專利名稱：一種紅霉素發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅霉素發(fā)酵方法，屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紅霉素(Erythromycin，Er)第一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要由鏈霉菌、小單孢菌和糖多孢菌產(chǎn)生。在臨床上主要應(yīng)用于治療革蘭氏陽性細(xì)菌感染，對革蘭氏陰性菌如流感桿菌、百日咳桿菌、淋球菌、布氏桿菌、軍團菌及腦膜炎球菌等也有抗菌作用。紅霉素主要活性成分是紅霉素A(Er-A)，雜質(zhì)組分主要有紅霉素B (Er-B)和紅霉素C(Er-C)、紅霉素D(Er-D)、以及紅霉素E(Er-E)、紅霉素F(Er-F)等，各組分結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。紅霉素生物合成(圖2)的原料是丙酸和甲基丙二酸，活性形式是丙酰-CoA和甲基丙二酰-CoA。丙酸和甲基丙二酸均由初級代謝產(chǎn)物分解而來，甲基丙二酸經(jīng)PKS酶脫梭也能產(chǎn)生丙酸。六分子的甲基丙二酰-CoA和一分子的丙酰-CoA在聚酮合酶(polyketide synthases, PKS)的催化作用下，經(jīng)縮合、酮還原、脫水和烯還原等多輪循環(huán)后形成紅霉素的大環(huán)內(nèi)酯環(huán)，即6-脫氧紅霉內(nèi)酯陽-deoxyerthronolide B，6_dEB)。6-dEB在C-6羥化酶的作用下形成紅霉內(nèi)酯(erythronolide, EB) 0 EB在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，先在C-3位接上第1個脫氧糖L-mycarose，后在C-5位接上第2個脫氧糖D-desosamine，從而形成了具有生物活性的紅霉素D (Er-D)。從紅霉素D形成紅霉素 A (Erythromycin A, Er-A)有兩種途徑，由于C-12羥基化酶(EryK)和甲基化酶(EryG)對底物的親和力存在差異，主要是通過紅霉素D在EryK的催化下形成Er_C，然后在甲基化酶 (EryG)的催化下在碳霉糖的C-3’位甲基化而最終形成紅霉素A。紅霉素B雜質(zhì)的產(chǎn)生，與 EryK催化的羥基化反應(yīng)進行不完全有關(guān)。紅霉素B雜質(zhì)活性比紅霉素A稍弱，在以紅霉素A為原料合成二三代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的過程中，紅霉素B也將變成相應(yīng)的雜質(zhì)進入產(chǎn)品，極難去除，因此有必要深入研究在發(fā)酵階段就降低紅霉素B的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開一種紅霉素發(fā)酵方法。本發(fā)明使用的紅霉素鏈霉菌(Sti^ptomyces erythreus)為廣東省微生物菌種保藏中心商業(yè)上廣泛銷售的菌種，GIM編號GIM4. 14，其他編號AS4. 198。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的將冷凍管中的紅霉素鏈霉菌種子，接入含有20 30體積份種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在33士0. 5°C的搖床間培養(yǎng)42 50h，搖床轉(zhuǎn)速為220 MOr/min ；將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照5 10%接種量接入含有20 30體積份發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度 33士0.5°C，搖床轉(zhuǎn)速220 MOr/min，培養(yǎng)150 210h ；即得紅霉素發(fā)酵物；在發(fā)酵培養(yǎng)過程中加入添加劑。
本發(fā)明還可以優(yōu)選如下步驟將冷凍管中的紅霉素鏈霉菌種子，接入含有25體積份種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在 33士0.5°C的搖床間培養(yǎng)46h，搖床轉(zhuǎn)速為230r/min，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照8%接種量接入含有25體積份發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度33士0. 5°C，搖床轉(zhuǎn)速230r/min，培養(yǎng)160 180h ；即得紅霉素發(fā)酵物；在發(fā)酵M 3 后中加入添加劑。所述的種子培養(yǎng)基組分為淀粉3. 5重量份，硫酸銨0. 75重量份，氯化鈉0. 5重量份，蛋白胨0. 5重量份，糊精2. 0重量份，葡萄糖3. 0重量份，酵母粉2. 0重量份，碳酸鈣0. 8 重量份，硫酸鎂0. 05重量份，磷酸氫二鉀0. 08重量份，豆油0. 4體積份，用自來水定容到 100體積份。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為淀粉3. 0重量份，硫酸銨0. 5重量份，糊精4. 5重量份， 葡萄糖2. 0重量份，玉米漿0. 1重量份，碳酸鈣0. 9重量份，豆油0. 6體積份，用自來水定容到100體積份。所述的添加劑為鐵鹽、苯巴比妥衍生物、表面活性劑配制而成的組合物；所述的鐵鹽為氯化鐵、硫酸鐵、硝酸鐵、氫氧化鐵中的一種或多種；所述的苯巴比妥衍生物為苯巴比妥鈉、甲乙炔巴比妥鈉、司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的一種或多種；所述的表面活性劑為壬基酚聚氧乙烯醚G-N-NP2E0)、η-辛基- β -D-吡喃葡萄糖苷中的一種或多種。所述的發(fā)酵液中鐵鹽的濃度為0. 2 5mmol/L ；所述的發(fā)酵液中苯巴比妥衍生物的濃度為lmmol/L以下；所述的發(fā)酵液中表面活性劑的濃度為0. 1 0. 7mmol/L。上述本發(fā)明方法中的重量份與體積份的關(guān)系為g/ml的關(guān)系。本發(fā)明所述的紅霉素發(fā)酵方法，通過加入極少量復(fù)合添加劑，顯著降低了發(fā)酵液中紅霉素B雜質(zhì)的含量，提高了效價。


圖1紅霉素主要組分及其結(jié)構(gòu)紅霉素主要活性成分是紅霉素A(Er-A)，雜質(zhì)組分主要有紅霉素B (Er-B)和紅霉素C(Er-C)、紅霉素D(Er-D)、以及紅霉素E(Er-E)、紅霉素F(Er-F)等，本圖所示各組分結(jié)構(gòu)式。 圖2紅霉素生物合成過程本圖所示紅霉素的生物合成過程。下面實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。實驗例一對比試驗本發(fā)明實驗例和實施例中，所述的紅霉素產(chǎn)生菌為紅霉素鏈霉菌。本發(fā)明實驗例和實施例中，所述的測定方法如下先處理樣品取發(fā)酵液10mL，用濾紙過濾。然后取ImL濾液，用超速離心機以 10000r/min離心lOmin，用0. 22 μ m的膜過濾上清液，置于進樣瓶中分析。按照實施例一的方法，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照10%接種量分別接入5個含有 25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL中三角瓶中，培養(yǎng)溫度33 士0. 5°C，搖床轉(zhuǎn)速220r/min。5個三角瓶分別按如下五種方法操作，發(fā)酵結(jié)束后，測定效價與主要組分紅霉素A、紅霉素B、紅霉素 C的含量，結(jié)果見表一。
本發(fā)明實驗例和實施例中，所述的種子培養(yǎng)基組分為淀粉3. 5g，硫酸銨0. 75g， 氯化鈉0. 5g，蛋白胨0. 5g，糊精2. 0g，葡萄糖3. Og,酵母粉2. Og,碳酸鈣0. Sg,硫酸鎂 0. 05g，磷酸氫二鉀0. 08g，豆油0. 4mL，用自來水定容到IOOmL0所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為淀粉3. 0g，硫酸銨0. 5g，糊精4. 5g，葡萄糖2. 0g，玉米漿0. lg，碳酸鈣0. 9g，豆油0. 6mL，用自來水定容到100mL。生物效價測定使用管碟法。主要組分紅霉素A、B、C百分含量使用HPLC法測定， 實驗條件為采用反相柱C18柱ΚΡ-α8θ50πιπιΧ4·6πιπι，5μπι)，以乙腈(色譜純)0.5% 磷酸二氫銨(A.R)緩沖液=35 65為流動相，流速為lmL/min，在215nm處檢測，柱溫為 35 "C?？瞻捉M發(fā)酵192h。方法1 在發(fā)酵120h后，添加ATP 2. 5mg、硫酸鎂90mg、檸檬酸80mg、L-蛋氨酸為 10mg，繼續(xù)發(fā)酵72h。方法2 在發(fā)酵96h后，添加Triton-XlOO 40uL (約42. ^ig)，繼續(xù)發(fā)酵％h。方法3 在發(fā)酵24h后，添加六水三氯化鐵27. lmg、苯巴比妥鈉5. ^ig、壬基酚聚氧乙烯醚 G-N-NP2E0)6. :3mg，繼續(xù)發(fā)酵 168h。方法4 在發(fā)酵24h后，添加氫氧化鐵10. 8mg、甲乙炔巴比妥鈉5. Omg, η-辛基-β -D-吡喃葡萄糖苷6. Img,繼續(xù)發(fā)酵16 。表一與現(xiàn)有技術(shù)相比的實驗數(shù)據(jù)表
權(quán)利要求
1.一種紅霉素發(fā)酵方法，其特征在于該方法包括如下步驟將冷凍管中的紅霉素鏈霉菌種子，接入含有20 30體積份種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在33士0. 5°C的搖床間培養(yǎng)42 50h，搖床轉(zhuǎn)速為220 MOr/min ；將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照5 10%接種量接入含有 20 30體積份發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度33 士0. 5°C，搖床轉(zhuǎn)速220 MOr/min，培養(yǎng)150 210h ；即得紅霉素發(fā)酵物；在發(fā)酵培養(yǎng)過程中加入添加劑。
2.如權(quán)利要求1所述的紅霉素發(fā)酵方法，其特征在于該方法包括如下步驟將冷凍管中的紅霉素鏈霉菌種子，接入含有25體積份種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在33 士 0. 5°C的搖床間培養(yǎng)46h，搖床轉(zhuǎn)速為230r/min，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照8 %接種量接入含有25體積份發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度33士0. 5°C，搖床轉(zhuǎn)速230r/min，培養(yǎng)160 180h ；即得紅霉素發(fā)酵物；在發(fā)酵M 3 后中加入添加劑。
3.如權(quán)利要求1 2所述的紅霉素發(fā)酵方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基組分為 淀粉3. 5重量份，硫酸銨0. 75重量份，氯化鈉0. 5重量份，蛋白胨0. 5重量份，糊精2. O重量份，葡萄糖3. O重量份，酵母粉2. O重量份，碳酸鈣0. 8重量份，硫酸鎂0. 05重量份，磷酸氫二鉀0. 08重量份，豆油0. 4體積份，用自來水定容到100體積份；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為淀粉3. O重量份，硫酸銨0. 5重量份，糊精4. 5重量份，葡萄糖2. O重量份，玉米漿0. 1 重量份，碳酸鈣0. 9重量份，豆油0. 6體積份，用自來水定容到100體積份。
4.如權(quán)利要求1 2所述的紅霉素發(fā)酵方法，其特征在于所述的添加劑為鐵鹽、苯巴比妥衍生物、表面活性劑配制而成的組合物。
5.如權(quán)利要求4所述的紅霉素發(fā)酵方法，其特征在于所述的鐵鹽為氯化鐵、硫酸鐵、硝酸鐵、氫氧化鐵中的一種或多種；所述的苯巴比妥衍生物為苯巴比妥鈉、甲乙炔巴比妥鈉、 司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的一種或多種；所述的表面活性劑為壬基酚聚氧乙烯醚 (4-N-NP2E0), η-辛基- β -D-吡喃葡萄糖苷中的一種或多種。
6.如權(quán)利要求4所述的紅霉素發(fā)酵方法，其特征在于發(fā)酵液中鐵鹽的濃度為0.2 5mmol/L ；所述的發(fā)酵液中苯巴比妥衍生物的濃度為lmmol/L以下；所述的發(fā)酵液中表面活性劑的濃度為0. 1 0. 7mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種紅霉素發(fā)酵方法。通過在紅霉素鏈霉菌(Streptomyces Erythreus)發(fā)酵液中加入添加劑，調(diào)節(jié)發(fā)酵過程，顯著降低了紅霉素B雜質(zhì)的含量，提高了效價。添加劑為鐵鹽、苯巴比妥衍生物、表面活性劑按一定比例配制而成的組合物。鐵鹽為氯化鐵、硫酸鐵、硝酸鐵、氫氧化鐵中的至少一種；苯巴比妥衍生物為苯巴比妥鈉、甲乙炔巴比妥鈉、司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的至少一種；表面活性劑為壬基酚聚氧乙烯醚(4-N-NP2EO)、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷中的至少一種。發(fā)酵液中鐵鹽的濃度為0.2～5mmol/L；發(fā)酵液中苯巴比妥衍生物的濃度為1mmol/L以下；發(fā)酵液中表面活性劑的濃度為0.1～0.7mmol/L。
文檔編號C12P19/62GK102286578SQ20111020523
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月21日
發(fā)明者張翔, 張韜, 文躍強, 陽海, 黃耀宗 申請人:四川科倫藥物研究有限公司