù)，酶解工藝的正交實驗結(jié)果如表1。表1酶解工藝正交實驗的設(shè)計及結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種從牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽的方法，包括如下步驟1)溶酶稱取牡蠣提取物粉末，加入8 12倍重量適合溫度的水完全溶解；稱取重量為牡蠣提取物7 % 20 %的木瓜蛋白酶加入牡蠣溶液中，攪拌均勻，用酸度計測定pH值，并用醋酸調(diào)節(jié)PH值至5. 6 6.4 ；2)酶解將上述溶液放于45°C 65°C的水浴鍋中加熱，恒溫酶解60min 120min，而后升溫，90°C 100°C恒溫滅酶30min。
2.如權(quán)利要求1所述的從牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽的方法，其特征在于所述步驟1) 中的溶酶所用水加入倍數(shù)為牡蠣提取物的重量的10倍，木瓜蛋白酶加入量為牡蠣提取物的12%，調(diào)節(jié)混合溶液的pH值至5. 8 6. 0。
3.如權(quán)利要求1所述的從牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽的方法，其特征在于所述步驟2) 中恒溫酶解溫度為55°C 65°C，酶解時間為90min 120min。
4.如權(quán)利要求3所述的從牡蠣提取物酶解產(chǎn)生多肽的方法，其特征在于所述步驟2) 中恒溫酶解溫度為60°C，酶解時間為90min。
5.一種從牡蠣提取物酶解產(chǎn)生的多肽，該酶解物特征是氨基酸主要為精氨酸，其次是組氨酸和谷氨酸；其多肽分子量主要集中在SOOODa以下，其中以1400Da以下的居多，在 85%左右，且各種肽的分子量比較集中，主要為小分子多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉公開了一種牡蠣提取物的酶解提取方法，通過木瓜蛋白酶對牡蠣提取物進(jìn)行酶解產(chǎn)生多肽，制備方法依次包括溶酶、調(diào)節(jié)pH值、酶解、滅酶等幾個步驟。該方法優(yōu)點在于1)產(chǎn)物特征為氨基酸主要為精氨酸，其次是組氨酸和谷氨酸。其多肽分子量主要集中在8000Da以下，其中以1400Da以下的居多，在85％左右，且各種肽的分子量比較集中，主要為小分子多肽，營養(yǎng)價值很高。2)操作簡單，成本低廉；3)安全可靠，不會造成環(huán)境污染；4)產(chǎn)率穩(wěn)定，合工業(yè)化生產(chǎn)，具有很高的應(yīng)用價值。
文檔編號C12P21/06GK102443618SQ20111040360
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者嚴(yán)啟新, 馮漢林, 劉碧秀, 康暉, 王兵, 高媛 申請人:深圳海王藥業(yè)有限公司