專利名稱：一種水稻OsMYB基因的編碼序列和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學、基因工程技術領域，具體涉及一種在水稻中表達的轉錄因子基因的克隆，轉基因載體的構建，以及基因的應用。
背景技術：
水稻是我國最重要的糧食作物，同時也是農業(yè)生產中用水最多的作物。干旱嚴重影響了水稻的產量，如何減少水稻對水的依賴，使其具有節(jié)水抗旱的特性，對我國的糧食、 水和生態(tài)安全具有重要意義。利用分子生物學和基因工程技術進行分子育種，將抗旱相關基因轉入優(yōu)良的水稻品種中，改良其抗旱性，培育既抗旱又高產優(yōu)質的農作物新品種是抗旱育種的有效途徑之一。本研究通過水稻基因芯片的方法篩選到了多個干旱誘導基因如 (fls#7i )，通過轉基因技術調節(jié)這些基因的體內表達水平，可以改變水稻的抗旱能力。本申請中涉及的MYB轉錄因子是植物轉錄因子中最大的家族之一，以含有保守的 MYB結構域為共同特征，現(xiàn)在的研究證明，它廣泛參加了植物次生代謝調控、細胞形態(tài)發(fā)生、 脅迫應答、分生組織形成及細胞周期控制等(喬孟等，2009; Xie et al.，2010)。MTO家族含有廣3個由5廣53個氨基酸組成的呈螺旋-轉折-螺旋構象的不完全重復序列，根據(jù)結構域R (重復)數(shù)量分為3個亞族含有1個R結構域的Rl-MYB亞族，含兩個R的R2R3-MYB 亞族和含3個R的R1R2R3-MYB亞族(Stracke et al.，2001)。植物中絕大多數(shù)MYB轉錄因子屬于R2R3-MYB亞族，以N-端含有由兩個MYB結構域構成的DNA結合功能域為共同特征 (Martin 禾口 Paz—Ares，1997)。植物中基因數(shù)目眾多，近十年來人們對基因進行了大量而廣泛的研究，在擬南芥、水稻、玉米和棉花中分別鑒定了 198、183、80和200個糾方基因，而在小麥中僅鑒定到23個糾方基因(Chen et al.，2005)，對其功能也有了深入的了解。大量研究結果表明 MYB基因參與植物生長過程中的多種生理生化反應，如調控次級新陳代謝植物，細胞形態(tài)發(fā)生，調控花和種子的形成，控制細胞循環(huán)等。此外，基因在抵御和應答逆境脅迫中也起著重要的作用，如水稻在脅迫信號轉導網(wǎng)絡中起重要的作用，過量表達的轉基因擬南芥和番茄均表現(xiàn)強的抗低溫及干旱作用(Vannini et al. ,2004; Candida et al. ,2007)； Abe等Q003)證明JiAT似參與干旱脅迫應答，Dai等Q007)發(fā)現(xiàn)AsMSI-J 過量表達能提高轉基因擬南芥對低溫、干旱、高鹽等的抗性；Liang等000 發(fā)現(xiàn)AtMYB61參與調節(jié)氣孔的開閉以減少水分散失。另有證據(jù)表明，保衛(wèi)細胞中特異表達的基因參與了對干旱脅迫應答的負調控作用(Cominelli et al. 2005)。擬南芥的JiiffiG 和J轉錄因子，在逆境下表達增強，同時也增強了干旱應答基因《/」 J？和JMiffi/的表達。在干旱脅迫下，JiATG和JiAT似蛋白也作為ABA途徑的轉錄激活子發(fā)揮功能(Abe et al.，2003)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種受干旱誘導的轉錄因子凡其編碼序列和含該核酸序列的載體及宿主。
3
本發(fā)明的另一目的是提供編碼水稻OsMYB蛋白的基因在提高植物抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、抗鹽等)中的應用。本發(fā)明的再一目的是提供編碼水稻OsMYB蛋白的基因在調節(jié)植物抗逆性相關基因表達，增強水稻抗逆性的應用。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的一方面提供了一個新的水稻轉錄因子的核苷酸順序，它編碼一個受干旱誘導的轉錄因子《sMS (0s05g044M00)，涉及調控其它基因的轉錄，主要表現(xiàn)是能夠增加水稻的抗旱性。水稻AsMS (0s05g0442400)基因全長1198bp， 其OsMYB的開放閱讀框為930bp，其中內含子(下劃線標出)和cDNA編碼區(qū)序列長 549bp (黑體標注)，如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，本基因編碼182個氨基酸，如SEQ ID NO. 3 所示。本發(fā)明還提供了用于從水稻mRNA中通過反轉錄PCR克隆此轉錄因子OsMYB的引物序列，該擴增水稻OsMYB基因的引物為(SEQ ID NO. 4)
BamHI0s05g0442400(c)-Fl :CGCGGATCCATGGCGTTCTACCTCGGCAGCA SacI0s05g0442400(c) -R CGAGCTCTCATGGGGCAGTGATGTCGTG 前述的水稻OsMYB蛋白，其結構中含有2個SANT區(qū)域。本發(fā)明還提供含有上述水稻OsMYB基因的載體。本發(fā)明還提供含有上述水稻基因載體的宿主。優(yōu)選地，所述宿主為真核細胞。更優(yōu)選地，所述宿主為水稻。本發(fā)明還提供含有上述水稻OsMYB基因的轉化植物細胞。本發(fā)明還提供上述水稻基因在提高植物抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、 抗鹽等)中的應用。本發(fā)明進一步提供上述水稻基因在調節(jié)植物抗逆相關基因表達，增強植物抗逆性中的應用。本發(fā)明還提供一種利用轉基因技術將編碼水稻轉錄因子的核苷酸序列轉化到水稻中，以改變水稻抗旱性的能力的方法，具體步驟如下
(1)將水稻基因的編碼區(qū)連接于植物表達載體，形成含有水稻基因的植物過表達載體。(2)將步驟1中的植物過表達載體轉入農桿菌EHA105中，將含有表達載體的農桿菌侵染水稻愈傷，(在經(jīng)過共培養(yǎng)、除菌、抗生素篩選和分化(大約4個月的時間)，獲得水稻OsMYB基因的過表達的轉基因植株。水稻中過表達OsMYB基因的轉基因水稻能夠提高水稻的抗旱能力。本發(fā)明還提供了一種用于檢測轉基因水稻中表達量的方法，主要利用熒光定量 PCR的方法。具體步驟為取轉基因水稻的葉片，用TRIzoI法抽提水稻RNA，并用DNaseI消化DNA，然后反轉錄形成cDNA，以其為模板進行熒光定量PCR進行分析。熒光定量PCR引物核苷酸序列為(SEQ ID NO. 5)
qPCR-4424-F GGTCGGTGAAGACGCGGACTC qPCR-4424-R: TGTCGTGGATGCTCTTACGCTTG 。本發(fā)明還提供了一種在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達如前所述OsMTO蛋白質的方法，具體步驟如下把OsMYB基因(SEQ ID N0. 2)連接到pET3h載體中，轉化到大腸桿菌BL21 (DE3) trxB—，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主菌(卡那霉素50mg/L)。37°C培養(yǎng)至0D600為0. 6 左右時加上0. ImM異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷進行誘導蛋白的表達，16°C誘導20小時。收集菌體，超聲波破碎，離心收集上清，過鎳柱分離純化蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白的純化情況。進一步，本發(fā)明中所述的水稻OsMYB蛋白，其為具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的多肽或其活性片段。本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發(fā)明的水稻OsMYB多肽時，可以將水稻OsMYB編碼序列可操作地連接表達調控序列，從而形成水稻OsMYB蛋白表達載體。本發(fā)明中，可用熒光定量PCR技術分析水稻OsMYB基因的表達，即分析水稻OsMYB 的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和表達量。本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果
(1)本發(fā)明提供的水稻基因及其編碼蛋白在植物抗逆性方面具有明顯的作用， 能夠明顯降低在干旱土地上種植的各種農作物在生物產量上的損失，具有很大的應用價值。(2)利用轉基因技術得到改良的含有本發(fā)明水稻基因的轉化植物在干旱、 高鹽等條件下，生長、生存狀況明顯優(yōu)于野生型植物，表明了水稻基因能夠明顯提高植物的抗逆性。(3)本發(fā)明提供的水稻基因能夠有效調節(jié)逆境相關的轉錄因子和蛋白，具有潛在的、巨大的應用價值。本發(fā)明中，術語“flsiifi 的開放閱讀框”指編碼完整的水稻OsMYB蛋白的核苷酸序列，如SEQ NO. 1中的核苷酸及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 2的核苷酸序列中，有一個或者多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列的同源性低至約85%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 3所述的序列。該術語還包括在中度嚴謹條件下，更加的在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO. 1中核苷酸序列的同源性至少85%，較佳的至少80%，更加的至少90%， 最佳的至少95的核苷酸序列。術語還包括能編碼具有與天然水稻OsMYB基因相同功能的蛋白質的SEQ ID NO. 1 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限于):若干個(通常為1-90個，最佳的1-10個)核苷酸的缺失、插入或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內，最佳的為5個以內)核苷酸。


圖1干旱脅迫條件下水稻OsMYB的表達情況。圖2水稻OsMYB的序列信息與同源性分析(AT 擬南芥；OS 水稻)。圖3轉基因植株的鑒定。其中，編號廣6為不同的轉基因水稻植株。圖4不同處理(脫落酸、氯化鈉、甘露醇)水稻苗期在培養(yǎng)基上的生長情況。圖5水稻苗期干旱情況。圖6水稻生殖期干旱花粉粒的育性分析。
圖7 OsMYB過表達水稻中抗旱相關基因的表達譜。圖8 OsMYB蛋白的原核表達分析。圖9 OsMYB蛋白的瞬時表達定位。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，均按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商建議的條件。實施例1干旱處理時水稻基因OsMYB在水稻品種日本晴的生殖發(fā)育期的芯片表達。1.脅迫處理
水稻日本晴種子催芽后，移栽到溫室塑料盆的土中培養(yǎng)，在孕穗期(減數(shù)分裂時期)進行干旱處理。當盆中土層無水時開始斷水，作為干旱處理的開始，待土壤水分降低到30%左右時，維持一個禮拜，取不同大小(2 3mm，3^4mm, 4^5mm, 5^7mm)的水稻花，分別收集并編號， 以正常生長條件下的水稻作為對照，做三次重復。2.基因芯片分析干旱條件下基因的表達
干旱條件下水稻基因表達分析由安捷倫公司代測。分析不同花發(fā)育時期基因在水稻品種日本晴的表達。結果顯示OsMYB基因在干旱脅迫條件下上調，與用熒光定量PCR 驗證芯片結果是一致的(圖1所示)。
實施例2水稻OsMYB基因cDNA片段的克隆。1. RNA的提取取干旱處理的水稻花，在研缽中用液氮冷凍后研磨成粉狀，加入盛有1 ml TRIZOL試劑(Promega)的EP管，充分振蕩后，室溫放置5分鐘，于4°C，12000 rpm 離心IOmin后，上清液移至新的EP管中，加上200μ1氯仿混成乳狀，室溫靜置5分鐘，12000 rpm離心IOmin后，上清液移至新的EP管中，加入兩倍體積異丙醇沉淀RNA，溶解后37°C用 DNaseI (Fermentas)消化降解殘留DNA 1小時。然后在分光光度計上測定RNA含量。2.反轉錄按照TaKaRa公司的PrimeScript Reverse Transcriptase說明書進行操作離心管中加入水稻總 RNA 5 μ (5 μδ), Oligo (dT)17 Primer (50 Mmol/L) 1 μ ， dNTP (10 mmol/L) 1 μ ，并用雙蒸水加至10 μ ；瞬時離心使液體集中于管底，65°C保溫5 min，迅速在冰上冷卻2 min以上。在上述混合物中加入5XPrimeScript Buffer 4 μ ， RNase 抑制劑(40 U/μΙ) 0. 5 μ , PrimeScript Reverse Transcriptase (200 U/μΙ) 0. 5 μ ，雙蒸水加至20 μ ，離心使液體集中于管底，42°C保溫1 h，70°C滅活15 min，冰上冷卻， 得到水稻cDNA第一鏈。3. cDNA 的克隆
根據(jù)GenBank中水稻數(shù)據(jù)庫信息中提供的序列信息，設計引物(SEQ ID N0. 4)，采用 RT-PCR方法進行cDNA全長克隆。通過RT-PCR得到一個包含有完整開放讀框的編碼區(qū)，長度為549bp ；回收，連接到pMD19-T載體上，并進行測序。測序結果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST分析，結果顯示其與水稻注釋基因0s05g0442400完全匹配。同時，其核苷酸序列與已知禾本科植物大麥的AK367954. 1有80%同源性，和玉米的基因L0C100285249有86%同源性，與高粱的基因 XM_002456635. 1有80%同源性。其結構中含有2個MYB結構域。實施例3水稻OsMYB的序列信息與同源性分析。本發(fā)明水稻AsMS全長編碼區(qū)的長度為549bp，其序列如SEQ ID NO. 2所示。根據(jù)全長cDNA推導出水稻OsMYB的氨基酸序列，共182個氨基酸殘基，分子量為20381. 5道爾頓，等電點(Pl)為7. 11，其序列如SEQ NO. 3所示。預測顯示此蛋白為不穩(wěn)定的疏水性蛋白。將此蛋白在GenBank進行BLAST比對，獲得與此蛋白同源的蛋白，用Clustal X軟件進行比對，然后用MEGA 4軟件根據(jù)鄰近法構建進化樹(圖2)。實施例4水稻OsMYB基因在水稻中過表達及轉基因植株的鑒定 1.水稻基因的表達載體的構建
根據(jù)水稻基因的全長序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將水稻基因的cDNA克隆至中間載體 (如PMD19-T簡單載體，TAKARA)，進一步克隆到過表達載體(如pCAMBIA1301U)上，測序， 在保證閱讀框架正確的前提下再將該過表達載體轉入農桿菌中，并轉化模式植物水稻日本晴。2.農桿菌介導法來進行水稻轉基因。A.誘導愈傷組織
1)選取成熟飽滿的種子，去掉內外穎，用純凈水洗3-4次，再用70%乙醇浸泡2min，用純凈水洗7-8次，用0. 1%的升汞處理15min，IOOrpm02)在超凈臺中棄去升汞，用無菌水洗數(shù)次，在無菌干凈濾紙上吸干水分，置于N6D 培養(yǎng)基上，胚朝下或接觸培養(yǎng)基，28°C，暗培養(yǎng)21天。12-15粒/組培瓶。B.繼代培養(yǎng)
將愈傷周圍的胚根、胚芽剝除干凈，愈傷在干凈濾紙上晾一下，轉移至N6D繼代培養(yǎng)基上，28 °C，暗培養(yǎng)7-10天。C.前培養(yǎng)
將繼代的愈傷組織轉移至前培養(yǎng)基上，28 0C，暗培養(yǎng)3-4天。D.農桿菌EHA105的培養(yǎng)
將上一部分實驗中得到的正確克隆的農桿菌菌液涂布于YEB三抗平板(鏈霉素、利福平和卡那霉素抗性)上，28°C，暗培養(yǎng)約36小時。E.侵染與共培養(yǎng)
1)將前培養(yǎng)的愈傷在無菌濾紙上晾一下，并集中轉移至平皿中。2)取滅菌小勺刮取農桿菌4-6勺于感染用的液體培養(yǎng)基中，攪拌至懸浮均勻(無大的菌塊存在)。3)將愈傷轉至離心管中，輕輕翻轉混勻，靜置15 20min，期間間隔5min混勻一次。4)將菌液倒出，愈傷置于無菌濾紙上吹干約1.5小時以上，保證菌液吸干，接至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，20 0C，暗培養(yǎng)2-3天。
F.除菌
1)將共培養(yǎng)的愈傷轉移至50mL的離心管，用無菌水清洗3次以上，直至液體比較清亮。2)倒出無菌水，用含有500mg/L頭孢霉素的N6D液體培養(yǎng)基清洗，每次lOOrpm， 15 20min，3 4 次。3)將愈傷倒在干凈滅菌濾紙上，吸干吹干2小時以上，保證吸干。4)將干燥的愈傷轉至除菌培養(yǎng)基上，28°C，暗培養(yǎng)，7 10天。G.篩選
將沒有被農桿菌污染的愈傷轉移至篩選培養(yǎng)基(N6D+50mg/L潮霉素B+250mg/L頭孢霉素)上，28°C，暗培養(yǎng)。每15 20天可以更換一次培養(yǎng)基，篩選時間不得少于45天。H.分化
將經(jīng)過篩選新長出來的愈傷轉移至分化培養(yǎng)基(MS+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+2mg/L KT+0. 2mg/L IAA+ 50mg/L潮霉素+250mg/L頭孢霉素)28°C，16小時光培養(yǎng)。在進行分化培養(yǎng)前，可以先將愈傷暗培養(yǎng)幾天以作為預分化。也需要定期的更換培養(yǎng)基。I.生根
將分化出來的轉基因苗Olcm高)，剝除多余的愈傷組織，并剪去根(留約0. 5cm)，移至 1/2MS培養(yǎng)基中生根。28°C，16小時光培養(yǎng)。J.煉苗與移栽
生根結束后，可以除去生根培養(yǎng)基后，將苗泡于水中數(shù)日進行煉苗，然后移栽入土中生長。3.轉基因植株的鑒定
剪取轉基因水稻葉片，用CTAB法提取水稻葉片DNA，通過檢測潮霉素基因的方法鑒定轉基因情況(圖3)。并用TRIZOL法抽取葉片RNA，反轉錄成cDNA (方法同實例2)，根據(jù)基因序列設計引物進行熒光定量PCR分析轉基因水稻中OsMYB基因的表達情況，具體操作按照TAKARA公司試劑盒說明操作，熒光定量PCR儀為ABI Steponeplus .實施例5 OsMYB過表達轉基因水稻植株的抗逆性鑒定
由于本基因是干旱誘導的，芯片分析表明，該基因在干旱條件下表達明顯提高。因此對含水稻基因的過表達轉基因水稻(日本晴)苗期和成株期水分脅迫實驗，分析水稻基因OsMYB的抗逆(包括但不限于抗旱、抗鹽等)作用。1苗期抗旱處理
把日本晴水稻種子和轉基因水稻種子，剝去外殼后，用50%次氯酸鈉溶液消毒20分鐘后，播種在含有1/2MS以及分別含有ABA (4uM)、NaCl (150mM)、甘露醇(200mM)的1/2MS培養(yǎng)基中，這樣水稻就一直會受到ABA、NaCl和甘露醇(作為干旱脅迫的模擬物)的脅迫，28°C 光照培養(yǎng)(16小時光照8小時黑暗)12天后，測定水稻的生長高度，以及在甘露醇中生長單個水稻的質量。水稻相對生長速率等于不同處理水稻的高度或長度/正常條件下生長水稻的高度或長度。結果顯示，過表達基因的轉基因水稻能夠明顯的增加在脅迫條件下的生長速率，特別是根的延長速率要明顯的高于對照(圖4)。把發(fā)芽好的水稻(日本晴和轉基因水稻)每個盆中(黑土 蛭石=7:3)種植5-6棵的對照和轉基因水稻，待水稻長到5葉期時在水稻大棚中讓其水分自然蒸發(fā)進行干旱處理，大約干旱8天后，轉基因水稻的葉片的存活程度明顯較高。復水后3天，轉基因水稻變綠存活率也明顯比對照高。蒽酮法測定可溶性糖和酸性茚三酮法測定脯氨酸表明，在干旱條件下，轉基因的水稻積累大量的可溶性糖和脯氨酸，表現(xiàn)出較強的抗旱性(圖5)。2開花期抗旱處理
成株期水稻實行水分自然蒸發(fā)干旱法。水稻種植在含水稻土的方形盆中，待水分揮發(fā)至30%左右，保持3天，測定劍葉的脯氨酸含量，并用I2-KI進行染色觀察水稻花粉的活性 取剛開穎但花藥還未開裂的花并采集水稻成熟花藥，將花藥于載玻片上，加1滴蒸餾水，用鑷子將花藥搗碎，使花粉粒釋放。晾干，大約IOmin ；加1 2滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片， 5min ；在顯微鏡下觀察，觀察2 3張片子，每片取3_5個視野，統(tǒng)計花粉的染色率，其中深藍色的花粉為可育花粉，紫紅或者黃色的為不育花粉，花粉育性等于可育花粉數(shù)/(可育加上不育花粉數(shù))。結果顯示，轉基因的水稻花粉粒的育性在干旱條件下要明顯高于對照組的水稻(圖6)。實施例6應用熒光定量PCR方法檢測轉OsMYB基因水稻中抗逆基因表達的變化提取轉OsMYB基因水稻葉片的RNA，反轉錄成cDNA，然后利用TAKARA公司的熒光定量
PCR kit進行熒光定量分析(具體操作參照相關公司的說明書)。然后根據(jù)-AACT分析基因的表達情況。具體分析的基因為現(xiàn)有報道的與抗旱相關的基因，分別為Zi^、ftffiS、/^G、 DR22等。結果顯示(圖7)此基因的過表達能夠明顯的增加Zi^和歷？忽的表達，同時也說明此基因的抗旱性可能是通過轉錄調控抗旱相關基因來達到抗旱的目的。
基因名稱基因號MYB0s05g0442400DR220s01g0733500DREBAY064403. 1LEA0s05g0542500 實施例7利用原核表達的方式表達OsMYB蛋白
把OsMYB基因連接到pET32a載體中，轉化到大腸桿菌BL21 (DE3) trxB_，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主菌(卡那霉素50mg/L)。37°C培養(yǎng)至0D600為0.6左右時加上0. ImM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷進行誘導蛋白的表達，16°C 20小時。收集菌體，超聲波破碎， 離心收集上清，過鎳柱分離純化蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白的純化情況。電泳結果顯示 (圖8)我們分離到了原核表達的OsMYB蛋白。實施例8煙草中分析水稻OsMYB基因的瞬時表達
把flslfi 基因連接到瞬時表達pEYFP載體上，轉化農桿菌，用微型注射器沿著煙草葉脈把含有瞬時表達質粒的農桿菌注射到煙草葉片中，培養(yǎng)3天后，撕取注射位置的葉片在熒光顯微鏡下觀察并拍照片，結果顯示(圖9)此蛋白定位在細胞核內，為細胞核蛋白。
權利要求
1.一種分離出的水稻《sMS基因，其特征在于為一種特定序列的DNA分子，長1198bp， 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種如權利說明要求1所述的水稻基因的蛋白質分子，其特征在于氨基酸編碼序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.一種將權利要求1所述的水稻OsMYB基因的轉化到水稻中，并改變水稻抗旱性的方法，其特征在于具體步驟如下(1)將編碼具有水稻基因的開放閱讀框可操作的連接入植物表達載體；(2 )將步驟(1)中的植物過表達載體轉入農桿菌中，將含有表達載體的農桿菌侵染水稻愈傷，經(jīng)過共培養(yǎng)、除菌、抗生素篩選和分化，獲得水稻基因的過表達的轉基因植株。
4.一種用于體外檢測OsMYB基因在植物中表達量的方法，主要利用熒光定量PCR的方法，其特征在于具體步驟為取轉基因水稻的葉片，用TRIzoI法抽提水稻RNA，并用DNaseI 消化DNA，然后反轉錄形成cDNA，以其為模板進行熒光定量PCR進行分析；熒光定量PCR弓丨物序列為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
5.一種在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達如權利要求2所述OsMTO蛋白質的方法，其特征在于具體步驟如下把SEQ ID NO. 1的OsMYB基因連接到pET3h載體中，轉化到大腸桿菌 BL21 (DE3) trxB",于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主菌，37°C培養(yǎng)至0D600為0. 6左右時加上0. ImM異丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷進行誘導蛋白的表達，16°C誘導20小時；收集菌體，超聲波破碎，離心收集上清，過鎳柱分離純化蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白的純化情況。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學、基因工程技術領域，具體為一種在水稻中表達的轉錄因子OsMYB的編碼序列，其主要作用是能夠增強水稻抗性(包括但不限于抗旱、低溫和耐高鹽脅迫)，同時受干旱誘導表達。本發(fā)明還包含此基因序列的重組載體，及應用此載體轉化的轉基因植物。應用本發(fā)明所涉及的基因在植物中轉化表達，可對提高轉基因水稻的抗性。本發(fā)明提供的基因在植物抗逆性方面具有明顯的作用，具有很高的應用價值，能夠明顯減少農作物在干旱、半干旱或者高鹽、低溫等條件下產量和生物產量的損失。
文檔編號C12R1/19GK102329805SQ201110292959
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權日2011年9月30日
發(fā)明者葛曉春, 郭長奎, 馬紅 申請人:復旦大學