專利名稱：一種由葡萄糖制備(2s,3s)-2,3-丁二醇與(3s)-乙偶姻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種由葡萄糖制備Os，3S)-2，3-丁二醇與(3S)_乙偶姻的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2，3_ 丁二醇包含 3 個(gè)異構(gòu)體(2R，3R)-2，3-丁二醇，QS，3S) _2，3_ 丁二醇與 meSO-2，3-丁二醇。乙偶姻包含兩個(gè)對映異構(gòu)體(3R)-乙偶姻與(3S)-乙偶姻。2，3_ 丁二醇與乙偶姻的各種異構(gòu)體是不對稱合成中的重要原料，都是極具應(yīng)用潛力的醫(yī)藥中間體。目前生產(chǎn)手性2，3- 丁二醇與乙偶姻的方法包括化學(xué)法與生物法。其中化學(xué)法反應(yīng)條件復(fù)雜，難于控制，成本很高，而且產(chǎn)物的光學(xué)純度很低。而生物法具有反應(yīng)類型多樣，反應(yīng)特異性強(qiáng)，溫度、壓力條件溫和，環(huán)境友好，能耗低等優(yōu)勢。以生物法可以生產(chǎn)各種2，3-丁二醇與乙偶姻的異構(gòu)體，例如以meso-2，3-丁二醇為底物，以工程菌大腸桿菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) (pETDuet-ydjL)為催化劑，在 pH 8. 0，37°C下反應(yīng) 12 小時(shí)， 可以獲得高濃度的(3S)-乙偶姻(36. 7克/升)，但是該底物價(jià)格昂貴，不適合實(shí)際生產(chǎn)。還有，已報(bào)道的利用生物法生產(chǎn)QS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的文獻(xiàn)如下1生產(chǎn)QS，3S)-2，3-丁二醇，濃度3.7克/升，對映體過量百分比(enantiomeric excess, e. e. ) 95 %，底物為乙偶姻。其方法為構(gòu)建含有QS，3S) _2，3_ 丁二醇脫氫酶的工程菌大腸桿菌JM109/PMLBD119，以該工程菌為生物催化劑轉(zhuǎn)化乙偶姻制備QS，3S)_2， 3- 丁二酉享(Ui, S. , Takusagawa, Y. , Ohtsuki, Τ. , Mimura, A. , Ohkuma, Μ. , Kudo, Τ., 2001.Stereochemical applications of the expression of the L_2,3—butanediol dehydrogenase gene in Escherichia coli. Lett. Appl. Microbiol. 32,93-98.)。2生產(chǎn)(3S)_乙偶姻，濃度3. 2克/升，光學(xué)純度未知，底物為2，3_ 丁二醇。其方法為以含有OS，3S)-2，3-丁二醇脫氫酶的菌株解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum) C-1012 轉(zhuǎn)化 2，3- 丁二醇制備(3S)-乙偶姻(Ui，S.，Masuda, H.， Muraki, H. ,1984. Laboratory-scale production of acetoin isomers(D(-)and L(+))by bacterial fermentation. J. Ferment. Technol. 62,151-156.)。然而，上述方法中使用的底物2，3_ 丁二醇與乙偶姻的成本均比較高，不適合實(shí)際生產(chǎn)，制約了該方法的應(yīng)用。而檢索結(jié)果知，以廉價(jià)的葡萄糖為底物，以兩步反應(yīng)同時(shí)生產(chǎn) (2S，3 -2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，目前未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種能夠以廉價(jià)的葡萄糖為原料生產(chǎn)Os，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法。本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是
以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)CICC 10011 (購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)03，3幻-2，3-丁二醇與!11^0-2，3-丁二醇的混合物，然后以該混合物作為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 23857(購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品保藏中心)的底物，利用枯草芽孢桿菌ATCC 23857將meSO-2，3-丁二醇轉(zhuǎn)化為 (3S)-乙偶姻，而(2S，3S)-2，3-丁二醇仍存在于轉(zhuǎn)化液中，從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)生產(chǎn)(2S，3S)-2， 3-丁二醇與(3S)-乙偶姻。整個(gè)過程可用下式表示
權(quán)利要求
1.一種由葡萄糖制備OS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，步驟如下(1)、制備生物催化劑終濃度為70 100克細(xì)胞干重/升的肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumonia)CICC 10011 休止細(xì)胞；O)、利用步驟(1)制備的肺炎克雷伯氏菌CICC 10011休止細(xì)胞生物催化劑制備QS， 3S) -2，3- 丁二醇與 meso-2，3- 丁二醇的混合物；其中以菌體濃度為14 56克細(xì)胞干重/升的生物催化劑即肺炎克雷伯氏菌CICC 10011休止細(xì)胞，在37士2°C，pH 5. 0 9. 0條件下轉(zhuǎn)化初始濃度為80 160克/升的葡萄糖，反應(yīng)3 10小時(shí)后，得到含OS，3S) -2，3- 丁二醇與meso-2，3- 丁二醇混合物的轉(zhuǎn)化液；將所得轉(zhuǎn)化液以8，000士500rpm離心10 15分鐘，去除所加入的生物催化劑，收集上清液進(jìn)行減壓蒸餾，待水份完全蒸干后，餾分即為OS，3S) -2，3- 丁二醇與meso-2，3- 丁二醇的混合物；(3)、再制備生物催化劑終濃度為20 50克細(xì)胞干重/升的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) ATCC 23857 休止細(xì)胞；(4)、利用步驟(3)制備的枯草芽孢桿菌ATCC23857休止細(xì)胞生物催化劑拆分步驟⑵ 中制得的OS，3S) -2，3- 丁二醇與meso-2，3- 丁二醇的混合物，同時(shí)制備QS，3S) -2，3- 丁二醇與(3S)-乙偶姻；其中以菌體濃度為13 20克細(xì)胞干重/升的生物催化劑即枯草芽孢桿菌ATCC 23857休止細(xì)胞，在23 45°C，pH 5. 0 8. 0條件下與步驟O)中制得的QS，3S)-2，3_ 丁二醇與meso-2，3-丁二醇的混合物進(jìn)行6 M小時(shí)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，拆分QS，3S) -2，3-丁二醇與meso-2，3-丁二醇，得到含(3S)-乙偶姻的轉(zhuǎn)化液；將所得轉(zhuǎn)化液以8，000士500rpm離心 10 15分鐘，去除所加入的生物催化劑，收集上清液進(jìn)行減壓蒸餾，蒸出液即為(3 -乙偶姻的水溶液，餾分即為OS，3S)-2，3-丁二醇；然后，將蒸出液與乙酸乙酯按等體積混合萃取(3S)-乙偶姻，同方法重復(fù)6 8次，合并各次萃取后的乙酸乙酯，進(jìn)行減壓蒸餾，得到純品(3S)-乙偶姻；將餾分與乙酸乙酯按等體積混合萃取OS，3S)-2，3-丁二醇，同法重復(fù) 6 8次，合并各次萃取后的乙酸乙酯，進(jìn)行減壓蒸餾，得到純品OS，3S) -2，3- 丁二醇。
2.如權(quán)利要求1所述由葡萄糖制備OS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，其特征在于步驟(2)所述生物催化劑即肺炎克雷伯氏菌CICC 10011休止細(xì)胞的菌體濃度為觀 42克細(xì)胞干重/升。
3.如權(quán)利要求1所述由葡萄糖制備OS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，其特征在于步驟(2)所述葡萄糖的初始濃度為100 120克/升。
4.如權(quán)利要求1所述由葡萄糖制備OS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，其特征在于步驟⑵所述pH為6. 0 7. 0 ；反應(yīng)時(shí)間為4 8小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述由葡萄糖制備OS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，其特征在于步驟(4)所述生物催化劑即枯草芽孢桿菌ATCC 23857休止細(xì)胞的菌體濃度為 15 18克細(xì)胞干重/升。
6.如權(quán)利要求1所述由葡萄糖制備OS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，其特征在于步驟(4)所述OS，3S)-2，3-丁二醇與meso-2，3-丁二醇的混合物中，meso-2, 3- 丁二醇濃度為8. 5 40克/升，QS，3S) -2，3- 丁二醇濃度為0. 66 3. 1克/升。
7.如權(quán)利要求6所述由葡萄糖制備QS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，其特征在于步驟(4)所述03，35)-2，3-丁二醇與111^0-2，3-丁二醇的混合物中，meso-2, 3-丁二醇濃度為17 32克/升，QS，3S)-2，3-丁二醇濃度為1. 3 2.5克/升。
8.如權(quán)利要求1所述由葡萄糖制備OS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，其特征在于步驟(4)所述轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的溫度為30 37°C，pH為6. 0 7. 5，反應(yīng)時(shí)間為10 18小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1所述由葡萄糖制備OS，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，其特征在于步驟(2)或(4)所述減壓蒸餾的條件是溫度50士2°C，壓力0.015 0. 098兆帕。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由葡萄糖制備(2S，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法，是以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoma)CICC 10011休止細(xì)胞生物催化劑轉(zhuǎn)化葡萄糖制備(2S，3S)-2，3-丁二醇與meso-2，3-丁二醇的混合物，并以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 23857休止細(xì)胞生物催化劑拆分(2S，3S)-2，3-丁二醇與meso-2，3-丁二醇的混合物，同時(shí)制備(2S，3S)-2，3-丁二醇與(3S)-乙偶姻。本發(fā)明方法制備的(2S，3S)-2，3-丁二醇濃度可達(dá)2.5克/升(光學(xué)純度96.9％)，(3S)-乙偶姻濃度可達(dá)29.3克/升(e.e.96.2％)，極具工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12P7/18GK102296094SQ20111024750
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者劉振, 許平, 馬翠卿 申請人:山東大學(xué)