專利名稱：一種siv載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種SIV載體的制備方法。
背景技術(shù)：
SIV (Simian Immunodeficiency Virus)即猴免疫缺陷病毒,SIV 載體是一種基于猴免疫缺陷病毒(SIV)的載體。目前，常見的SIV載體的制備方法是磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，該方法受pH的值變化的影響比較大。該制備方法工藝復(fù)雜，生產(chǎn)效率低，無法滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種SIV載體的制備方法。該制備方法構(gòu)思巧妙、流程簡單，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率大幅提高，滿足了 SIV載體大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是
一種SIV載體的制備方法，將培養(yǎng)皿用膠原蛋白進(jìn)行處理，在轉(zhuǎn)染過程中使用Opt1-MEM培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染過程中增加DNA濃度。本發(fā)明通過優(yōu)化SIV載體生產(chǎn)時的轉(zhuǎn)染條件，獲得原有技術(shù)約2倍的SIV載體生產(chǎn)量，達(dá)到事半功倍的效果，對促進(jìn)SIV載體的實用化具有重大意義。具體包括1)使用Collagen處理過的培養(yǎng)皿提高SIV載體生產(chǎn)量的技術(shù)；2)轉(zhuǎn)染時使用Opt1-MEM培養(yǎng)基提高SIV載體生產(chǎn)量的技術(shù)；3)轉(zhuǎn)染時增加DNA濃度提高SIV載體生產(chǎn)量的技術(shù)。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明構(gòu)思巧妙、流程簡單，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率大幅提高，可以實現(xiàn)SIV載體的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


本發(fā)明將通過例子并參照附圖的方式說明，其中
圖1是本發(fā)明實施例1生產(chǎn)量評價結(jié)果 圖2是本發(fā)明實施例2生產(chǎn)量評價結(jié)果 圖3是本發(fā)明實施例3生產(chǎn)量評價結(jié)果 圖4是本發(fā)明實施例4生產(chǎn)量評價結(jié)果圖。
具體實施例方式本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。實施例1 :選用3個直 徑IOcm的普通培養(yǎng)皿(dish)和3個Collagen-Type I處理過的同尺寸培養(yǎng)皿，采用相同方法進(jìn)行SIV-GFP的生產(chǎn)，比較使用兩種培養(yǎng)皿在SIV載體生產(chǎn)性上的差別。
具體方法為(DNA32μδ +1.5ml 2xBES Buffer)和1. 5ml 167mM CaCl2 混合 20 分鐘后與12ml DMEM培養(yǎng)基混合，5ml/dish分別加入3個長有293T/17細(xì)胞(添加前用DMEM洗一遍細(xì)胞)的培養(yǎng)皿中，3小時后以5ml/dish加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，第2天去掉培養(yǎng)液，用DMEM洗一遍后，以10ml/dish加入含IOmM NaB的DMEM過夜，轉(zhuǎn)染48小時后收取上清，檢測SIV-GFP的滴度?，F(xiàn)有技術(shù)中使用普通細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行SIV載體的生產(chǎn)，本發(fā)明使用Collagen處理培養(yǎng)皿可以改善細(xì)胞生長狀態(tài)，有利于提高SIV載體的生產(chǎn)量。實驗結(jié)果表明，使用Collagen處理過的培養(yǎng)皿進(jìn)行SIV載體的生產(chǎn)可以提高約30%的生產(chǎn)量。實施例2 :選用直徑IOcm的普通培養(yǎng)皿(3個/組)，采用同樣條件配制DNA混合物，將DNA混合物分別和DMEM培養(yǎng)基，IMDM培養(yǎng)基，Opt1-MEM培養(yǎng)基這3種不同培養(yǎng)基混合后添加進(jìn)培養(yǎng)皿來進(jìn)行SIV-GFP的生產(chǎn)，比較轉(zhuǎn)染時使用不同培養(yǎng)基在SIV載體生產(chǎn)性上的差別?，F(xiàn)有技術(shù)中使用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體方法同實施例1。磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法受PH的變化的影響比較大，使用PH較穩(wěn)定的培養(yǎng)基可改善轉(zhuǎn)染效率，從而有利于提高SIV載體的生產(chǎn)量。Opt1-MEM是Invitrogen公司開發(fā)的培養(yǎng)基,pH比較穩(wěn)定,可以廣泛用于各種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染時使用Opt1-MEM進(jìn)行SIV載體的生產(chǎn)可以提高約40%的生產(chǎn)量。實施例3:選用直徑IOcm的普通培養(yǎng)皿(3個/條件)，分別采用不同條件(I倍DNA濃度，1. 5倍DNA濃度，2. O倍DNA濃度)配制DNA混合物，將DNA混合物和DMEM培養(yǎng)基混合后添加進(jìn)培養(yǎng)皿來進(jìn)行SIV-GFP的生產(chǎn)，具體方法同實施例1。比較轉(zhuǎn)染時使用不同DNA濃度在SIV載體生產(chǎn)性上的差別。SIV載體是使用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法來生產(chǎn)的，轉(zhuǎn)染時的DNA濃度對轉(zhuǎn)染效率有一定影響，雖然過量DNA的使用會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，但在允許范圍內(nèi)適當(dāng)提高DNA濃度會改善轉(zhuǎn)染效率，從而有利于提 高SIV載體的生產(chǎn)量。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用原有技術(shù)2倍DNA濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染，可以提高約43%的SIV載體生產(chǎn)量。實施例4 :選用225cm2方瓶，在相同細(xì)胞條件下分別采用I倍DNA濃度配制DNA混合物、DMEM培養(yǎng)基和2. O倍DNA濃度、Opt1-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行SIV-GFP的生產(chǎn)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用2. O倍DNA濃度、Opt1-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行SIV-GFP的生產(chǎn)可以提高約100%的SIV載體生產(chǎn)量。本發(fā)明并不局限于前述的具體實施方式
。本發(fā)明擴展到任何在本說明書中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過程的步驟或任何新的組合。
權(quán)利要求
1.一種SIV載體的制備方法，采用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，其特征在于將培養(yǎng)皿用膠原蛋白進(jìn)行處理，在轉(zhuǎn)染過程中使用Opt1-MEM培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染過程中增加DNA濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種SIV載體的制備方法，采用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，將培養(yǎng)皿用膠原蛋白進(jìn)行處理，在轉(zhuǎn)染過程中使用Opti-MEM培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染過程中增加DNA濃度。本發(fā)明構(gòu)思巧妙，生產(chǎn)成本低，所制備的托伐普坦片劑體外溶出度高，藥物的生物利用度和臨床療效好。
文檔編號C12N15/867GK103060378SQ20111032453
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者朱義, 游軍, 朱亞峰, 長谷川戶 申請人:四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司, 日本Dnavec株式會社