專利名稱：：一種在花生種子中表達(dá)人humanin蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種表達(dá)人humanin蛋白的方法，尤其涉及一種利用油體蛋白系統(tǒng)在花生種子中表達(dá)人humanin蛋白的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：阿爾茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是以進(jìn)行性的記憶減退、認(rèn)知障礙和癡呆為臨床表現(xiàn)的老年人常見疾病，發(fā)病率隨著人口的老齡化而迅速增加，已經(jīng)成為繼心血管疾病、癌癥和中風(fēng)之后的又一嚴(yán)重危害人類健康的疾病。二十一世紀(jì)初，日本學(xué)者首先分離出一種稱為Humanin(HN)的短肽，由M個(gè)氨基酸組成。它能有效抑制AD相關(guān)基因淀粉樣蛋白前體(amyloidprecursor,APP)基因、早老素1(presenilnl，PSl)基因、早老素2(presenilis，PS2)基因的突變，以及β淀粉樣肽(amyloidpeptide,Αβ)引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡[1_3]。HN的一級結(jié)構(gòu)具有信號肽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可被分泌至細(xì)胞外，細(xì)胞外的HN通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合，繼而激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路而發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用。此外，有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦內(nèi)注射HN可以改善東莨菪堿引起的動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙。且Humanin的一種衍生物——Humanin(HNG)，被證實(shí)作用較HN強(qiáng)1000倍M。近年來的研究表明，HNG還具有預(yù)防和治療中風(fēng)[5]、增強(qiáng)胰島素活性從而治療II型糖尿病[6]的作用。Humanin蛋白作用廣泛，臨床應(yīng)用前景廣闊，市場需求巨大，因此大規(guī)模生產(chǎn)人humanin蛋白意義重大。利用植物生物反應(yīng)器是生產(chǎn)藥用蛋白的有效方式。已有多種植物用作生物反應(yīng)器，如煙草、大豆、擬南芥、玉米、油菜、馬鈴薯塊莖、番茄果實(shí)、水稻種子等，其表達(dá)產(chǎn)物也有多種，如疫苗、抗體等。植物生物反應(yīng)器成本較低，易于擴(kuò)大規(guī)模，不存在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)或微生物發(fā)酵中遇到的細(xì)胞培養(yǎng)困難、培養(yǎng)基昂貴、污染控制困難等問題。與動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加成熟。與動(dòng)物和微生物系統(tǒng)相比，植物本身不攜帶引起人類疾病的病菌或病毒，避免了病原菌對生物反應(yīng)器產(chǎn)品的污染。與微生物相比，利用植物生產(chǎn)的產(chǎn)品一般具有較高的生物活性。此外，油料作物種子中的油體蛋白能夠高水平表達(dá)，可達(dá)到種子總蛋白的10%。如果將外源蛋白與油體蛋白融合表達(dá)，在提高外源蛋白表達(dá)水平的同時(shí)，還能簡化蛋白的分離程序，有效降低生產(chǎn)成本。研究表明油體蛋白(oleosin)具有親水和親脂雙重特性，在植物種子中以膜嵌入方式覆蓋在油體表面。油體蛋白分子除中部疏水區(qū)域高度保守外，N端和C端的序列差異都很大。油體的性質(zhì)決定了它是一種易于人工改造的細(xì)胞器，小分子量蛋白插入到油體蛋白的N端或C端后，不會影響到油體蛋白在植物油體上的定位和表達(dá)，形成的重組融合蛋白非常穩(wěn)定，通過漂浮離心很容易將它與其他細(xì)胞成分分開，易于大規(guī)模的蛋白分離純化。Chen等用三酰甘油酯、磷脂和油體蛋白合成了人工油體(AOB)，只有天然油體的1/10，通過一系列生理實(shí)驗(yàn)證明AOB保留了天然油體的特性而且非常穩(wěn)定[7]。Peng等利用人工油體優(yōu)化了油體-油體蛋白表達(dá)體系，在大腸桿菌中構(gòu)建了“油體蛋白-Xa-GFP”表達(dá)載體，通過離心，oleosin-GFP全部富集到人工油體的表面，通過蛋白酶fe將GFP從嵌入油體的油體蛋白中分離，再一次離心，收集上清液得到高濃度的GFP[8]。Xu等利用大豆MkDa油體蛋白系統(tǒng)，構(gòu)建了“油體蛋白-腸肽酶-水蛭素”植物表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表達(dá)了重組蛋白，通過腸肽酶切割，分離得到了水蛭素M。kmBioSys公司利用油體-油體蛋白這一系統(tǒng)在擬南芥中表達(dá)人胰島素，植物性胰島素累積到種子總蛋白含量的0.13%[1°]，經(jīng)后續(xù)試驗(yàn)優(yōu)化后，種子中積累的胰島素占種子蛋白總量的1.15%，達(dá)到商業(yè)應(yīng)用水平。該公司還利用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)在紅花中表達(dá)人胰島素，每英畝紅花所產(chǎn)的紅花籽中能提取到1公斤的人胰島素，能夠有效填補(bǔ)市場需求，利用油菜油體蛋白系統(tǒng)生產(chǎn)水蛭素產(chǎn)品也已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化階段?；ㄉ侵匾挠土献魑?，是我國單產(chǎn)、總產(chǎn)和出口創(chuàng)匯最高的油料作物，占我國油料作物總產(chǎn)的50%，占世界花生總產(chǎn)的30%以上，花生已經(jīng)在榨油、食品加工和化工等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。花生種子的含油量高達(dá)45-55%，蛋白含量達(dá)到25-30%，可以生食，也可作為食品加工的原材料，其蛋白質(zhì)極易備人體吸收，吸收率在90%以上，所以花生是生物反應(yīng)器的優(yōu)良載體。人humanin蛋白具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，經(jīng)檢索，目前還沒有關(guān)于在花生種子中利用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人humanin蛋白的方法的報(bào)道。參考文獻(xiàn)[1]HashimotoY,NiikuraΤ,ItoY,NishimotoI.MultiplemechanismsunderlieneurotoxicitybydifferenttypesofAlzheimer'sdiseasemutationsofamyloidprecursorprotein.BiolChem.2000,275(44):34541-34551.[2]HashimotoY,ItoY,NiikuraT,ShaoZ,HataM,OyamaF,NishimotoI.MechanismsofneuroprotectionbyanovelrescuefactorhumaninfromSwedishmutantamyloidprecursorprotein.BiochemBiophysResCommun.2001,283(2)460-468.[3]HashimotoY,NiikuraT,ItoY,SudoH,HataM,ArakawaE，AbeY,KitaY,NishimotoI.DetailedcharacterizationofneuroprotectionbyarescuefactorhumaninagainstvariousAlzheimer'sdisease-relevantinsults.JNeurosci.2002,21(23):9235-9245.[4]HashimotoY,NiikuraT,TajimaH,YasukawaT,SudoH,ItoY,KitaY,KawasumiM,KouyamaK,DoyuM,SobueG,KoideT,TsujiS,LangJ,KurokawaK,NishimotoI.ArescuefactorabolishingneuronalcelldeathbyawidespectrumoffamilialAlzheimer'sdiseasegenesandabeta.PNAS.2001,98:6336-6341.[5]XuX,ChuaCC,GaoJ,HamdyRC,ChuaBHL.Humaninisanovelneuroprotectiveagentagainststroke.Stroke,2006,37:2613-2619.[6]MuzumdarRH,HuffmanDM,AtzmonG,BuettnerC,CobbLJ,etal.Humanin:ANovelCentralRegulatorofPeripheralInsulinAction.PLoSONE2009,4(7):e6334.doi:10.1371/journal,pone.0006334[7]ChenMC,ChyanCL,LeeTT,etal.Constitutionofstableartificialoilbodieswithtriacylglycerol,phospholipid,andcaleosin.JAgricFoodChem.2004,16；52(12):3982-3987.[8]PengCC,ChenJC,ShyuDJ,etal,AsystemforpurificationofrecombinantproteinsinEscherichiacoliviaartificialoilbodiesconstitutedwiththeiroleosin-fusedpolypeptides.JBiotechnol.2004,111(1):51-7.[9]XuMY,LiuDH,LiGQ.Cloningofsoybean24kDaoleosingeneanditstransientexpressionasacarrierforforeignprotein.AgriculturalSciencesinChina,2004,3(5):321-329.[10]NykiforukCL,BootheJG,MurrayEff,etal.TransgenicexpressionandrecoveryofbiologicallyactiverecombinanthumaninsulinfromArabidopsisthalianaseeds.PlantBiotechnolJ.2006,(1):77-85.
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的狀況，本發(fā)明要解決的問題是提供一種利用油體蛋白系統(tǒng)在花生種子中表達(dá)人humanin蛋白的方法。本發(fā)明所述在花生種子中表達(dá)人humanin蛋白的方法，步驟包括(1)克隆花生油體蛋白基因Aholeosin及其啟動(dòng)子；(2)合成人humanin蛋白編碼基因；(3)構(gòu)建pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-OCS植物表達(dá)載體；(4)花生的轉(zhuǎn)化；(5)轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得；(6)WesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中humanin蛋白的表達(dá)；(7)從轉(zhuǎn)基因花生種子中分離純化并回收人humanin蛋白；其特征是所述克隆花生油體蛋白Aholeosin及其啟動(dòng)子的方法是提取花生基因組DNA，以其為模板，以帶有EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC的正向引物AGAATTCAGGTCAACTACCATTCGT，和帶有KpnI酶切位點(diǎn)GGTACC的反向引物GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG，利用LATAQ酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4°C5min;再94°C45sec，54°C45sec，72°C2min，;35循環(huán)；72°C7min；16°C保存PCR產(chǎn)物；將PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，選取抗性單克隆測序，確認(rèn)攜帶Aholeosin及其啟動(dòng)子的克隆載體；所述合成人humanin蛋白編碼基因的方法是設(shè)計(jì)并合成部分互補(bǔ)的兩條單鏈DNA引物，其中正向引物包含KpnI酶切位GGTACC和點(diǎn)腸肽酶識別序列(GATGATGATGATAAG)GAAGGTACCGATGATGATGATAAGATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；反向引物包含Histag序列(CACCACCACCACCACCAC)和SalI酶切位點(diǎn)(GTCGAC):ACGCGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCACTGGTTAAAAGTAAGAGA,利用TAQ酶進(jìn)行退火和延伸，程序?yàn)?MV3min；40°CImin；720C2min；16°C保存產(chǎn)物；將產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，選取抗性單克隆測序，確認(rèn)攜帶humanin基因的正確克隆載體；所述植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-Aholeosin:humanin_0CS構(gòu)建方法是將按照上述克隆方法獲得的Aho1eosin及其啟動(dòng)子通過EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)連接到PCAMBIA2300-35S-0CS植物表達(dá)載體上，獲得pCAMBIA2300-Aholeosin_0CS載體，再將按照上述克隆方法獲得的humanin蛋白編碼基因通過KpnI和MlI酶切位點(diǎn)連接到pCAMBIA2300-Aho1eosin-0CS載體上，獲得pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin_0CS植物表達(dá)載體；所述花生的轉(zhuǎn)化方法是將帶有目的基因的植物表達(dá)載體PCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-0CS通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法侵染花生；所述轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得的方法是收獲第二代轉(zhuǎn)基因花生純合體的花生種子；所述WfesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中人humanin蛋白表達(dá)的方法是用人humanin抗體作為一抗，辣根過氧化物酶作為二抗進(jìn)行的免疫印跡雜交檢測；所述從轉(zhuǎn)基因花生種子中分離純化并回收人humanin蛋白的方法是指將獲得的花生種子粉碎，抽提液體，離心回收上層油相，得到含融合蛋白的液體；將融合蛋白經(jīng)酶切后離心，去掉油相回收水相，經(jīng)純化獲得人humanin蛋白。上述在花生中表達(dá)人huamnin蛋白的方法中所述植物表達(dá)載體中花生的油體蛋白基因和啟動(dòng)子、重組蛋白編碼基因的連接順序?yàn)椤盎ㄉ腕w蛋白啟動(dòng)子+花生油體蛋白基因+腸肽酶識別位點(diǎn)+人humanin蛋白基因+終止子”。人humanin蛋白具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，利用原核系統(tǒng)重組蛋白往往沒有活性或者活性很低，利用動(dòng)物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白表達(dá)量低、成本高，植物生物反應(yīng)器具有生產(chǎn)藥用蛋白的優(yōu)勢。本發(fā)明提供的利用油體蛋白系統(tǒng)在花生種子中表達(dá)人humanin蛋白的方法實(shí)現(xiàn)了人humanin蛋白以融合的方式與轉(zhuǎn)基因花生油體蛋白共同表達(dá)和高水平積累。本發(fā)明以花生作為受體植物，花生的種子作為表達(dá)蛋白的載體，采用花生油體蛋白基因和啟動(dòng)子的克隆，表達(dá)載體的構(gòu)建，花生的遺傳轉(zhuǎn)化，人humanin蛋白基因的表達(dá)確認(rèn)，重組蛋白的分離純化和回收的方法，成功實(shí)現(xiàn)了利用花生種子作為生物反應(yīng)器在轉(zhuǎn)基因花生中高效、安全地表達(dá)人humanin蛋白，進(jìn)而純化回收蛋白。綜上，本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)花生含油量高，油體蛋白豐富，占種子總蛋白的10%以上，人humanin蛋白以融合的方式與花生油體蛋白共同表達(dá)，并高水平積累。(2)在花生中表達(dá)重組的humanin蛋白穩(wěn)定性好，能夠在花生種子中長期儲存并保持活力，且運(yùn)輸方便。(3)花生栽培面積廣，適應(yīng)性強(qiáng)，利用油體蛋白的純化體系、容易回收和純化，具有易操作、成本低的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)增加了農(nóng)產(chǎn)品的附加值，為生物制藥和分子農(nóng)業(yè)新興產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持。圖1本發(fā)明所述植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-0CS構(gòu)建示意圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不限于此。實(shí)施例1包含啟動(dòng)子的花生油體蛋白基因的克隆根據(jù)Genbank中花生油體蛋白的啟動(dòng)子和編碼基因的序列(基因登錄號EF6卯400)，設(shè)計(jì)含有EcoRI酶切位點(diǎn)(GAATTC)的正向引物primerl:AGAATTCAGGTCAACTACCATTCGT；根據(jù)花生油體蛋白基因的開放閱讀框序列，去掉中止密碼子，設(shè)計(jì)帶有KpnI酶切位點(diǎn)(GGTACC)的反向引物primer2:GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG。提取花生(魯花14)的基因組DNA，方法如下(1)取Ig的花生幼嫩葉片，用液氮研磨成粉，置于液氮預(yù)冷的Eppendof管中；(2)在65"C水浴中預(yù)熱CTAB提取液O%CTAB,1.4mol/LNaCl，2(toimo/LEDTA(pH8.0),lOOmmol/LTris-Cl(pH8.0),2%pvp-40)；(3)估算樣品組織的質(zhì)量，每200mg樣品中加700μL預(yù)熱的CTAB提取液，迅速混勻，在65°C溫浴10_30min，期間混勻2-5次；(4)加1倍體積的苯酚/氯仿/異戊醇(12121)，混勻；(5)12000rpm室溫離心IOmin；(6)將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中；(7)用氯仿/異戊醇041)重復(fù)4-6步；(8)加0.7倍體積_20°C預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置IOmin；(9)12000rpm室溫離心15min；(10)倒掉上清，用500μ1_20°C預(yù)冷的70%乙醇洗沉淀2-3次；(11)沉淀干燥后，用50μ1去離子水或TE溶解DNA，置于_20°C備用。(12)吸取5μ1溶解的DNA，加入45μ1去離子水，混勻待用。花生油體蛋白啟動(dòng)子和基因的PCR擴(kuò)增以上述primerl，primer2為引物，花生基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到花生油體蛋白的啟動(dòng)子和全長基因。反應(yīng)程序如下模板DNA1μl,2XLATaqmix10μ1,primerl(10μΜ)0·5μ1，primer2(10μΜ)0·5μ1，ddH208·0μ1。在PCR儀(TaKaRaΤΡ650)上設(shè)置94°C5min,隨后94°C45sec,54°C45sec,72°C2min,共；35個(gè)循環(huán)后72°C7min結(jié)束反應(yīng)?；ㄉ腕w蛋白啟動(dòng)子和基因序列的獲得取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，膠回收2100bp左右的目的條帶，連接T載體(pMD18-T，TaKaRa，Dalian)，連接體系10μ1回收產(chǎn)物4μ1，pMD18_T載體1μ1，SolutionI5μ1，16°C下進(jìn)行連接反應(yīng)4h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備用無菌接種環(huán)挑取_70°C甘油保存的E.coliDH5α，通過劃線稀釋的方法經(jīng)37°C培養(yǎng)16_20h，在平板上得到DH5α的單菌落；挑一單菌落于3ml的LB液體培養(yǎng)基，180rpm振蕩培養(yǎng)12h；取ImlDH5aLB菌液于100ml的LB液體培養(yǎng)基，180rpm振蕩培養(yǎng)到OD值0.4；冰上放置15min，無菌條件下轉(zhuǎn)入50mlBeckman離心管中，4°C，4500rpm離心lOmin，棄上清；沉淀用30ml冰預(yù)冷的0.IMCaCl2溶液重懸；4°C，4500rpm離心lOmin，小心倒出上清液；沉淀重懸于2ml冰預(yù)冷的含15%甘油0.IMCaCl2溶液；將這些感受態(tài)細(xì)胞按每份70μ1分裝，-80°C保存。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化將上述10μ1的連接液加入70μ1DH5α感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰上放置30min，42°C熱激90sec，冰浴5min，加入150μ1液體LB(NaCl10g/L,Tryptone10g/L，Yeastpowder5g/L)，37°C120rpm振蕩培養(yǎng)lh，將菌液均勻涂抹布在含有100μg/ml的氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上(NaCl10g/L,Tryptone10g/L,Yeastpowder5g/L，Agarpowder15g/L)，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落到4mL液體LB中，37°C搖菌8_10h，提取質(zhì)粒DNA(Omega)，分別用(Ec0RI、KpnI)雙酶切驗(yàn)證，對陽性克隆用M13通用引物進(jìn)行測序驗(yàn)證(見序列表SEQIDNo.1)，得到克隆載體T-AhOleosin質(zhì)粒。實(shí)施例2人Humanin基因的合成根據(jù)Genbank中humanin基因(NPJ)Ol1776；35)序列，設(shè)計(jì)并合成部分互補(bǔ)的兩條單鏈DNA引物，其中正向引物包含KpnI(GGTACC)位點(diǎn)和腸肽酶識別序列(GATGATGATGATAAG)primer3:GAAGGTACCGATGATGATGATAAGATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；反向引物包含Histag序列(CACCACCACCACCACCAC)和Sail酶切位點(diǎn)(GTCGAC)primer4:ACGCGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCACTGGTTAAAAGTAAGAGA。利用TAQ酶進(jìn)行退火和延伸，primer3(100μΜ)1μ1，primer4(100μΜ)1μ1，程序?yàn)?4°C3min；40°CImin；72°C2min；16°C保存產(chǎn)物；產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，膠回收目的條帶，將回收產(chǎn)物與T載體連接，按實(shí)施例1中的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci細(xì)胞，選取抗性單克隆測序，確認(rèn)攜帶humanin基因的正確克隆(見序列表SEQIDNo.2)，得到克隆載體T-humanin質(zhì)粒。實(shí)施例3植物表達(dá)載體的構(gòu)建植物表達(dá)載體的構(gòu)建過程如圖1所示(1)將花生油體蛋白啟動(dòng)子和ORF連接到pCAMBIA2300-35S-0CS植物表達(dá)載體，此植物表達(dá)載體骨架來源于Cambia公司，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所改造(Luoetal.Journalofintegrativeplantbiology,2005，47(6)，745—752):將PCAMBIA2300-35S-0CS質(zhì)粒和T-AhOleosin質(zhì)粒分別用EcoRI和KpnI雙酶切，回收載體序列和AhOleosin序列，用T4DNA連接酶將兩者進(jìn)行連接=IOXiMDNAligasebuffer1μ1，AhOleosin6μ1，pCAMBIA23002μ1，Τ4DNAligase1μ1，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物按實(shí)施例1中的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用EcoRI和KpnI雙酶切驗(yàn)證正確克隆，得到pCAMBIA2300-Ah01eosin-0CS表達(dá)載體。將人humanin蛋白基因連接到pCAMBIA2300-Ah01eosin_0CS表達(dá)載體將pCAMBIA2300-Ah01eosin-0CS質(zhì)粒和T-humanin質(zhì)粒分別用KpnI和Mil雙酶切，回收載體序列和humanin序列，用T4DNA連接酶將兩者進(jìn)行連接:10XT4DNAligasebuffer1μ1，humanin6μ1,pCAMBIA2300-Ah01eosin_0CS2μ1,T4DNAligase1μ1，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物按實(shí)施例1中的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用KpnI和Mil雙酶切驗(yàn)證正確克隆，得到pCAMBIA2300-Ah01eosin-humanin-0CS表達(dá)載體。(2)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化制備農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì)胞挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落到:3mlLB培養(yǎng)基(含利福平25μg/ml)搖菌過夜；然后取Iml接種到50ml液體LB培養(yǎng)基中(含利福平50μg/ml)J8°C擴(kuò)大培養(yǎng)，200rpm震蕩培養(yǎng)至OD600=0.5；冰浴IOmin,4°C4500rpm，離心IOmin；菌體用50ml預(yù)冷的0.IMCaCl2重懸，4°C4500rpm再次離心IOmin；收集的菌體加入aiil20mMCaCl2懸浮液(含15%的甘油)，80μ1/管分裝，液氮速凍后_80°C保存。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌取pCAMBIA2300-Ah01eosin-humanin-0CS質(zhì)粒5μ1加入80μ1ΕΗΑ105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30min；液氮中速凍90sec；37°C水浴快速解凍，3min；加入800μ1LB培養(yǎng)基，觀°C，150rpm震蕩培養(yǎng)池；瞬間離心，去上清，將菌體帶200μ1LB涂布在加有25μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)2-3d。取1μ1菌液做模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，分別以3對引物(primerl，primerf)、(primer3、primer4)、(primerl,primer4)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，經(jīng)PCR驗(yàn)證正確的克隆搖菌，-80°C保存菌株。實(shí)施例4花生的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得(1)花生胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化外質(zhì)體的制備成熟花生種子去外殼，用70%乙醇浸種lmin，無菌水沖洗3次，再用0.升汞(w/v)處理15-25min，然后用無菌水沖洗4_6遍，滅菌期間不斷搖動(dòng)種子，以保證種子表面滅菌徹底。剝?nèi)シN皮，將胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基(蔗糖3(^/1，瓊脂0.7%，1^大量元素，MS微量元素)上，胚軸深入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4d左右取胚軸作為外植體。培養(yǎng)溫度25士1°C，光照強(qiáng)度35001ux。花生胚軸外植體的侵染新鮮培養(yǎng)的含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105，5000g/min離心收集菌體，重懸于液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，農(nóng)桿菌感染的最佳濃度為OD6tltl=0.5-0.8。手術(shù)刀切取萌動(dòng)4d的花生胚軸，在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡25-30min，取出外植體在濾紙上吸去多余的菌液，然后接種到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(MS+蔗糖30g/l，瓊脂0.7%，6-BA10mg/l,NAA0.8mg/l)上，暗處共培養(yǎng)2d。選擇培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化植株再生共培養(yǎng)后，將外植體接到含有500mg/L羧芐青霉素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7d，再接到含有10mg/L潮霉素和500mg/L羧芐青霉素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)接到含有25mg/L潮霉素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上進(jìn)一步篩選，大約3-4周后出現(xiàn)叢生芽點(diǎn)，以后每2周更換一次新鮮培養(yǎng)基。待叢生芽長到l-2cm時(shí)將其切下，移至分化伸長培養(yǎng)基(MS+蔗糖30g/L，瓊脂0.7%，GA34mg/l,6-BA2mg/l)上，潮霉素濃度降至10mg/l，當(dāng)小苗長至3-5cm時(shí)，將其移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+蔗糖30g/L，瓊脂0.7%,NAA2.Omg/1)中，煉苗、轉(zhuǎn)基因植株的移栽。(2)轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得收獲花生種子，種植并收獲第二代種子，提取DNA進(jìn)行PCR檢測和Southern雜交，驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株，獲得轉(zhuǎn)基因花生種子。實(shí)施例5WesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中humanin蛋白的表達(dá)從轉(zhuǎn)基因花生種子中提取重組蛋白(1)取0.5g干種子于8ml提取緩沖液(蔗糖0.6M，KClIOmM,MgCl2ImM,Tris-Cl0.15MpH7.5)中，勻漿。(2)12000rpm離心20min，取油相。(3)加入提取緩沖液重懸混勻，12000rpm離心20min，收集油相。(4)加入5ml漂浮緩沖液(蔗糖0.4M,KClIOmM,MgCl2ImM,Tris-Cl0.15MpH7.5)重懸，12000rpm離心20min,收集油相。(5)加入NaHCO3冰浴3Omin,12000rpm離心2Omin,收集油相。(6)用過量丙酮在0°C抽提3次，去除三酰甘油吹干沉淀的蛋白，然后溶于適量無菌水中。WesternBlot雜交(1)將提取的重組蛋白50μg通過12%的SDS-PAGE膠電泳分離。(2)電泳結(jié)束后將膠切割成合適的大小，用轉(zhuǎn)膜液平衡3次，每次5分鐘。(3)將硝酸纖維素膜用蒸餾水潤洗，用電轉(zhuǎn)方法將膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到膜上。(4)轉(zhuǎn)后將膜放入染色液中50s，在50%的甲醇中脫色至背景清晰，然后用雙蒸水清洗。(5)用0.OlMPBS(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g加H2O定容至1000ml)洗膜3次，每次15min，然后用3%明膠浸泡洗3h，封閉非特異位點(diǎn)的。(6)將膜取出，用0.OlMPBS洗2次，每次lOmin。(7)力口入用PBS稀釋1000倍的一抗(Monoclonalanti-humanBMP7antibody)，室溫結(jié)合2h，陰性對照用1%的BSA。(8)棄一抗和BSA，用0.OlM的PBS洗膜4次，每次5min。(9)加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(用PBS稀釋2000倍)，室溫輕搖池。(10)棄二抗，用PBS洗膜4次，每次5min。(11)加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。實(shí)施例6從轉(zhuǎn)基因花生種子中大規(guī)模分離并回收人humanin蛋白人humanin蛋白分離并回收，將轉(zhuǎn)基因花生種子勻漿、壓榨；離心后去掉沉淀(種子纖維等)，回收上層的油相，清洗后、離心再取上層的油相；加入腸肽酶進(jìn)行酶消化反應(yīng)，離心去掉上層的油相，回收水相經(jīng)純化得到人humanin蛋白。權(quán)利要求1.一種在花生種子中表達(dá)人humanin蛋白的方法，步驟包括(1)克隆花生油體蛋白基因Aholeosin及其啟動(dòng)子；(2)合成人humanin蛋白編碼基因；(3)構(gòu)建pCAMBIA2300_Aholeosin-humanin-OCS植物表達(dá)載體；(4)花生的轉(zhuǎn)化；(5)轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得；(6)WesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中humanin蛋白的表達(dá)；(7)從轉(zhuǎn)基因花生種子中分離純化并回收人humanin蛋白；其特征是所述克隆花生油體蛋白Aholeosin及其啟動(dòng)子的方法是提取花生基因組DNA，以其為模板，以帶有EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC的正向引物AGAATTCAGGTCAACTACCATTCGT，和帶有KpnI酶切位點(diǎn)GGTACC的反向引物GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG，利用LATAQ酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4°C5min;再94°C45sec，54°C45sec，72°C2min，;35循環(huán)；72°C7min；16°C保存PCR產(chǎn)物；將PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，選取抗性單克隆測序，確認(rèn)攜帶Aholeosin及其啟動(dòng)子的克隆載體；所述合成人humanin蛋白編碼基因的方法是設(shè)計(jì)并合成部分互補(bǔ)的兩條單鏈DNA引物，其中正向引物包含KpnI酶切位GGTACC和點(diǎn)腸肽酶識別序列(GATGATGATGATAAG)GAAGGTACCGATGATGATGATAAGATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；反向引物包含Histag序列(CACCACCACCACCACCAC)和SalI酶切位點(diǎn)(GTCGAC):ACGCGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCACTGGTTAAAAGTAAGAGA,利用TAQ酶進(jìn)行退火和延伸，程序?yàn)?MV3min；40VImin；720C2min；16°C保存產(chǎn)物；將產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，選取抗性單克隆測序，確認(rèn)攜帶humanin基因的正確克隆載體；所述植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-Aholeosin:humanin_OCS構(gòu)建方法是將按照上述克隆方法獲得的Aholeosin及其啟動(dòng)子通過EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)連接到PCAMBIA2300-35S-0CS植物表達(dá)載體上，獲得pCAMBIA2300-Aholeosin_0CS載體，再將按照上述克隆方法獲得的humanin蛋白編碼基因通過KpnI和MlI酶切位點(diǎn)連接到pCAMBIA2300-Aho1eosin-OCS載體上，獲得pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin_0CS植物表達(dá)載體；所述花生的轉(zhuǎn)化方法是將帶有目的基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-AholeoSin-humanin-OCS通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法侵染花生；所述轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得的方法是收獲第二代轉(zhuǎn)基因花生純合體的花生種子；所述WesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中人humanin蛋白表達(dá)的方法是用人humanin抗體作為一抗，辣根過氧化物酶作為二抗進(jìn)行的免疫印跡雜交檢測；所述從轉(zhuǎn)基因花生種子中分離純化并回收人humanin蛋白的方法是指將獲得的花生種子粉碎，抽提液體，離心回收上層油相，得到含融合蛋白的液體；將融合蛋白經(jīng)酶切后離心，去掉油相回收水相，經(jīng)純化獲得人humanin蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在花生中表達(dá)人huamnin蛋白的方法，其特征是所述植物表達(dá)載體中花生的油體蛋白基因和啟動(dòng)子、重組蛋白編碼基因的連接順序?yàn)椤盎ㄉ腕w蛋白啟動(dòng)子+花生油體蛋白基因+腸肽酶識別位點(diǎn)+人humanin蛋白基因+終止子”。全文摘要本發(fā)明公開了一種在花生種子中表達(dá)人humanin蛋白的方法，是利用基因工程手段將humanin蛋白編碼基因連接到油體蛋白基因的3’端，構(gòu)建由油體蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的“油體蛋白-腸肽酶-人humanin蛋白”植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化花生，重組蛋白伴隨著油體的積累在花生種子中高水平的表達(dá)，然后離心分離出融合蛋白，將融合蛋白用外切蛋白酶消化后離心，去掉油相回收水相，經(jīng)純化獲得人humanin蛋白。本發(fā)明方法獲得的重組蛋白安全、活性高、非常容易回收和純化，而且可以在花生種子中長期的儲存、運(yùn)輸方便，大大提升了作物的附加值。文檔編號C12N15/84GK102321665SQ20111029350公開日2012年1月18日申請日期2011年9月29日優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日發(fā)明者夏晗,李愛芹,李長生,畢玉平,王興軍,肖寒,趙傳志申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心