雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調(diào)控基因的鑒定方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領域，尤其涉及一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調(diào) 控基因的鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis)為革蘭氏陰性菌，是一種危害較大的食 源性致病菌，感染家禽后，為家禽生產(chǎn)和人類健康帶來嚴重的經(jīng)濟損失和安全隱患。
[0003] DNA的甲基化是真核生物主要的表觀遺傳修飾，是表觀遺傳學的重要組成部分，在 維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤及相關(guān)疾病發(fā)生中起著重要作用，異 常甲基化的發(fā)生是導致疾病的一大關(guān)鍵因素。啟動子區(qū)域CpG島（CGI)高甲基化導致免疫 基因表達失活是目前疾病研宄中的熱點課題。
[0004] 目前，有人比較了不同雞種生長快慢之間的甲基化差異，或利用MEDIP技術(shù)分析 了在感染致病型大腸桿菌后雞脾臟全基因組甲基化變化和表達的關(guān)系，微生物在感染哺乳 動物后能夠通過引起基因的高甲基化而引發(fā)各種疾病，而關(guān)于腸炎沙門氏菌感染對雞全基 因組甲基化水平影響的報道較少，且尚無關(guān)于鑒定在腸炎沙門氏菌感染中發(fā)揮甲基化調(diào)控 基因的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的實施例提供一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調(diào)控基因的鑒定方法，可以 鑒定在雞腸炎沙門氏菌感染中發(fā)揮甲基化調(diào)控作用的基因。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明的實施例采用如下技術(shù)方案：
[0007] 一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調(diào)控基因的鑒定方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0008] S1、選擇2日齡沙門氏菌陰性雞，均分為試驗組和對照組；所述試驗組通過口腔灌 服法接種0. 3ml腸炎沙門氏菌，接種量為2-4X IO8Cfu/只，所述對照組接種0. 3mL的磷酸 鹽緩沖溶液；
[0009] S2、接種14天后，根據(jù)感染腸炎沙門氏菌的盲腸內(nèi)容物細菌含量結(jié)果，選擇實驗 組中細菌含量最多的個體3-6個；隨機選擇對照組中等數(shù)量的個體；被選中的每只雞的脾 臟作為一個樣本；
[0010] S3、從各個樣本中提取DNA，實驗組和對照組各構(gòu)建2個DNA混池，利用DNA的破碎 試劑盒將各個DNA混池中的DNA打斷至150-800bp的大小不等DNA片段，用T4DNA聚合酶 和Klenow酶將得到的所有DNA片段修飾成平末端；
[0011] S4、用Agencourt公司的產(chǎn)品AMPure XP磁珠篩選300_400bp的修飾成平末端的 DNA片段并純化；
[0012] S5、在篩選出的DNA片段的平末端序列末端加腺嘌呤變成粘性末端；
[0013] S6、將篩選出的DNA片段與接頭序列連接，采用甲基化DNA沉淀試劑盒對連接完成 后的序列樣品進行甲基化的DNA富集，驗證擴增純化后進行測序以確定甲基化發(fā)生差異的 具體基因；
[0014] S7、進行數(shù)據(jù)分析，獲得MeDIP-Seq數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計表，如表1所示，從整體水平表示 了從樣品中收集到全基因組參與測序的獨有數(shù)據(jù)情況，且數(shù)據(jù)比對到基因組的比例較高， 說明數(shù)據(jù)質(zhì)量來源可靠，可以進一步分析；圖1表示的是每條染色體上DMR所占的百分比， 橫坐標表示每條染色體（chr)，縱坐標指甲基化差異區(qū)域占每條染色體總長的比例，此圖能 總體簡略看出甲基化在整個基因組中所占的比例，除16、21和25號染色體外，DMR在各染 色體均有分布，比例較高的是10、11和24號染色體；在表2里，展示了 DMR在各個區(qū)域的分 布情況，通過表2,我們了解到甲基化是發(fā)生在包括內(nèi)含子在內(nèi)的整個基因組，并非只在轉(zhuǎn) 錄基因體現(xiàn)，說明甲基化在表觀遺傳現(xiàn)象起到的作用是通過多個基因位置實現(xiàn)的，如DNA， RNA ;圖2表示的是甲基化差異顯著基因的基因本體論功能分析，在這個表中，我們對差異 基因的功能進行聚類分析，全面了解甲基化差異的基因在感染中發(fā)揮的作用，篩選出在多 個功能類別中存在頻率較高的基因，用于進一步鑒定感染中發(fā)揮重要作用的基因；表3是 對差異基因的信號通路分析，信號通路是指響應某一信息源而執(zhí)行一定功能的通路，基因 在信號通路中發(fā)揮各自的作用，參與生物功能代謝等，也作為鑒定基因功能的因素之一；表 4是顯著差異基因甲基化的倍數(shù)變化，表中直觀展示了差異上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)較大的前22個 基因，是篩選基因的主要依據(jù)；表5是將所有的差異基因進行本體論分析后，將其所包含的 全部基因重復數(shù)進行統(tǒng)計后得到的結(jié)果，對功能的分析和基因的鑒定有重要的參考價值。
[0015] S8、通過對甲基化差異基因的鑒定和對基因的功能和信號通路分析，結(jié)合差異基 因的甲基化倍數(shù)變化，鑒定得出腸炎沙門氏菌感染中發(fā)揮甲基化調(diào)控的基因。
[0016] 上述技術(shù)方案提供的方法中，脾臟是重要的免疫器官，利用雞脾臟組織樣品為試 驗材料，利用上述測序鑒定在雞腸炎沙門氏菌感染中的甲基化差異基因，將會為我們進一 步探討甲基化在腸炎沙門氏菌感染中的調(diào)控作用以及篩選雞抗沙門氏菌感染的分子標記 奠定基礎。
【附圖說明】
[0017] 圖1為各染色體上DMR占每條染色體的百分比圖示；
[0018] 圖2為甲基化差異顯著基因的基因本體論功能分析圖示。
【具體實施方式】
[0019] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0020] 本發(fā)明的實施例提供一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調(diào)控基因的鑒定方法，如圖 1所示，所述方法包括以下步驟：
[0021] S1、選擇2日齡沙門氏菌陰性壽光雞，均分為試驗組和對照組；所述試驗組通過口 腔灌服法接種0. 3mL腸炎沙門氏菌菌液2-4 X IOScfu/只，菌液稀釋液為磷酸鹽緩沖溶液， 所述對照組接種0. 3mL的磷酸鹽緩沖溶液，對照組的設立，使試驗結(jié)果的差異僅為腸炎沙 門氏菌感染的影響，較好的平衡和抵消了無關(guān)變量的影響，使試驗結(jié)果更具有說服力。
[0022] 首先，選擇1日齡山東壽光雞，利用平板試驗法檢測并篩選沙門氏菌陰性個體，獲 得2日齡沙門氏菌陰性壽光雞。
[0023] S2、接種后14天后，根據(jù)感染腸炎沙門氏菌的盲腸內(nèi)容物細菌含量結(jié)果，選擇實 驗組中細菌含量最多的3-6只壽光雞；任意選擇對照組中等數(shù)量的壽光雞；被選中的每個 壽光雞的脾臟作為一個樣本。
[0024] 根據(jù)感染腸炎沙門氏菌的盲腸內(nèi)容物細菌含量結(jié)果，選擇接種后14日齡脾臟樣 品做全基因組甲基化測序（MEDIP-seq)，對照組3-6個樣本，實驗組3-6個樣本。
[0025] S3、從各個樣本中提取DNA，實驗組和對照組各構(gòu)建1個DNA混池，利用DNA的破碎 試劑盒（Bioo Scientific Corporation)將各個DNA混池中的DNA打斷至150_800bp的大 小不等片段，用T4DNA聚合酶和克列諾酶將得到的所有片段修飾成平末端。
[0026] S4、用Agencourt公司的產(chǎn)品AMPure XP磁珠篩選300_400bp大小的修飾成平末 端的DNA片段并純化。
[0027] S5、在篩選出的DNA片段的平末端的序列末端加腺嘌呤變成粘性末端。
[0028] 在平末端的序列末端加腺嘌呤變成粘性末端，可以減少在連接接頭序列時各DNA 片段之間的互連，保證接頭序列與DNA片段片段之間的特異性連接。
[0029] S6、將篩選出的DNA片段與接頭序列連接，采用甲基化DNA沉淀試劑盒（Zymo Research Corp.，Cat.#D5101)對連接完成后的序列樣品進行甲基化的DNA富集，驗證擴增 純化后進行測序以確定甲基化發(fā)生差異的具體基因。
[0030] S7、進行數(shù)據(jù)分析，獲得MeDIP-Seq總數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計表，根據(jù)DMR位置和長度計算 各染色體上DMR占每條染色體的百分比，總結(jié)DMR在各個區(qū)域的分布情況；進行甲基化差異 基因的鑒定，獲得基因 CGI的DMRs分類餅圖以及基因角度的DMRs分類餅圖，對甲基化差異 基因進行基因本體論分析，差異基因的信號通路分析，顯著差異基因甲基化的倍數(shù)變化。
[0031] MEDIP是甲基化DNA免疫共沉淀的簡稱，MEDIP-seq是通過抗5-甲基胞嘧啶（5mC) 的抗體分離出甲基化的DNA片段，通過高通量測序在全基因組水平上進行高甲基化區(qū)域的 研宄，被用于富集甲基化的DNA的序列，甲基化在生物學過程中發(fā)揮著重要的作用。DMR是 甲基化差異區(qū)域，是指不同樣本中的不同的甲基化狀態(tài)的基因組區(qū)域。
[0032] 其中，MeDIP-Seq數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計表如表1所示：
[0033] 表I MeDIP-Seq總數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計
[0034]
【主權(quán)項】
1. 一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調(diào)控基因的鑒定方法，其特征在于，包括以下步 驟： 51、 選擇沙門氏菌陰性壽光雞，均分為試驗組和對照組；所述試驗組通過口腔灌服法接 種0. 3ml腸炎沙門氏菌，2-4 X IO8Cfu/只，所述對照組接種0. 3mL的磷酸鹽緩沖溶液； 52、 接種14天后，根據(jù)感染腸炎沙門氏菌雞只盲腸內(nèi)容物細菌含量結(jié)果，選擇實驗組 中細菌含量最多的個體3-6個；任意選擇對照組中等數(shù)量的個體；被選中的每個個體的脾 臟作為一個樣本； 53、 從各個樣本中提取DNA，實驗組和對照組各構(gòu)建1個DNA混池，利用The AIRtmDNA破 碎試劑盒將各DNA混池中的DNA打斷至150-800bp的大小不等DNA片段，用T4DNA聚合酶 和克列諾酶將得到的所有DNA片段修飾成平末端； 54、 用Agencourt公司的產(chǎn)品AMPure XP磁珠篩選300_400bp的修飾成平末端的DNA 片段并純化； 55、 在篩選出的DNA片段的平末端序列末端加腺嘌呤變成粘性末端； 56、 將篩選出的DNA片段與接頭序列連接，采用甲基化DNA沉淀試劑盒對連接完成后的 序列樣品進行甲基化DNA富集，驗證擴增純化后進行測序以確定甲基化發(fā)生差異的具體基 因； 57、 進行數(shù)據(jù)分析，獲得MeDIP-Seq數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計表，各染色體上DMR所占百分比，DMR 在各個區(qū)域的分布情況，甲基化差異顯著基因的基因本體論功能分析，差異基因的信號通 路分析，顯著差異基因甲基化的倍數(shù)變化； 58、 通過對甲基化差異基因的鑒定和對基因的功能和信號通路分析，結(jié)合差異基因的 甲基化倍數(shù)變化，鑒定得出腸炎沙門氏菌感染中發(fā)揮甲基化調(diào)控的基因。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調(diào)控基因的鑒定方法，涉及生物基因工程技術(shù)領域，可以鑒定在雞腸炎沙門氏菌感染中發(fā)揮甲基化調(diào)控作用的基因。所述方法包括利用雞脾臟組織樣品為試驗材料，對其進行處理后，進行甲基化DNA富集，驗證擴增純化后進行測序；通過對基因甲基化差異的鑒定和對基因功能和信號通路的分析，結(jié)合基因甲基化差異倍數(shù)變化，鑒定得出腸炎沙門氏菌感染中發(fā)揮甲基化調(diào)控的基因。
【IPC分類】C12R1-42, C12Q1-68
【公開號】CN104561330
【申請?zhí)枴緾N201510027797
【發(fā)明人】李顯耀, 王莎莎, 劉麗英, 吳桂賢
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月17日