一種腸炎沙門氏菌pcr檢測引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)PCR檢測引物，并公開其作為檢測試劑盒使用的檢測方法。本發(fā)明提供的檢測引物，其核苷酸序列如ID?No.1和2所示。本發(fā)明所設計的引物檢測特異性好，靈敏度高，非常適用于檢測食品中的腸炎沙門氏菌。
【專利說明】—種腸炎沙門氏菌PCR檢測引物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明主要涉及食品質量檢測領域，屬于微生物檢測方法，具體涉及一種沙門氏菌PCR檢測引物。
【背景技術】
[0002]沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)為腸桿菌科沙門氏菌屬,據(jù)其抗原結構和生化試驗，目前已有2000余種血清型，其中以鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌較為多見。該菌為革蘭氏陰性桿菌，需氧，不產(chǎn)生芽胞，無莢膜，絕大多數(shù)有鞭毛，能運動。對外界的抵抗力較強，在水和土壤中能活數(shù)月，糞便中能活I~2個月，在冰凍土壤中能越冬。不耐熱，55°C、lh或60°C、10~20分鐘死亡，5%石炭酸或1:500升汞5分鐘內(nèi)即可將其殺滅。多種家畜(豬、牛、馬、羊)、家禽(雞、鴨、鵝)、魚類、飛鳥、鼠類及野生動物的腸腔及內(nèi)臟中能查到此類細菌。細菌由糞便排出，污染飲水、食物、餐具以及新鮮蛋品、冰蛋、蛋粉等，人進食后造成感染。致病食物以肉、血、內(nèi)臟及蛋類為主，值得注意的是該類細菌在食品中繁殖后，并不影響食物的色、香、味。
[0003]沙門氏菌屬有的專對人類致病，有的只對動物致病，也有對人和動物都致病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。 [0004]由沙門氏菌引起的食源性疾病的全球公共健康問題。在歐洲IS06579:2002和FSISMLG4.04中；檢測沙門氏菌是評估產(chǎn)品是否合格的必檢項目。在美國，通常是肉，禽，蛋產(chǎn)品中檢測出沙門氏菌。
[0005]由沙門氏菌引起了食源性疾病的全球公共健康問題。沙門氏菌是最常見的，新鮮家禽和豬的肉陽性標本的比例，根據(jù)歐洲標準(歐盟委員會法規(guī)2073/2005)用于評價產(chǎn)品是否符合標準，經(jīng)分別檢測平均為5.5%和1.1 %。此外，美國食品安全檢驗局采用FSIS的方法，檢測沙門氏菌。這兩個標準的用于檢測沙門氏菌培養(yǎng)方法(SCMS)需要長達5天，才能獲得結果。這些方法包括預培養(yǎng)，在選擇性瓊脂上選擇性分離，可疑菌落的生化鑒定和血清學確認。該方法是雖然準確，但費力，成本高，費時，且對短保質期的產(chǎn)品無法檢測。目前，檢測沙門氏菌的方法檢測時間長，費用較高，不利于在基層單位推廣使用。
[0006]因此，需要有新的方法能夠在一個短的時間內(nèi)檢測，最好能在24小時之內(nèi)，在一個給定的食物量中檢測食品中的病原體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本研究的目的是:建立一個新的檢測食品中的病原體的方法。為達到直接在食品中腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)檢測的目的。本發(fā)明采用Primer Expressl.5軟件中設計的引物，提供一種沙門氏菌PCR檢測引物，其為:[0008]F:CACCAGGAGATTACAACATGACG SEQ ID N0.1
[0009]R:CTAGCTCACACCAAAAGTGACCA SEQ ID N0.2。
[0010]其中，所述的引物擴增片段為ISObp左右的片段，根據(jù)電泳結果，即可判斷為是否
存在病原體基因。
[0011]本發(fā)明還提供含有上述引物的沙門氏菌PCR檢測試劑盒，所述試劑盒還可包括PCR緩沖液、dNTPs、純化水和Taq DNA聚合酶等。
[0012]本發(fā)明的上述引物，可以廣泛的應用在檢測食品中、水體中、畜禽飼料中的腸炎沙門氏菌檢測等方面。
[0013]本發(fā)明還提供應用上述的試劑盒在食品中檢測沙門氏菌的方法，其包括:
[0014]I)提取食品中的DNA ；
[0015]2)以步驟I提取的DNA為模板進行PCR擴增；
[0016]3)對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。
[0017]其中，所述的PCR反應體系為:每20μ I的反應液中，含有⑴引物上、下游各15禮，10(^1;(2)10\?0?緩沖液，1.51111;(3)101111 dNTPs, 1.5ml ； (5) 5U/μ I Taq DNA 聚合BI, 100 μ I ；(4)純化水，3.0ml。
[0018](I)引物上、下游各 15mM,100y I ；
[0019](2) 10XPCR 緩沖液(含 Mg2+20mM)，1.5ml ；
[0020](3) dNTPs (IOmM)，1.5ml ；
[0021]⑷純化水，3.0ml ;
[0022](5) Taq DNA 聚合酶(5U/ μ I)，100 μ I。
[0023]其中，所述的PCR反應條件為:951:預變性11^11，951:變性308，601:退火508，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
[0024]取5~10 μ I PCR擴增產(chǎn)物點樣于2%瓊脂糖凝膠中進行檢測，電壓為90V，電泳時間為40min，然后觀察PCR擴增產(chǎn)物有無180bp左右的特異性片段。
[0025] 本發(fā)明中，上述檢測試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據(jù)現(xiàn)有技術確定，并通過配置或商業(yè)途徑購買獲得，檢測試劑盒的使用方法和檢測條件，技術人員可以依據(jù)實施例中所列條件做參考依據(jù)進行調整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現(xiàn)有技術中得到充分的啟示，本發(fā)明不再贅述。
[0026]本發(fā)明公開了一種檢測食品中腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)的引物和試劑盒。本發(fā)明的檢測試劑盒能準確靈敏地檢測食品中的沙門氏菌，DNA最低檢測濃度為5ng，而且與其他細菌無交叉反應，特異性好，同時樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本低于傳統(tǒng)的檢測方法，而且本發(fā)明試劑保存時間長，無污染。本發(fā)明對解決大批量樣品的沙門氏菌的現(xiàn)場檢測技術具有重要的現(xiàn)實意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為引物特異性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。1:DNA Marker ；2:沙門氏菌；3:陰性對照；
[0028]圖2為細菌菌數(shù)系列稀釋的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖。1:DNA Marker ；2:陰性對照，5ng梯度稀釋的樣品、IOng梯度稀釋的樣品、20ng梯度稀釋的樣品、40ng梯度稀釋的樣品、80ng梯度稀釋的樣品。
[0029]圖3為同時對腸炎沙門氏菌菌株和對照菌株(大腸桿菌、葡萄球菌)進行PCR檢測的電泳分析圖。1:DNA Marker ;2:腸炎沙門氏菌菌株擴增的結果，3.陰性對照(水)4.葡萄球菌菌株擴增的結果；5.大腸桿菌菌株擴增的結果；
【具體實施方式】
[0030]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0031]本文所用到的腸炎沙門氏菌購自中科院微生物所菌種庫。
[0032]實施例1
[0033]在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸炎沙門氏菌，37°C培養(yǎng)24小時。4°C以14，OOOrpm離心10分鐘，并小心棄去上清液。將沉淀物重新懸浮于200 μ I的PBS中，在56°C下孵育20分鐘，然后在100°C下將懸浮液立即在冰上冷卻8分鐘，以14，OOOrpm離心5分鐘，在4°C下，取5 μ L上清液用作PCR的模板DNA。
[0034]標準計數(shù)法檢測，菌體為IO81g CFU/mL。
[0035]提取增菌肉湯的DNA,采用Qiagen公司的DNA提取試劑盒(Qiagen Blood &CellCulture DNA Maxi KU，貨號13362)，并按其操作說明提取基因組DNA。制備核酸標準樣品。
[0036](I)取細菌增菌培養(yǎng)液IOOmL,加到500mL無菌離心管中,4000g,4°C離心15min ；
[0037](2)吸棄上清，取沉淀lmL，加TE溶液(ρΗ8.0) 10mL，懸浮，加0.5mL 100g/L十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 50 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL),混勻，37°C溫浴Ih ；
[0038](3)加 2mL NaCl (5mol/L)，混勻，加 1.5mL CTAB-NaCl 混合溶液(100g/L CTAB 和
0.7mol/L NaCl)，混勻，65°C溫浴 20min ；
[0039](4)取上清，加等體積酚-氯仿-異戊醇混合液，(混合液中酚:氯仿:異戊醇的體積比為25:24:1)，混勻，6000g離心IOmin ；
[0040](5)取上清，加等體積氯仿-異戊醇混合液(混合液中氯仿:異戊醇的體積比為24:I )，混勻，6000g 離心 IOmin ；
[0041](6)取上清,加0.6倍體積異丙醇,輕輕`混勻，13000g離心IOmin ；
[0042](7)取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLTE溶液(pH8.0)溶解，此即為細菌基因組核酸溶液。置于_20°C備用。
[0043]其中，上文所述ρΗ8.0的TE緩沖液組成:10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)
[0044]配制500ml 的 ρΗ8.0 的 TE 緩沖液的方法:量取 5ml IM Tris-HCl PH=8.0 和 Iml
0.5M EDTA PH=8.0的溶液于500ml燒杯中，向燒杯中加入約400ml蒸餾水均勻混合；將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌；室溫保存。
[0045]實施例2
[0046]沙門氏菌的PCR檢測試劑盒，包括:
[0047](I)引物上、下游各 15mM，100 μ I。(2) 10XPCR緩沖液(含Mg2+20mM)，1.5ml。(3)dNTPs (IOmM)，1.5ml。(4)純化水，3.0ml。(5) Taq DNA 聚合酶(5U/μ I)，100 μ I。
[0048]放入0.2ml的離心管中，把提取的菌體DNA I μ I加入上述體系中，總體積為20 μ I,離心混勻后置PCR儀上進行自動化擴增反應。
[0049]反應條件為:95°C預變性lmin，95°C變性30s，60°C退火50s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
[0050]取5 μ I PCR擴增產(chǎn)物點樣于2%瓊脂糖凝膠中進行檢測，電壓為110V，電泳時間為35min，然后觀察PCR擴增產(chǎn)物有無預期的DNA特異性片段。結果表明，在180bp左右出現(xiàn)I條特異的條帶，而陰性對照則無條帶出現(xiàn)。
[0051]實驗例3
[0052]分別計算原料樣品，取摻入腸炎沙門氏菌0.1~1%的各類食品(肉、蛋、奶)，按照下述方法，提取樣品DNA:
[0053]米用Qiagen 公司的 DNA 提取試劑盒(Qiagen Blood & Cell Culture DNA MaxiKU，貨號13362)，并按其操作說明提取基因組DNA。制備核酸標準樣品。
[0054](1)取細菌增菌培養(yǎng)液IOOmL,加到500mL無菌離心管中,4000g,4°C離心15min ；
[0055](2)吸棄上清，取沉淀lmL，加TE溶液(ρΗ8.0) 10mL，懸浮，加0.5mL 100g/L十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 50 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL),混勻，37°C溫浴Ih ；
[0056](3)加 2mL NaCl (5mol/L)，混勻，加 1.5mL CTAB-NaCl 混合溶液(100g/L CTAB 和
0.7mol/L NaCl)，混勻，65°C溫浴 20min ；
[0057](4)取上清，加等體積酚-氯仿-異戊醇混合液，(混合液中酚:氯仿:異戊醇的體積比為25:24:1)，混勻，6000g離心IOmin ；
[0058](5)取上清，加等體積氯仿-異戊醇混合液(混合液中氯仿:異戊醇的體積比為24:I )，混勻，6000g 離心 IOmin ；
[0059](6)取上清，加0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻，13000g離心IOmin ；
[0060](7)取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLTE溶液(pH8.0)溶解，此即為細菌基因組核酸溶液。置于_20°C備用。
[0061]DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測并計算其濃度。將提取的DNA模板進行適度稀釋，用紫外分光光度計測定260nm波長下的OD值，DNA含量=OD260為50 μ g/ml (雙鏈DNA)，將其逐步稀釋，分別取I μ I為模板進行PCR反應，確定DNA最低檢測濃度為5ng，腸炎沙門氏菌DNA樣品稀釋后含量為5ng、10ng、20ng、40ng、80ng幾個梯度的樣品進行以下實驗:
[0062]沙門氏菌的PCR檢測試劑盒，包括:
[0063](1)引物上、下游各 15mM，100 μ I。(2) 10XPCR緩沖液(含Mg2+20mM)，1.5ml。(3)dNTPs (IOmM)，1.5ml。(4)純化水，3.0ml。(5) Taq DNA 聚合酶(5U/μ I)，100 μ I。
[0064]放入0.2ml的離心管中，把提取的DNA I μ I加入上述體系中，總體積為20μ 1，離心混勻后置PCR儀上進行自動化擴增反應。
[0065]反應條件為:95°C預變性lmin，95°C變性30s，60°C退火50s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
[0066]取5 μ I PCR擴增產(chǎn)物點樣于2%瓊脂糖凝膠中進行檢測，電壓為110V，電泳時間為35min，然后觀察PCR擴增產(chǎn)物有無預期的DNA特異性片段。結果如圖2，表明，樣品濃度在5ng以上的泳道中，都能在180bp左右出現(xiàn)I條特異的條帶,而陰性對照則無條帶出現(xiàn)。
[0067]實驗例4
[0068]以大腸桿菌、葡萄球菌為對照菌，利用實施例3所述檢測方法同時對腸炎沙門氏菌菌株和對照菌株進行PCR檢測，然后對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，實驗結果見圖3。由圖可知，引物只對腸炎沙門氏菌(泳道3)出現(xiàn)PCR陽性擴增反應，對照組(泳道4、5)未出現(xiàn)特異性片段，該引物顯示了良好的特異性。利用本發(fā)明所述的引物檢測樣品中的DNA，不但減少了引物用量，節(jié)約成本，而且縮短了檢測時間，提高檢測效率。
[0069]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進也應視為本發(fā)明的保護范 圍。
【權利要求】
1.一種腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis) PCR檢測引物,其特征在于:堿基序列為 SEQ ID N0.1~2。
2.如權利要求1所述引物在檢測食品中、水體中、畜禽飼料中的腸炎沙門氏菌檢測方面的應用?！?br> 【文檔編號】C12Q1/68GK103820534SQ201210468171
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年11月19日 優(yōu)先權日:2012年11月19日
【發(fā)明者】謝克煥 申請人:大連德通生物技術開發(fā)有限公司