專利名稱：低甲基化基因lmo3的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低甲基化基因LM03在制備腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后預(yù)測試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，目前采用的治療手段包括手術(shù)治療聯(lián)合化療和放療，但是膠質(zhì)瘤病人的生存期仍無顯著延長。據(jù)報(bào)道，膠質(zhì)瘤病人的5年生存率低于25%，而膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤的病人總生存時(shí)間平均為12.3個(gè)月。目前，對(duì)腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后判定沒有參考標(biāo)準(zhǔn)，也沒有特異性的指標(biāo)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行預(yù)后判定的需求。因此，對(duì)人腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行預(yù)后判定，以便選擇最佳治療方案，顯著提高患者生存率，成為科學(xué)研究亟待解決的重要課題。表觀遺傳學(xué)，即可通過遺傳而非DNA序列改變引起的基因表達(dá)改變。表觀遺傳機(jī)制，包括高/低甲基化、組蛋白修飾或非編碼RNA表達(dá)。大量研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳機(jī)制在腫瘤的形成過程中發(fā)揮著重要作用，包括膠質(zhì)瘤。DNA甲基化狀態(tài)的改變包括高甲基化和低甲基化，DNA低甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)增加，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在腫瘤中起著非常重要的作用。重復(fù)序列和單拷貝位點(diǎn)都可能發(fā)生低甲基化。近年來，以DNA甲基化為代表的腫瘤表觀遺傳學(xué)及其在臨床診斷、化療敏感性和預(yù)后評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用價(jià)值，已經(jīng)逐漸到研究者的重視。有研究表明IGF2低甲基化可作為診斷結(jié)腸癌的替代生物分子。癌-睪丸抗原基因MAGEAl在膠質(zhì)瘤中發(fā)生低甲基化，抑制P53的功能及產(chǎn)生耐藥。低甲基化的MAL 基因可作為預(yù)測卵巢癌對(duì)順鉬敏感性的標(biāo)志物。1號(hào)染色體重復(fù)序列Sat2的廣泛低甲基化可作為卵巢癌預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志。由此可見，基因低甲基化在探尋腫瘤分子標(biāo)志物方面具有巨大潛力。利用亞硫酸氫鹽測序PCR法(BSP)分析所獲得的腫瘤特異性甲基化狀態(tài)，是甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)，它能明確所測區(qū)域每一個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。LM03 基因(LIM domain only 3)定位于染色體 12ρ12· 3，GeneBank 登錄號(hào) ΝΜ_001001395。已證實(shí)，LM03在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮癌基因的功能，它能與神經(jīng)元性轉(zhuǎn)錄因子ΗΕΝ2相互作用，也能抑制Ρ53的轉(zhuǎn)錄活性，并且高表達(dá)LM03的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后較差。申請人用免疫組織化學(xué)法檢測LM03蛋白在正常腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)， 結(jié)果顯示LM03在膠質(zhì)瘤中表達(dá)增加(ρ < 0. 05，圖1)，高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織(III級(jí)、IV級(jí)) 中LM03的表達(dá)較低級(jí)別(I級(jí)、II級(jí))增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ = 0. 023)。亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)證實(shí)，LM03在膠質(zhì)瘤中發(fā)生低甲基化，并且在高級(jí)別膠質(zhì)瘤(III級(jí)、IV級(jí)) 中的甲基化頻率較低級(jí)別(I級(jí)、II級(jí))病人降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0. 047)。然后用SPSS 13. 0軟件對(duì)LM03蛋白表達(dá)與LM03基因低甲基化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩者間存在相關(guān)性(P < 0. 05)，說明表觀遺傳學(xué)可能參與了 LM03基因的表達(dá)調(diào)控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種低甲基化基因LM03的應(yīng)用方法，對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后預(yù)測具有重要意義。低 甲基化基因LM03用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查制劑；特別是用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查的試劑盒。如用于制備亞硫酸氫鹽直接測序法預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的制劑；所述的制劑中包括 根據(jù)LM03基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島設(shè)計(jì)的，采用亞硫酸氫鹽直接測序法的引物序列為F 5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3‘，R 5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3‘。一種用于人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測的LM03基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測試劑盒，包括以下引物F 5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3‘，R 5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3‘。申請人:發(fā)現(xiàn)LM03基因在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)(圖1)。LM03轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游_401bp至-219bp為一典型的CpG島(圖2)，該CpG島中CG位點(diǎn)在正常的腦組織中均處于高甲基化狀態(tài)，而在LM03表達(dá)上調(diào)的腦膠質(zhì)瘤組織中其甲基化程度降低(部分結(jié)果見圖 3)。LM03低甲基化的膠質(zhì)瘤病人總生存率明顯低于高甲基化的病人(圖4)，提示LM03基因是膠質(zhì)瘤中的低甲基化基因，是預(yù)測膠質(zhì)瘤預(yù)后的分子標(biāo)志。本發(fā)明為腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。


圖1LM03蛋白在正常腦組織及不同病理分級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)；A 正常腦組織；B 膠質(zhì)瘤WHO I級(jí)；C 膠質(zhì)瘤WHO II級(jí)；D 膠質(zhì)瘤WHO III級(jí)； E 膠質(zhì)瘤WHO IV級(jí)；圖2LM03基因啟動(dòng)子的活性區(qū)域_401bp至_219bp為一典型的CpG島；淺藍(lán)色區(qū)域?yàn)镃pG島圖3BSP檢測正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中LM03基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)；圖中所示為部分結(jié)果，N3 第3例正常腦組織；N8 第8例正常腦組織；T5 第5例膠質(zhì)瘤組織；T8 第8例膠質(zhì)瘤組織。〇表示非甲基化位點(diǎn)， 表示甲基化位點(diǎn)，每一行表示一個(gè)克隆中所有CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，計(jì)算5個(gè)克隆中的甲基化比率進(jìn)行比較。結(jié)果表明，正常腦組織中LM03基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島為高甲基化狀態(tài)，而膠質(zhì)瘤組織中該CpG島發(fā)生低甲基化；圖4LM03啟動(dòng)子低甲基化與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系。綠色曲線表示LM03基因啟動(dòng)子甲基化的膠質(zhì)瘤病人的生存狀況及時(shí)間，藍(lán)色曲線表示LM03基因啟動(dòng)子發(fā)生低甲基化的膠質(zhì)瘤病人的生存狀況及時(shí)間。用SPSS 13.0軟件進(jìn)行Kaplan-Meier檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ = 0. 047)，說明LM03低甲基化的病人預(yù)后較高甲基化的病人差。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1
米用 Promoterscan，Genomatix Promoter Inspector 及 CpGplot 等生物信息學(xué)軟件對(duì)LM03基因5’端序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明LM03基因的啟動(dòng)子區(qū)域可能位于_581bp至Obp處(以起始密碼子ATG中A為+1)。Methl primer express軟件和在線軟件Methprimer分析LM03啟動(dòng)子預(yù)測區(qū)域_401bp至_219bp，結(jié)果顯示為一 CpG島，設(shè)計(jì)并合成 LM03 啟動(dòng)子區(qū)的甲基化引物，5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA3‘ (F), 5‘ ATAT CCTCCTTTTAAACAACTACAA3 ‘ (R)。對(duì)10例正常腦組織進(jìn)行經(jīng)亞硫酸鹽處理后的基因組測序 (BSP)，發(fā)現(xiàn)LM03基因啟動(dòng)子CpG島中CpG位點(diǎn)在正常的腦組織均處于甲基化狀態(tài)。同時(shí)對(duì)不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本(I級(jí)6例，II級(jí)20例，III級(jí)12例，IV級(jí)12例)50例，進(jìn)行了 LM03啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測，發(fā)現(xiàn)88%的腦膠質(zhì)瘤組織中LM03的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生低甲基化，與正常腦組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)，各級(jí)膠質(zhì)瘤的LM03啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平?jīng)]有明顯的差異(ρ >0.05)。LM03啟動(dòng)子區(qū)低甲基化的病人預(yù)后較甲基化病人的差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.047)。以上研究結(jié)果提示，LM03基因是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的腦膠質(zhì)瘤甲基化基因，是一個(gè)膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測標(biāo)志。操作步驟 (一 )亞硫酸氫鹽修飾樣品gDNA制備選擇已商品化的亞硫酸氫鹽修飾試劑盒。( 二)亞硫酸氫鹽直接測序PCR (BSP)試劑盒的使用內(nèi)容該試劑盒包括用于檢測LM03基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的PCR引物5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3' (F)；5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3' (R)；PCR擴(kuò)增體系(_20°C保存)。原理利用甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增LM03啟動(dòng)子區(qū)CpG島。步驟1取經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的樣品gDNA4y 1(總量約IOOng)，加入含甲基化引物 2 μ 1 的 PCR 擴(kuò)增體系(50 μ 1)，使用 Takara 公司的 EmeraldAmp PCR Master Mix (含 DNA 聚合酶、緩沖液及dNTP混合物)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為
權(quán)利要求
1.低甲基化基因LM03的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因LM03用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因LM03用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因LM03用于制備亞硫酸氫鹽直接測序法預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的制劑中包括根據(jù)LM03基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島設(shè)計(jì)的，采用亞硫酸氫鹽直接測序法的引物序列為F 5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3‘， R 5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3‘。
5.一種用于人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測的LM03基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測試劑盒，其特征在于，包括以下引物F 5' TAGTATATGTATGTGGTTGTGTTGA 3‘， R 5' ATATCCTCCTTTTAAACAACTACAA 3‘。
全文摘要
本發(fā)明涉及低甲基化基因LMO3的應(yīng)用，即用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測、檢測或篩查制劑。特別是用于制備亞硫酸氫鹽直接測序法預(yù)測腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的制劑。通過研究證實(shí)LMO3在膠質(zhì)瘤組織中因啟動(dòng)子發(fā)生低甲基化而高表達(dá)，將檢測LMO3基因低甲基化應(yīng)用于膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測，為預(yù)測膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后提供強(qiáng)有力的分子生物學(xué)依據(jù)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102329870SQ20111029323
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者余志斌, 劉曉萍, 卞艷慧, 唐海林, 李桂源, 武明花, 王澤友 申請人:中南大學(xué)