專利名稱：一種青霉菌源殼聚糖酶基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種青霉菌源殼聚糖酶基因及其克隆表達方法。
背景技術(shù)：
纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖是自然界含量最為豐富的多糖，蘊含著巨大的糖類資源， 它們均由吡喃葡萄糖經(jīng)β_1，4糖苷鍵連接而成，不同點在于2號碳上所連接的官能團。其中殼聚糖是由D-葡萄糖胺殘基構(gòu)成，可由幾丁質(zhì)經(jīng)部分或者完全脫乙酰化獲得，在自然界中，真菌、昆蟲等體內(nèi)含量豐富。科學(xué)界十分關(guān)注殼聚糖及其水解物，因為它們具有許多重要和有開發(fā)潛力的生物學(xué)功能，比如殺菌、抗癌等，有些功能已經(jīng)被實際應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。殼聚糖酶是自然界存在的一類能夠催化水解殼聚糖β_1，4糖苷鍵的酶類，其存在范圍廣泛，從細菌到真菌，甚至病毒乃至植物，都曾發(fā)現(xiàn)有殼聚糖酶。根據(jù)氨基酸序列分析，殼聚糖酶分為5號、7號、8號、46號、75號和80號共六個家族(http://www. cazy. org/ Glycoside-Hydrolases, html)，不同家族的酶對底物的特異性有所不同。目前為止，只有少數(shù)真菌菌株被發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生殼聚糖酶，其克隆和表達的研究也較少。相對于物化方法水解幾丁質(zhì)和殼聚糖，酶法水解具有節(jié)能、環(huán)保、高效、安全、低成本等無可比擬的優(yōu)勢，能夠為幾丁質(zhì)和殼聚糖為原料的食品、制藥等行業(yè)提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。該課題其關(guān)鍵就在于高效殼聚糖酶基因的克隆和表達，也是工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種從產(chǎn)生殼聚糖酶的天然霉菌中克隆殼聚糖酶基因的方法，開辟一條新的、快捷的獲取殼聚糖酶基因的途徑。本發(fā)明的另一目的是利用該方法克隆到一個全新的殼聚糖酶基因，并將獲得的殼聚糖酶基因用于重組菌株的構(gòu)建并實現(xiàn)異源表達，最終實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖酶。本發(fā)明所述的方法包括如下步驟(1)、將已知的霉菌殼聚糖酶基因進行序列比對，找到核心保守序列；O)、設(shè)計簡并引物；(3)、以霉菌株基因組為模板，利用簡并引物通過PCR法擴增霉菌源殼聚糖酶部分基因片段；G)、利用獲得的部分基因序列，設(shè)計巢式引物，通過反向PCR法獲取全長殼聚糖
酶基因。殼聚糖酶分為5號、7號、8號、46號、75號和80號共六個家族，可以通過氨基酸序列分析找到核心保守序列。而本發(fā)明獲取殼聚糖酶基因的對象是研究較少的青霉菌 (Penicillium sp)，基因結(jié)構(gòu)與已知的其他來源的殼聚糖酶基因有較大不同，能夠發(fā)現(xiàn)新型高效的殼聚糖酶。本發(fā)明用只含殼聚糖作為唯一碳源的特殊選擇性培養(yǎng)基獲得青霉菌株，并抽提其DNA基因組。比對已知的霉菌來源的殼聚糖酶基因，找出核心保守序列NMDID⑶與YGIWGD， 設(shè)計帶有酶切位點的簡并引物。或者也可以直接在軟件Block Maker (http:// bioinformatics. weizmann. ac. il/blocks/blockmkr/www/make_blocks. html)中進行比對和尋找保守區(qū)域，然后利用軟件 C0DEH0P (http//bioinformatics. weizmann. ac. il/ blocks/codehop. html)尋找可能的簡并引物。依據(jù)引物的基本原則和要求簡并度盡可能小、Tm值盡可能高、上下游引物之距離盡可能大、上下游引物的Tm值盡可能相近等，選擇適宜的兼并引物。根據(jù)上述原則，發(fā)明人設(shè)計了一對簡并引物DFP (5‘-GCGGATCCAAYATGGAYATHGAYTG YGA-3，)和 DRP (5，-GCGAAGCTTRTCDCCCCADATNCCRTA-3，)，以青霉菌株基因組 DNA 為模板進行PCR。對擴增得到的部分基因片段進行測序，然后根據(jù)獲得的基因片段的序列設(shè)計巢式引物FP1(5-CCA GAG CAC GTT GGC ATC AA-3)、FP2(5，_GGT CTG CAA CAA CAA GCT CAT C_3，) 和 RP1(5-ACC ATA GTC GGA CTT GAC CT_3)、RP2(5，-GAG TCG ATG CCG TCT TGA TC-3，)。 分別以I3StLBamHLEcoRI和HindIII酶切消化基因組DNA并自身環(huán)化，以形成的環(huán)形DNA 為模板，利用FPl與RPl引物進行反向PCR，再以所得產(chǎn)物作為模板，利用引物FP2和RP2進行巢式PCR，對殼聚糖酶基因上下游序列進行擴增，所得產(chǎn)物連接到載體進行測序、拼接，獲得殼聚糖酶全長基因序列。根據(jù)測序結(jié)果并和現(xiàn)有殼聚糖酶基因進行比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明獲得了一種新型的殼聚糖酶基因，其DNA序列和氨基酸分別如kq ID No. 1和kq ID No. 2所示，分析表明其基因無內(nèi)含子。與已公布殼聚糖酶序列(B8M2R4)同源性為83%。在不影響殼聚糖酶蛋白活性前提下，可對SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有殼聚糖酶活性的衍生蛋白質(zhì)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)的公知常識，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性是和其功能結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)的。一般來說，只有發(fā)生在功能結(jié)構(gòu)域的位點突變可能對蛋白質(zhì)的二維和三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響其生物學(xué)活性。而對于發(fā)生在遠離功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸位點，由于這一區(qū)域不參與蛋白功能構(gòu)象， 因而氨基酸的個別點突變不會對蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性產(chǎn)生實質(zhì)性影響，從而能夠基本保留原蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。因而，優(yōu)選的，可根據(jù)公知常識和邏輯推理，通過對殼聚糖酶蛋白生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域外的氨基酸位點進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸從而獲得基本保留殼聚糖酶生物學(xué)活性的蛋白突變體，優(yōu)選的為對殼聚糖酶氨基酸位點進行點突變從而獲得基本保留殼聚糖酶生物學(xué)活性的蛋白突變體。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響殼聚糖酶基因表達的條件下，可對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。因此，本發(fā)明還保護對SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列進行的替換、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留殼聚糖酶蛋白生物學(xué)活性的DNA分子。利用基因克隆技術(shù)，可將克隆到的殼聚糖酶基因接到合適的載體上，并轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到原核生物或真核生物宿主表達制備重組殼聚糖酶。合適的原核生物宿主包括各種細菌如E. coli等，合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)等，優(yōu)選采用原核表達系統(tǒng) E. coli ο
合適的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種可商業(yè)化購買的原核或真核表達載體。一個優(yōu)選的例子是將本發(fā)明克隆到的殼聚糖酶基因采用設(shè)計插入的NdeI和B10I重組位點連接到大腸桿菌表達載體pET28a上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE!3)菌株中，用0. Immol/ L IPTG進行誘導(dǎo)表達。然后通過鎳柱親和層析獲得了有活性的殼聚糖酶。本發(fā)明提供了一種從霉菌中克隆新型殼聚糖酶基因，并進行異源表達的方法，所用的儀器、試劑均為市場上常見種類，且均可采用試劑盒進行操作，能夠大量節(jié)省基因克隆和表達所需的時間。并且酶學(xué)研究表明獲得的殼聚糖酶具有較高的活性。本發(fā)明的方法有效可靠，建立了一套行之有效的新型殼聚糖基因克隆方法，最終實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖酶， 為后續(xù)的工業(yè)應(yīng)用提供成本低廉的殼聚糖酶起始材料。


圖1為制備新型殼聚糖基因的流程圖。
具體實施例方式實施例1青霉菌的獲得利用以殼聚糖為單一碳源的培養(yǎng)基(NaNO3 0. 2%, K2HPO4 0. 1%, MgSO4 0. 05%, KCl 0. 05%,FeSO4 0. 001%，膠體殼聚糖0. 5%，pH5. 0)培養(yǎng)篩選得到能表達產(chǎn)生殼聚糖酶的普通青霉菌(Penicillium sp)。實施例2殼聚糖酶基因的克隆提取實施例1的青霉菌體DNA后，通過反向PCR(I-PCR)獲得殼聚糖酶基因。首先通過霉菌的殼聚糖酶高度保守序列設(shè)計兼并引物DFP (5’ -GCGGATCCAAYATGGAYATHGAYTG YGA-3，)和 DRP (5，-GCGAAGCTTRTCDCCCCADATNCCRTA-3，)，以青霉菌的基因組 DNA 為模板進行PCR，程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C退火lmin，72°C恒溫2min，30次循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。獲得的片段進行測序，然后根據(jù)獲得的序列進一步設(shè)計巢式引物 FPl(5-CCA GAG CAC GTT GGC ATC AA-3), FP2(5’ -GGT CTG CAA CAA CAA GCT CAT C_3’ ) 和 RP1(5-ACC ATA GTC GGA CTT GAC CT_3)、RP2(5，-GAG TCG ATG CCG TCT TGA TC-3，)。 然后以I3St I、BamHI,、EcoRI和HindIII分別酶切消化基因組DNA，并進行自身連接，以形成環(huán)形的DNA為模板，利用巢式引物進行I-PCR，得到殼聚糖酶基因上下游序列，最后獲得殼聚糖酶基因全序列。實施例3殼聚糖酶表達載體的構(gòu)建根據(jù)實施例中基因注釋得到的殼聚糖酶全長編碼序列(SEQ ID NO. 1)，設(shè)計能擴增出完整編碼閱讀框的引物，構(gòu)建表達載體。青霉菌DNA為模板，擴增殼聚糖酶全長基因。在保證閱讀框正確的前提下重組至表達載體pET28a中，再將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細胞中(轉(zhuǎn)化方法為CaCl2法或電轉(zhuǎn)化法)，以抗生素標(biāo)記法篩選(本例中為卡那霉素抗性)陽性的重組菌pET28a-CSn/DH5 a。挑取單菌落的工程菌pET28a-CSn/DH5 a 于5ml含30 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)37°C過夜，提取重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，以抗生素標(biāo)記法篩選(本例中為卡那霉素抗性)陽性的重組高效表達菌pET28a-csn/BL21。實施例4 重組殼聚糖酶的表達和純化挑取單菌落的工程菌pET28a-CSn/BL21于5ml含30 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)37°C過夜，按1 100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含30 μ g/ml卡那霉素)中培養(yǎng)約3小時，至0D_達0. 5后，加入IPTG至終濃度0. lmmol/L,于30°C繼續(xù)分別培養(yǎng)3小時。取Iml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液，懸浮細菌沉淀，沸水浴中煮 5分鐘，12000rpm離心lmin，上清加入12% SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時間增加而增加的菌株即為表達所需蛋白的工程菌。按上述方法誘導(dǎo)表達所需蛋白的工程菌后，將細菌離心沉淀，按每IOOml菌加入 8ml Binding Buffer，超聲破碎后，15000rpm離心30分鐘后取上清，加入^il Ni-NTA樹脂 (Invitrogen)，30°C振搖結(jié)合30分鐘，靜置沉淀，棄上清，沉淀用IOml Wash Buffer洗滌2 次后，上2ml層析柱，然后用Elution Buffer洗脫目的蛋白，以Iml為單位分管收集，合并酶活最高的幾管。洗脫的上清添加50%的甘油后保存于-80°C，并進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。實施例4 重組殼聚糖酶性質(zhì)的測定純化的殼聚糖酶其最適反應(yīng)溫度為48°C、最適反應(yīng)pH 4.0，并在？!1 3_8，以及 40°C以下的溫度條件下是穩(wěn)定的，該酶適宜的底物為殼聚糖與膠體殼聚糖。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖酶蛋白，是具有如下(1)或( 特征的蛋白質(zhì) (1)、其氨基酸序列與kq ID NO. 2所示序列一致；O)、將kq ID NO. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失和/ 或添加且具有殼聚糖酶活性的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述殼聚糖酶蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示； 或為對SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列進行替換、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留殼聚糖酶蛋白生物學(xué)活性的DNA分子。
3.攜帶有權(quán)利要求2所述DNA分子的載體。
4.一種宿主系統(tǒng)，其由權(quán)利要求3所述的載體經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染原核生物或真核生物宿主得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主系統(tǒng)，其為細菌、酵母或哺乳動物細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主系統(tǒng)，其為大腸桿菌E.coli。
7.—種從生產(chǎn)殼聚糖酶的菌株中克隆殼聚糖酶基因的方法，包括如下步驟(1)將已知的霉菌殼聚糖酶基因進行序列比對，找到核心保守序列；(2)設(shè)計簡并引物；(3)以霉菌株基因組為模板，利用簡并引物通過PCR法擴增霉菌源殼聚糖酶部分基因片段；(4)利用獲得的部分基因序列，設(shè)計巢式引物，通過反向PCR法獲取全長殼聚糖酶基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中核心保守序列為NMDIDCD 和YGI腳。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟⑵中簡并引物為DFP(5’-GCG GATCCAAYATGGAYATHGAYTGYGA-3，)和 DRP(5， -GCGAAGCTTRTCDCCCCADATNCCRTA-3，)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟(4)中巢式引物為FP1(5-CCA GAG CAC GTT GGC ATC AA-3) ,FP2(5' -GGT CTG CAA CAA CAA GCT CAT C_3’)、RP1(5_ACC ATA GTC GGA CTT GAC CT—3)和 RP2(5，-GAG TCG ATG CCG TCT TGA TC—3，)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種青霉殼聚糖酶基因克隆及其表達方法。本發(fā)明利用單一碳源的特殊培養(yǎng)基進行篩選，獲得產(chǎn)殼聚糖酶的青霉菌，采用獨特的簡并引物進行青霉菌殼聚糖酶基因的片段擴增，然后通過反向PCR的方法獲得了全長基因，經(jīng)確認所得的新型酶基因不含內(nèi)含子。將該基因克隆到合適表達載體，在大腸桿菌中實現(xiàn)異源表達，酶學(xué)研究表明獲得的殼聚糖酶基因具有較高的活性。本發(fā)明的方法有效可靠，建立了一套行之有效的新型殼聚糖酶基因克隆方法，并最終實現(xiàn)大量的誘導(dǎo)表達，為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供成本低廉的殼聚糖酶起始材料。
文檔編號C12N1/19GK102250858SQ20111020598
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月21日
發(fā)明者吳敏, 張文武, 朱旭芬 申請人:浙江大學(xué)