專利名稱：一種利用臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用和人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
人來(lái)源干細(xì)胞是指人個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育中具有自我更新、增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，分為胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)、成體干細(xì)胞，以及近幾年逐漸發(fā)展起來(lái)的通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使成體皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)成具有多分化潛能的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell, iPS)。hESCs首先從人囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)中分離得到，其最主要的特性是(1)高度的自我復(fù)制能力，在體外具有接近無(wú)限的增殖能力；(2)發(fā)育的全能性，ES 細(xì)胞能夠分化為完整個(gè)體的所有組織細(xì)胞，為細(xì)胞治療和其他應(yīng)用提供充足的細(xì)胞來(lái)源；遺傳的可操作性，可以對(duì)hESCs進(jìn)行相關(guān)的基因改造，使其可以用于治療因特定基因改變引起的相關(guān)疾病或者用于研究疾病的發(fā)病機(jī)制。這些特性使得人胚胎干細(xì)胞成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，為再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞移植治療的發(fā)展帶來(lái)無(wú)限的發(fā)展契機(jī)。但對(duì)于hESCs而言，最初的hESCs系是以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast cell,MEF)為飼養(yǎng)層進(jìn)行建立起來(lái)的，由于培養(yǎng)體系必需的飼養(yǎng)層問(wèn)題以及培養(yǎng)體系的動(dòng)物源性成分問(wèn)題，都使得細(xì)胞的臨床研究以及以后的應(yīng)用面對(duì)很多困難?，F(xiàn)在的諸多努力就是要剔除hESCs培養(yǎng)中鼠源性因素，以滿足臨床的需要人贓帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells， HUCMSCs)是間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，從臍帶華通氏膠中分離獲得，它具有一般間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，比如自我更新、增殖和多向分化潛能等。間充質(zhì)干細(xì)胞一般會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而發(fā)生增殖能力和分化能力的降低，而HUCMSCs屬于干細(xì)胞效價(jià)早期的間充質(zhì)干細(xì)胞，增殖能力和分化能力比較強(qiáng)、免疫原性極低，是一種很有應(yīng)用前景的干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種增殖培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法。本發(fā)明所提供的增殖培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，包括如下步驟用離體的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，對(duì)離體的人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到增殖的人胚胎干細(xì)胞。上述方法中，所述離體的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是經(jīng)過(guò)增殖抑制處理的。上述任一所述方法中，所述增殖抑制處理的方法如下將所述離體的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于含有絲裂霉素C的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2h45min 3hl5min ；所述含有絲裂霉素C的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中絲裂霉素C的濃度為10 12 μ g/ml0上述任一所述方法中，所述離體的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
上述任一所述方法中，所述飼養(yǎng)層按照如下方法制備按每IOOmm皿7X IO5 8 X IO5個(gè)細(xì)胞的接種量將所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于明膠包被過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)，得到飼養(yǎng)層細(xì)胞。上述任一所述方法中，所述增殖培養(yǎng)中包括傳代培養(yǎng)的步驟。上述任一所述方法中，所述傳代培養(yǎng)的代數(shù)至少為30代。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明以從臍帶中分離培養(yǎng)獲得的HUCMSCs作為人胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了人胚胎干細(xì)胞的未分化生長(zhǎng)。經(jīng)定性鑒定，人胚胎干細(xì)胞的各項(xiàng)多能性指標(biāo)與以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層的人胚胎干細(xì)胞相似。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C處理后，可以作為人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，能夠維持人胚胎干細(xì)胞的未分化生長(zhǎng)，并且保持核型的穩(wěn)定性。我們將HUCMSCs用絲裂霉素C處理，抑制其有絲分裂的活性，作為本實(shí)驗(yàn)中的人源性飼養(yǎng)層。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hESCs在這種人源性飼養(yǎng)層上培養(yǎng)30代后，仍然保持了與在MEF 上培養(yǎng)時(shí)的典型克隆形態(tài)，細(xì)胞之間界限清楚，折光性好，細(xì)胞核大，核質(zhì)比高；免疫熒光染色顯示人胚胎干細(xì)胞多能性相關(guān)基因0CT4、Nanog, SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81表達(dá)陽(yáng)性、 而分化時(shí)表達(dá)的基因SSEAl為陰性；堿性磷酸酶染色為陽(yáng)性；hESCs在這種人源性飼養(yǎng)層上保持了核型的穩(wěn)定性；hESCs體外懸浮培養(yǎng)可以形成擬胚體，將擬胚體貼壁培養(yǎng)后可以向三胚層分化。這些都證實(shí)了本發(fā)明所采用的HUCMSCs可以維持hESCs的未分化生長(zhǎng)狀態(tài)。與以往的人源性飼養(yǎng)層相比，本發(fā)明所采用HUCMSCs作為飼養(yǎng)層具有如下優(yōu)勢(shì)(1)材料來(lái)源方面。經(jīng)孕婦本人及家屬知情同意后，我們可以在無(wú)菌條件下獲取新生兒的臍帶，由于每年出生人口數(shù)量龐大，臍帶的獲取相對(duì)其他人源性材料的獲得，具有量上的巨大優(yōu)勢(shì)。(2)安全性方面。胎兒娩出后，將臍帶從母體與胎兒之間分離是常規(guī)的臨床無(wú)菌操作，操作過(guò)程的并發(fā)癥和風(fēng)險(xiǎn)很小。(3)醫(yī)學(xué)倫理方面。臍帶的獲得不需要破壞母體和新生兒的正常結(jié)構(gòu)和功能，因而也醫(yī)學(xué)倫理方面的爭(zhēng)議很少。就目前的文獻(xiàn)方面的報(bào)道來(lái)看，現(xiàn)在普遍認(rèn)為經(jīng)過(guò)孕婦及家屬知情同意后，獲取臍帶進(jìn)行科學(xué)研究不存在倫理問(wèn)題。(4)擴(kuò)增能力和生存周期方面。從臍帶中分離獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力和較長(zhǎng)的生存周期。HUCMSCs在體外培養(yǎng)過(guò)程中約4d便可傳代一次，可體外擴(kuò)增20多代不發(fā)生明顯的衰老。我們使用不同代數(shù)(P3 P15)的HUCMSCs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞， 經(jīng)過(guò)對(duì)人胚胎干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和多能性基因鑒定，我們未發(fā)現(xiàn)這一差異對(duì)培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯影響。(5)免疫原性方面。本發(fā)明所采用的HUCMSCs具有很低的免疫原性，動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)表明機(jī)體未產(chǎn)生對(duì)HUCMSCs的排斥反應(yīng)，更加有意義的是我們可以建立大樣本的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)，從而可以選擇與宿主HLA表型最接近的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，從而最大程度的減少由于飼養(yǎng)層細(xì)胞導(dǎo)致的免疫排斥。這對(duì)于將人胚胎干細(xì)胞應(yīng)用于臨床具有非常重要的意義?？偠灾景l(fā)明證實(shí)了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是維持人胚胎干細(xì)胞未分化生長(zhǎng)狀態(tài)的理想人源性飼養(yǎng)層來(lái)源細(xì)胞，對(duì)解決人胚胎干細(xì)胞應(yīng)用于臨床時(shí)所面臨的問(wèn)題提供了新的思路。


圖1為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(倒置顯微鏡下)形態(tài)特征Bar = 50 μ m。A 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)第2天；B 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞第3代。圖2為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(倒置顯微鏡下)形態(tài)特征Bar = 50 μ m。圖3為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)染色Bar = 50 μ m。A 堿性磷酸酶染色顯示陽(yáng)性B 油紅0法染色顯示陽(yáng)性。圖4為流式細(xì)胞儀檢測(cè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志。圖5為倒置顯微鏡下鼠源性和人源性飼養(yǎng)層的形態(tài)和密度觀察，Bar = 50 μ m。
A :MEF 飼養(yǎng)層 B =HUCMSCs 飼養(yǎng)層。圖6為生長(zhǎng)在人源性和鼠源性飼養(yǎng)層上的人胚胎干細(xì)胞(倒置顯微鏡下)的形態(tài)特征 Bar = 50 μ m。A 生長(zhǎng)在MEF飼養(yǎng)層上的hESCsB生長(zhǎng)在HUMSCs飼養(yǎng)層上的hESCs。圖7為MEF飼養(yǎng)層和HUCMSCs飼養(yǎng)層上的hESCs堿性磷酸酶染色Bar = 50 μ m。A :HUMSCs飼養(yǎng)層上的hESCs堿性磷酸酶染色B =MEF飼養(yǎng)層上的hESCs堿性磷酸酶染色。圖8為以HUCMSCs為飼養(yǎng)層的多能性相關(guān)基因的表達(dá)Bar = 50 μ m。A 以HUCMSCs 為飼養(yǎng)層；B:以MEF為飼養(yǎng)層。圖9為hESCs核型鑒定結(jié)果。A 以MEF為飼養(yǎng)層的hESCs核型鑒定；B 以HUCMSCs 為飼養(yǎng)層的hESCs核型鑒定。圖10為人胚胎干細(xì)胞體外分化形成擬胚體能力檢測(cè)Bar = 50 μ m。A、B 早期擬胚體形態(tài)C、D 成熟的擬胚體形態(tài)。圖11為人胚胎干細(xì)胞形成的擬胚體在體外分化形成三胚層的能力檢測(cè)Bar = 50 μ m0A 以HUCMSCs為飼養(yǎng)層；B 以MEF為飼養(yǎng)層。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中使用的材料如下1.細(xì)胞株人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSCs細(xì)胞)按照現(xiàn)有方法制備得到。MEF細(xì)胞按照現(xiàn)有方法制備得到。人胚胎干細(xì)胞系(即hESCs) =NIH人胚胎干細(xì)胞登記署登記號(hào)為WA01，簡(jiǎn)稱Hl人胚胎干細(xì)胞系，核型為46XY。購(gòu)自WiCell Research Institute，產(chǎn)品目錄號(hào)為WAOl。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是清潔級(jí)孕12. 5 13. 5d的ICR小鼠(MEF的來(lái)源)SYXK (京)2006-0025，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。3.主要藥品及試劑
名稱__
PBSGibco
絲裂霉素CSigma
明膠Sigma
DMEM-F12 培養(yǎng)基Gibco
DMEM培養(yǎng)基Gibco
α-ΜΕΜ 培養(yǎng)基HyClone
胎牛血清(FBS)Gibco
Knockout DMEMGibco Knockout SRGibco
權(quán)利要求
1.一種增殖培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，包括如下步驟用離體的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，對(duì)離體的人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到增殖的人胚胎干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述離體的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是經(jīng)過(guò)增殖抑制處理的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述增殖抑制處理的方法如下將所述離體的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于含有絲裂霉素C的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 2h45min 3hl5min ；所述含有絲裂霉素C的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中絲裂霉素C的濃度為 10 12μ g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述離體的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述飼養(yǎng)層按照如下方法制備 按每IOOmm皿7X IO5 8X IO5個(gè)細(xì)胞的接種量將所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于明膠包被過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)，得到飼養(yǎng)層細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述增殖培養(yǎng)中包括傳代培養(yǎng)的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述傳代培養(yǎng)的代數(shù)至少為30代。
8.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用和人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明所提供的增殖培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，包括如下步驟用離體的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，對(duì)離體的人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到增殖的人胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明證實(shí)了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是維持人胚胎干細(xì)胞未分化生長(zhǎng)狀態(tài)的理想人源性飼養(yǎng)層來(lái)源細(xì)胞，對(duì)解決人胚胎干細(xì)胞應(yīng)用于臨床時(shí)所面臨的問(wèn)題提供了新的思路。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102250835SQ20111019638
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者俞海燕, 劉峰, 張純, 張紹敏, 徐永勝, 王薇 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院