專利名稱：一種赤霉素混合物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及赤霉素(Gibberella fujikuroi)以及通過發(fā)酵培養(yǎng)而生產(chǎn)赤霉素 GA4+7的方法，具體涉及一種赤霉素混合物，以及以新的變異菌株為對象發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)赤霉素GA4+7的方法。
背景技術(shù)：
赤霉素是指種類眾多的一族密切相關(guān)的四環(huán)三萜系化合物，是一族很重要的具有生物活性的內(nèi)源植物生長調(diào)節(jié)劑。不同的赤霉素可促進植物不同部位的生長，GA3S要是促進植物干和葉子生長，而GA4和GA7則主要是促進開花和拉伸果實，GA4+7最重要的應(yīng)用是可以減輕某些蘋果銹病的嚴(yán)重程度和發(fā)生率，但如果制劑中含有GA3的話，GA3可以導(dǎo)致果樹花蕾形成減少。在現(xiàn)有的合成赤霉素的技術(shù)中，GA3是主要的赤霉素組分，而GA4*GA7的含量則較低，因此，人們希望能有一種GA4+7為主要赤霉素組分的赤霉素生產(chǎn)方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上面所述缺陷，提供一種赤霉素混合物中主要成分是GA4和 GA7的赤霉素混合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的。
一種赤霉素混合物，其特征在于混合物中包含至少50%的GA4+7 ；GA4/GA7約為 2 1 ；混合物的效價至少為900mg/L。
一種赤霉素混合物，其特征是，混合物中優(yōu)選包含70-90%的GA4+7 ；GA4/GA7優(yōu)選為 5-6 1 ；混合物的效價優(yōu)選為1100mg/L以上。
一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法，其特征是包含以下步驟制備好變異菌株 Gibberella fujikuroi NRF-0802 (“變異菌株 Gibberella fujikuroi NRF-0802” 已于 2011年8月4日在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，簡稱“CGMCC”進行生物保藏；保藏編號為=CGMCC No. 5112 ；分類命名藤倉赤霉菌；拉丁文學(xué)名=GitAerella fujikuroi)種子，然后接種到高碳源和相對低氮源的滅菌后的復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)基中；培養(yǎng)上述培養(yǎng)基4-15天后將菌絲體同發(fā)酵液分離；從發(fā)酵液中提取GA混合物后得到至少含有 50%GA4+7的赤霉素混合物。
上述含有50%GA4+7的赤霉素混合物經(jīng)過將GA3從GA4/GA7混合物中分離出來后可得到含有70-90%GA4+7的赤霉素混合物。
所述變異菌株GilAerella fujikuroi NRF-0802生長在土豆葡萄糖瓊脂 (Potato-Dextrose Agar)上的氣生菌絲形成高0. 2-0. 7厘米、直徑0. 3-0. 9厘米，白色或淡紅色的菌落，還可能產(chǎn)生桔色/淺紅色/淺黃色的色素。
所述變異菌株GitDberella fujikuroi NRF-0802的發(fā)酵溫度為20_40°C，優(yōu)選溫度為25-34°C，最優(yōu)溫度為28-320C ；發(fā)酵時pH值為3. 0-7.0，優(yōu)選pH值為5. 0-7.0，最優(yōu)pH值為5. 5-7. 0 ；發(fā)酵時間為4-15天。
變異菌株GilAerella fujikuroi NRF-0802發(fā)酵可以在一系列的液體和固體培養(yǎng)基上進行，適合次級代謝產(chǎn)物如抗生素發(fā)酵的培養(yǎng)基對該菌株也適合。總體而言，這些培養(yǎng)基含有各種不同的可以被真菌利用的碳源、氮源以及各種濃度的無機鹽，還可能含有各種對發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生至關(guān)重要的微量元素等。
合適的碳源包括各種糖，如葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖以及糊精、玉米粉、 燕麥粉、淀粉、植物油、糖蜜、脫脂乳等都是培養(yǎng)基中可吸收碳的來源。培養(yǎng)基中確切地碳源的量部分取決于培養(yǎng)基中的其他成分，但濃度一般為培養(yǎng)基總重量的5-20%(w/w)。這些碳源可以單獨使用或者作為復(fù)合碳源用在培養(yǎng)基中。
合適的氮源有硫酸銨、氯化銨、賴氨酸、酒石酸銨、酵母水解物、酵母自水解物、酵母提取物、酵母細(xì)胞、酪蛋白水解物、玉米漿、燕麥粉、黃豆粉、花生粉以及棉籽餅粉等，這些氮源可以單獨使用或作為復(fù)合氮源使用，濃度為培養(yǎng)基總重量的1-5% (w/w)0
無機鹽和微量元素包括可以提供鈉、鉀、鈣、鎂、氨、鋅、錳、鈷、磷、硫、氯、碳以及硼酸鹽等，還包括鉬和銅等。
隨著發(fā)酵過程的進行，可以每天進行一次GA3、GA4* GA7的效價檢測以判斷發(fā)酵的正常與否。常用的HPLC分析方法如下說明。
樹脂柱KromasilC18 (0. 46 X 10cm，5 微米顆粒，Hichrom KR100-5C18-100A)或其他合適的樹脂柱。
溶劑甲醇1%乙酸；30/70 (v/v)，2分鐘，線性梯度到70/30 (ν/ν)超過10分鐘， 保持在70/30 (ν/ν) 5分鐘。
流速lml/min。
檢測器Sedex 55 ELS檢測器。
保留時間=GA3 6. 0分鐘，GA7 13. 4分鐘，GA4 13. 9分鐘。
建立量化發(fā)酵樣品中的GA3, GA4, GA7需要的校準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品來自Sigma化學(xué)公司ο
提取赤霉素混合物的方法包括以下兩種。
第一種方法的步驟是a)板框分離發(fā)酵液和菌絲體；和/或；b)超濾膜法分離發(fā)酵液和發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)；c)納濾膜或反滲透膜濃縮發(fā)酵液；d)活性炭吸附色素等大分子物質(zhì)；e)乙酸乙酯/ 丁酸乙酯/ 丁酮/甲基異丁基酮/ 丁醇/戊醇/ 二乙醚萃取赤霉素。提取過程中需要調(diào)節(jié)合適PH來實現(xiàn)赤霉素鹽和分子兩種狀態(tài)。
第二種方法是離子交換樹脂法。首先，通過添加堿性金屬氫氧化物如Ba(OH)2等沉淀并過濾除去有機酸、蛋白和色素等不純物質(zhì)；其次，含有赤霉素的過濾液分別流過一種弱陽離子(Amberline IEC 50, H-form)和弱陰離子交換樹脂(Ambolite IR 4B, acetate or formate form)；然后，赤霉素被氨水或銨鹽堿性緩沖液洗脫。該赤霉素產(chǎn)品還可以通過乙酸乙酯萃取和結(jié)晶達(dá)到再純化。
將GA3從GA4/GA7混合物中分離出來的方法包括以下三種。第一種的過程如下首先將過濾液用乙酸乙酯在PH4. 0-8. 5萃取，6~/^7富集在有機溶劑中，而GA3則主要留在了水相中。第二種方法是在有機溶劑萃取后，加入N-甲基-芐胺以生成GA4/GA7的胺鹽，可以將該胺鹽選擇性的沉淀并過濾而將GA3留在溶液中。第三種方法是將上述胺鹽同有機酸反應(yīng)并過濾。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過使用變異菌株GitDberella fujikuroi NRF-0802發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素混合物，該菌株產(chǎn)生很少的GA3,得到的赤霉素混合物中含有高單位的GA4/GA7，發(fā)酵生產(chǎn)出的GA4+7效價高于900mg/L，發(fā)酵總效價可以達(dá)到1100mg/L。
變異菌株GilAerella fujikuroi NRF-0802的生物材料保存存活性報告書。
保藏日期2011年8月4日。
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC。
保藏編號CGMCCNo. 5112。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式
，對本發(fā)明做進一步描述。
實施例1 搖瓶發(fā)酵。
A.種子制備。
種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L;可溶淀粉10g/L;黃豆粉10g/L ；花生粉5g/L ； (NH4)2SO4 0. 5g/L ；KH2PO4 1. 2g/L ；MgSO4 0. 8g/L。
種子培養(yǎng)基成分濃度按照上述以去離子水配制，每個250ml搖瓶放入50ml培養(yǎng)基，使用多層紗布綁縛瓶口，在121°C消毒20分鐘。搖瓶放置在偏心矩為2英寸、rpm220的搖床上，搖床間溫度、相對濕度85%，培養(yǎng)48小時。
B.發(fā)酵。
發(fā)酵培養(yǎng)基可溶淀粉65g/L ；葡萄糖10g/L ；黃豆粉10g/L ；花生粉5g/L ；KH2PO4 1. 2g/L ；MgSO4 0. 8g/L ；ZnCl2 0. 01g/L ；CaCO3 3. 0g/L。在加入 CaCO3 前調(diào)節(jié) pH 到 6. 0。
發(fā)酵培養(yǎng)條件同A部分。發(fā)酵結(jié)束后用離心機分離菌絲體和發(fā)酵液，GA3、GA4和 GA7的分析方法見“發(fā)明內(nèi)容”中的HPLC檢測。效價檢測結(jié)果如下。
權(quán)利要求
1.一種赤霉素混合物，其特征在于混合物中包含至少50%的GA4+7 ；GA4/GA7約為2 1 ； 混合物的效價至少為900mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤霉素混合物，其特征在于混合物中包含70-90%的 GA4+7 ；GA4/GA7為5-6 1 ；混合物的效價為1100mg/L以上。
3.權(quán)利要求1所述的一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法，其特征是包含以下步驟制備好變異菌株GitDberella fujikuroi NRF-0802種子，然后接種到高碳源和相對低氮源的滅菌后的復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)基中；培養(yǎng)上述培養(yǎng)基4-15天后將菌絲體同發(fā)酵液分離；從發(fā)酵液中提取GA混合物后得到至少含有50%GA4+7的赤霉素混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法，其特征在于所述含有 50%GA4+7的赤霉素混合物經(jīng)過將GA3從GA4/GA7混合物中分離出來后可得到含有70-90%GA4+7 的赤霉素混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法，其特征在于所述變異菌株 Gibberella fujikuroi NRF-0802生長在土豆葡萄糖瓊脂上的氣生菌絲形成高0. 2-0. 7厘米、直徑0. 3-0. 9厘米，白色或淡紅色的菌落。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法，其特征在于所述變異菌株 Gibberella fujikuroi NRF-0802的發(fā)酵溫度為20_40°C，優(yōu)選溫度為25_;M°C，最優(yōu)溫度為 28-320C ；發(fā)酵時pH值為3. 0-7. 0，優(yōu)選pH值為5. 0-7. 0，最優(yōu)pH值為5. 5-7. 0 ；發(fā)酵時間為4-15天。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法，其特征在于所述變異菌株 Gibberella fujikuroi NRF-0802發(fā)酵可以在液體或固體培養(yǎng)基上進行；所述碳源包括有葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖以及糊精、玉米粉、燕麥粉、淀粉、植物油、糖蜜、脫脂乳； 培養(yǎng)基中碳源的量為培養(yǎng)基總重量的5-20% (w/w)；所述氮源包括有硫酸銨、氯化銨、賴氨酸、酒石酸銨、酵母水解物、酵母自水解物、酵母提取物、酵母細(xì)胞、酪蛋白水解物、玉米漿、 燕麥粉、黃豆粉、花生粉以及棉籽餅粉，氮源濃度為培養(yǎng)基總重量的1-5% (w/w)；所述無機鹽和微量元素包括可以提供鈉、鉀、鈣、鎂、氨、鋅、錳、鈷、磷、硫、氯、碳以及硼酸鹽、鉬和銅。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法，其特征在于所述提取赤霉素混合物的方法的步驟是a)板框分離發(fā)酵液和菌絲體；和/或；b)超濾膜法分離發(fā)酵液和發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)；c)納濾膜或反滲透膜濃縮發(fā)酵液；d)活性炭吸附色素等大分子物質(zhì)；e)乙酸乙酯/ 丁酸乙酯/ 丁酮/甲基異丁基酮/ 丁醇/戊醇/ 二乙醚萃取赤霉素。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或8所述的一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法，其特征在于所述提取赤霉素混合物的方法是離子交換樹脂法，首先，通過添加堿性金屬氫氧化物如Ba (OH) 2等沉淀并過濾除去有機酸、蛋白和色素等不純物質(zhì)；其次，含有赤霉素的過濾液分別流過一種弱陽離子和弱陰離子交換樹脂；然后，赤霉素被氨水或銨鹽堿性緩沖液洗脫。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種赤霉素混合物的生產(chǎn)方法，其特征在于所述將GA3從 6八4/6~混合物中分離出來的方法包括以下三種第一種的過程如下首先將過濾液用乙酸乙酯在PH4. 0-8. 5萃取，GA4/GA7富集在有機溶劑中，而GA3則主要留在了水相中；第二種方法是在有機溶劑萃取后，加入N-甲基-芐胺以生成GA4/GA7的胺鹽，可以將該胺鹽選擇性的沉淀并過濾而將GA3留在溶液中；第三種方法是將上述胺鹽同有機酸反應(yīng)并過濾。
全文摘要
一種赤霉素混合物及其生產(chǎn)方法，涉及赤霉素以及通過發(fā)酵培養(yǎng)而生產(chǎn)赤霉素GA4+7的方法?；旌衔镏邪辽?0%的GA4+7；GA4/GA7約為2∶1；混合物的效價至少為900mg/L。生產(chǎn)方法包含以下步驟制備好變異菌株GibberellafujikuroiNRF-0802種子，然后接種到高碳源和相對低氮源的滅菌后的復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)基中；培養(yǎng)上述培養(yǎng)基4-15天后將菌絲體同發(fā)酵液分離；從發(fā)酵液中提取GA混合物后得到至少含有50%GA4+7的赤霉素混合物。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明產(chǎn)生很少的GA3,得到的赤霉素混合物中含有高單位的GA4/GA7，發(fā)酵生產(chǎn)出的GA4+7效價高于900mg/L，發(fā)酵總效價可以達(dá)到1100mg/L。
文檔編號C12R1/645GK102499244SQ201110311049
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者劉斌, 劉燕, 周圣驕, 周金龍, 張文宣, 攸德偉, 毛玉華, 游玲玉, 谷田 申請人:江西新瑞豐生化有限公司