專利名稱：一種水稻穗莖節(jié)長度控制基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克隆的水稻穗莖節(jié)長度控制基因C5P7 (Completely Sheathed Panicle 1)，并利用轉(zhuǎn)基因互補實驗驗證了該基因的功能。同時，還涉及利用該基因調(diào)控水稻穗莖節(jié)的生長發(fā)育，解決雜交水稻制種過程中不育系的包穗，提高雜交稻產(chǎn)量和質(zhì)量，降低雜交稻生產(chǎn)成本，并減少因施用植物外源激素而造成的環(huán)境污染。
背景技術(shù)：
水稻是我國主要糧食作物之一，全球約有40%人口以稻米作為主食。自上世紀60年代以來，世界人口急劇增長而耕地面積日益縮減，糧食安全問題已成為世界和平和發(fā)展的巨大挑戰(zhàn)。高產(chǎn)一直是水稻育種的最主要目標。我國于1973年率先實現(xiàn)了雜交水稻的三系配套，使我國水稻的單產(chǎn)水平獲得了第二次飛躍，為我國糧食的大幅度增產(chǎn)增收，解決我國 13億人口的溫飽問題做出了巨大的貢獻，被稱為第二次綠色革命(張杰等，2006)。目前，我國雜交稻種植面積已達1733萬hm2，占水稻種植面積的一半以上，每年需制種15萬hm2左右(吳成等，2003 ；鄧華鳳等，2006)。然而，現(xiàn)在所應(yīng)用的水稻秈型不育系均存在不同程度的包穗現(xiàn)象。在水稻生產(chǎn)中，無論是三系核質(zhì)互作不育系或是兩系光溫敏核不育系，都存在一個共同的遺傳障礙，即不育系抽穗不暢，亦稱之為包穗。水稻包穗是穗頸節(jié)縮短，穗部約 30 % 60 %的穎花被包裹在劍葉葉鞘中。水稻不育系的包穗一直是雜交稻生產(chǎn)中的一大難題，嚴重制約雜交稻種子的生產(chǎn)。生產(chǎn)上解決的辦法是在不育系抽穗期采用剝苞、割葉或噴施赤霉酸(GA3)促使最上節(jié)間伸長，達到不育系稻穗全部伸出劍葉葉鞘而便于接受父本花粉，從而提高雜交制種產(chǎn)量。這極大地增加種子生產(chǎn)成本，同時噴施赤霉酸也加重了穗上發(fā)芽和稻粒黑粉病的發(fā)生，造成種子質(zhì)量下降，并加劇了環(huán)境污染(李安祥等1995 ；Lu et al, 1999)。因此，從遺傳上消除不育系的包穗特性，一直是雜交稻育種的一個重要目標。近年來，育種家通過培育攜帶最上節(jié)間伸長隱性突變基因洲i7 (elongated uppermost internode 1)和eui2的不育系，部分減輕了不育系包穗程度，但仍然沒有徹底解決問題(申宗坦等，1987 ；Virmani, 1988 ；梁康還等，199加、1992b ；何祖華和申宗坦， 1994 ；楊仁崔等，2002)。Zhu (2003)和Zhu等(2006)先后克隆了基因。其中， EUIl基因是一個細胞色素P450家族成員，而^Ζ/Λ 基因與環(huán)氧化物酶有關(guān)。EUIl和的功能是使水稻的內(nèi)源激素GA的合成減少。當其功能缺失時，會造成GA的積累，從而使水稻的穗頸節(jié)伸長。由于的最上節(jié)間異常伸長，在克服不育系包穗和提高恢復(fù)系傳粉能力上可能具有重要的應(yīng)用價值。因此，萬份基因的克隆為人們破解水稻包穗的難題提供了希望。美國學(xué)者Rutger等(1981)對i^Z/基因的利用前景給予了極高的評價，認為萬份基因?qū)⑹请s交水稻種子生產(chǎn)(制種)中的第四遺傳要素(相對于不育系、保持系和恢復(fù)系而言)。然而，實踐證明，基因并不能完全解除水稻不育系的包穗現(xiàn)象。其原因是和 EUI2的功能是使水稻的內(nèi)源激素GA的合成減少。當其功能缺失時，會造成GA的積累，從而使水稻的穗頸節(jié)伸長。但水稻不育系最上節(jié)間中自身合成的GA含量低。因此，要解決水稻不育系的包穗問題，還應(yīng)從促進不育系穗頸節(jié)的GA合成方面入手。為此，迫切需要發(fā)掘新的水稻包穗突變體，克隆水稻包穗基因，并深入研究包穗形成的原因。目前已發(fā)現(xiàn)了幾個水稻包穗突變體·5如(sheathed panicle)和/577 (fully sheathed panicle)，但對這些包穗突變體的研究還很少，未能對水稻穗頸節(jié)間伸長的根本原因進行深入研究(Kinoshita，1986 ；朱克明，2006 ；劉莊等，2006 ；王偉平等，2008)。
本發(fā)明利用營養(yǎng)生長正常但穗莖節(jié)完全不伸長、穗部被劍葉葉鞘全部包裹、能正常結(jié)實的水稻新包穗突變體，通過圖位克隆技術(shù)克隆了水稻的C5P7基因，該基因編碼一個磷脂酰絲氨酸合成酶(phosphatidyl serine synthase, PSS)，控制水稻穗莖節(jié)的伸長但不影響水稻的營養(yǎng)生長和穗的發(fā)育。磷脂酰絲氨酸合成酶屬于磷脂酰二酯合成酶類，它以磷脂類物質(zhì)為底物，催化其和水相中親核供體發(fā)生轉(zhuǎn)脂反應(yīng)，是合成磷脂酰絲氨酸的工具酶。目前，在細菌、酵母、哺乳動物細胞和植物中均發(fā)現(xiàn)了具有功能的磷脂酰絲氨酸合成酶基因， 但該酶在植物中的具體功能、特別是如何特異性決定水稻穗莖節(jié)的發(fā)育目前還是一個謎。 因此，本發(fā)明為解決水稻不育系的包穗提供了新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種水稻穗莖節(jié)長度控制基因及其應(yīng)用，該基因失活造成水稻穗莖節(jié)完全消失但對水稻莖桿的其它節(jié)以及營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育沒有明顯影響。因此，通過調(diào)節(jié)該基因在水稻穗莖節(jié)中的表達，利用該基因的轉(zhuǎn)基因植株改良水稻不育系的穗莖節(jié)伸出長度，用于培育不包穗或輕度包穗的水稻不育系。本發(fā)明的水稻穗莖節(jié)長度控制基因CSPl基因具有如kq ID No. 1所示的DNA序列，也包括與kq ID No. 1所示的DNA序列至少有90%同源性的基因序列。本發(fā)明中的kq ID No. 2所編碼的蛋白質(zhì)為磷脂酰絲氨酸合成酶(ESPS，其中包括進行一個或幾個氨基酸替換、插入或缺失所獲得的功能類似物)。另外，也包括在^^ ID No. 1中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達到本發(fā)明的目的。本發(fā)明克隆的水稻C5P7基因的反轉(zhuǎn)座子插入突變體C5P7表現(xiàn)為穗莖節(jié)完全消失，但水稻莖桿的其它節(jié)間長度、水稻的營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育沒有明顯影響(見實施例1)。 將正常功能的C5P7基因轉(zhuǎn)化該突變體后，植株恢復(fù)正常表型(見實施例2)。本發(fā)明還提供一種用CSPl基因進行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說，本發(fā)明提供Tkq ID No. 1所示的序列基因或該基因類似的部分功能片段的載體，如圖4所示的 PCAMBIA1301-C5P7 (見實施例2所示)。該載體還有一種含有以上表達載體的宿主細胞，該宿主細胞包括大腸桿菌、農(nóng)桿菌和植物細胞。實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下
一.水稻雄蕊雌蕊化突變體CSW的分離和遺傳分析
利用水稻品種明恢86 (.Oryza sativa ssp minghui86)的幼胚進行組織培養(yǎng)的后代植株中，本發(fā)明獲得了一個水稻包穗突變體α/77，該突變體的營養(yǎng)生長、枝梗分化和穎花的數(shù)目基本正常，但在抽穗期突變體的穗部發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為穗頸節(jié)完全退化、穗部被劍葉葉鞘全部包裹。通過突變雜合體植株自交及野生型植株正反交實驗，證明C5/77是一個符合單基因控制的遺傳規(guī)律、如圖1所示的隱性突變體。二、水稻花器官發(fā)育的基因CSPl的圖位克隆 1. C5P7的初步定位為了分離基因，本發(fā)明采用圖位克隆的方法，首先創(chuàng)建了一個F2定位群體，由 cspl突變體為母本，選用秀水13為父本雜交獲得的F2中的C5/77突變體組成。利用水稻RM 系列微衛(wèi)星標記對C5P7基因進行初步定位。定位結(jié)果如圖2所示，CSPl基因初步定位在第1染色體短臂末端介于RM1282和RM84兩個標記之間。2. CSPl基因的精細定位
通過對RMl282和RM84兩個標記之間的BAC/PAC序列分析，開發(fā)出新的水稻SSR微衛(wèi)星標記和InDel標記，將CSPl基因精細定位于如圖3所示的PAC克隆P0494A10上的hDel2 和SSR2之間約14Kb范圍內(nèi)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框(ORF)推測侯選基因。進一步通過比對突變體與野生型的基因組序列，確定候選基因。3. C5P7基因的鑒定和功能分析
構(gòu)建了一個如圖4所示的互補實驗載體。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將互補載體轉(zhuǎn)入C5/77 突變體后獲得了如圖5所示的表型恢復(fù)正常的轉(zhuǎn)基因水稻，證明了本發(fā)明正確克隆了 CSPl 基因；氨基酸序列分析表明，CSP7編碼一個磷脂酰絲氨酸合成酶。本發(fā)明利用營養(yǎng)生長正常但穗莖節(jié)完全不伸長、穗部被劍葉葉鞘全部包裹、能正常結(jié)實的水稻新包穗突變體，通過圖位克隆技術(shù)克隆了水稻的C5P7基因，該基因編碼一個磷脂酰絲氨酸合成酶(phosphatidyl serine synthase, PSS)，控制水稻穗莖節(jié)的伸長但不影響水稻的營養(yǎng)生長和穗的發(fā)育。磷脂酰絲氨酸合成酶屬于磷脂酰二酯合成酶類，它以磷脂類物質(zhì)為底物，催化其和水相中親核供體發(fā)生轉(zhuǎn)脂反應(yīng)，是合成磷脂酰絲氨酸的工具酶。目前，在細菌、酵母、哺乳動物細胞和植物中均發(fā)現(xiàn)了具有功能的磷脂酰絲氨酸合成酶基因，但該酶在植物中的具體功能、尤其是如何特異性決定水稻穗莖節(jié)的發(fā)育目前還是一個謎。因此，本發(fā)明為解決水稻不育系的包穗提供了新的途徑。水稻是我國乃至世界的主要糧食作物。水稻生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位，是我國第一大栽培作物，約占我國糧食總產(chǎn)量的40%。目前主要是利用雜交水稻的雜種優(yōu)勢來培育高產(chǎn)水稻品種。我國雜交稻種植面積占水稻種植面積的一半以上，但所應(yīng)用的水稻秈型不育系均存在一個共同的遺傳障礙一包穗，嚴重的影響雜交水稻的制種產(chǎn)量和成本。生產(chǎn)上迫切需要培育長穗莖節(jié)的不育系的育種材料?；蚬こ碳夹g(shù)使得應(yīng)用 CSPl基因調(diào)節(jié)水稻不育系穗莖節(jié)的長度成為可能。本發(fā)明獲得的水稻全包穗突變體C5P7， 是單基因隱性突變，符合孟得爾遺傳規(guī)律。本發(fā)明通過圖位克隆技術(shù)獲得了 CSPl基因，并通過功能互補實驗鑒定了該基因的功能。氨基酸序列分析表明，該基因編碼一個磷脂酰絲氨酸合成酶，其在闡明水稻穗莖節(jié)長度控制方面具有重要作用。因該基因主要控制水稻穗莖節(jié)的發(fā)育而對營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育影響較小，可以利用基因工程技術(shù)調(diào)節(jié)它在水稻穗莖節(jié)中的表達量，可培育出長穗莖節(jié)的水稻不育系新種質(zhì)，從而提高雜交制種質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本。因此，該基因具有非常重要的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。


圖1 水稻包穗突變體C5777與對應(yīng)野生型的表型。圖IA 野生型明恢86與突變體cspl的植株表型。圖IB 野生型明恢86與突變體C5/77的最上節(jié)與穗部表型(白箭頭劍葉葉枕，黃箭頭穗頸節(jié)，紅箭頭倒一節(jié)間)。圖2 ..CSPl基因在水稻第1染色體上的初步定位圖。
圖3 -.CSPl基因精細定位圖。圖 4 pCAMBIA1301 -CSPl 載體圖譜。圖5 功能互補實驗Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻與cspl突變體的表型圖。圖5A 突變體cspl的植株表型。圖5B 功能互補實驗Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻植株表型。
具體實施例方式實施例1 水稻穗莖節(jié)長度控制基因CSPl的圖位克隆 1.水稻材料
水稻(ftrza sativa L)突變體C5/77，原始野生型材料為明恢86。該突變體為本發(fā)明者從明恢86的幼胚組織培養(yǎng)再生植株的后代中獲得。2.分析和定位群體
突變體C5/77與野生型品種秀水13進行雜交，F(xiàn)1代自交，得到F2群體，在抽穗期選出 2720個C5/77突變表型的植株作為定位群體。于抽穗期每株取1克左右的葉片，用來提取總 DNA。3.利用水稻微衛(wèi)星標記(RM與SSR)和InDel標記定位CSPl基因
采用水稻微量法快速抽提水稻的總DNA。取大約0. 3克水稻葉片，放入1. 5ml離心管中經(jīng)液氮快速冷凍，用小塑料研棒研成粉末后提取DNA，獲得的DNA溶于100 ul超純水中。 每一個20 ul的反應(yīng)體系中加入1 ul DNA樣品。電CSPl基因的初步定位實驗中，利用DNA池的定位方法，選700個F2群體中的突變體個體用水稻RM系列微衛(wèi)星進行分析。根據(jù)公布的水稻SSR遺傳圖譜，按照一定的遺傳距離，均勻選取分布于各條染色體上的RM引物進行PCR擴增，然后在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上分離和硝酸銀染色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將C5P7基因初步定位在水稻第1染色體短臂的RM1282和RM84兩個標記之間。在精細定位C5P7基因時，對F2群體中的2720個突變體個體進行SSR標記和hDel 標記的連鎖分析。根據(jù)分子標記RM1282和RM84之間的BAC/PAC序列分析，利用已公布的水稻基因組序列，設(shè)計了 9對SSR引物和17對hDel引物用于精細定位CSPl基因，其中有3對SSR引物(命名為SSRl SSR3)和5對InDel引物(命名為InDell InDel5)在兩個親本間有多態(tài)。用這8個有多態(tài)的標記(引物序列見表1)對F2群體中的2720個突變體個體進行了連鎖分析。表1用于精細定位C5P7基因的引物序列
權(quán)利要求
1. CSPl基因在控制水稻穗莖節(jié)長度中的應(yīng)用，其特征在于，所述的C5P7基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
2.CSPl基因在控制水稻穗莖節(jié)長度中的應(yīng)用，其特征在于，所述的C5P7基因編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因在培育不包穗或輕度包穗的水稻不育系中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種水稻穗莖節(jié)(倒一節(jié))長度控制基因CSP1及其應(yīng)用。具體涉及了一個控制水稻穗莖節(jié)長度基因的定位、克隆、功能驗證和應(yīng)用。所述的CSP1基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。CSP1對水稻的營養(yǎng)生長和穗的發(fā)育沒有明顯影響，主要控制水稻穗莖節(jié)的生長發(fā)育。利用基因工程技術(shù)有目的地調(diào)節(jié)該基因在水稻穗莖節(jié)中的表達量，可以調(diào)控水稻穗莖節(jié)的生長發(fā)育，解決雜交水稻制種過程中不育系的包穗問題，提高雜交稻種子的產(chǎn)量和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，減少因施用植物外源激素而造成的環(huán)境污染。因此，該基因具有十分重要的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/55GK102321644SQ20111029362
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者亓文明, 劉華清, 吳為人, 官華忠, 莊麗君, 段遠霖, 王 鋒 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)