專利名稱：一種采用基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶制備利巴韋林的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化工程領(lǐng)域，特別是一種采用基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶制備利巴韋林的方法。
背景技術(shù)：
利巴韋林(ribavirin)，化學(xué)名為1_ β _D_呋喃核糖基-1H-1，2，4_三氮唑_3_羧酰胺，別名病毒唑，是一種廣譜抗病毒藥物，對多種DNA和RNA病毒均有顯著抑制作用，在抗病毒臨床實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。利巴韋林生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法。目前，國內(nèi)在工業(yè)生產(chǎn)上實(shí)施的化學(xué)合成法占絕大多數(shù)，該方法存在副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、操作步驟復(fù)雜、污染嚴(yán)重、成本高等不足。添加前體物發(fā)酵法(日本公開專利17830/1979)雖具有原料成本低、來源廣泛、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，但是不足之處在于生產(chǎn)效率低、副產(chǎn)物多、利巴韋林分離純化成本高，另外必須每次培養(yǎng)菌體且發(fā)酵時間長、生產(chǎn)成本高，目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。酶法由Witkowski等首創(chuàng)，在上個世紀(jì)80、90年代發(fā)展起來，先后經(jīng)歷了三個主要階段一是以純酶催化核糖-1-磷酸和TCA (1，2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺)一步式生產(chǎn)利巴韋林(US Patent 3，976，545/1976) ；二是以自然界篩選的或人工誘變育種獲得的微生物菌體為酶源，以肌苷、胞苷、鳥苷和腺苷等作為核糖供體酶促合成利巴韋林(FUjishima，1986 ； US Patent 4614719 ；US Patent 5384251 ;Shirae，1988 ;Pochodylo，1989 ；邱蔚然，1997 ； 陳薇梅，02115486. 4/2002)；三是以基因工程菌菌體為酶源，以鳥苷和TCA為底物合成利巴韋林。改進(jìn)后的酶法具有以下優(yōu)點(diǎn)1)反應(yīng)效率高、收率高；2)反應(yīng)時間短、副產(chǎn)物少、分離精制容易；幻三廢較易處理，對環(huán)境污染較??；4)酶源可以反復(fù)連續(xù)使用力)在微生物不增殖條件下，以較高的溫度(40 60°C )反應(yīng)，幾乎沒有雜菌污染；6)核糖供體可以從多種核苷、核苷酸中選擇，底物來源廣泛。但是，現(xiàn)有技術(shù)普遍存在的問題主要有1)利巴韋林的產(chǎn)率受核苷磷酸化酶活性的限制，天然的或傳統(tǒng)誘變獲得的微生物中，核苷磷酸化酶表達(dá)量仍舊很低；2)現(xiàn)有構(gòu)建的基因工程菌需要昂貴的化學(xué)誘導(dǎo)劑異丙基-1-硫代呋喃半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)才能高效表達(dá)目的蛋白，增加了生產(chǎn)成本，不適合工業(yè)化生產(chǎn)； 3)在嘌呤核苷或類似物的酶法合成中，人們把注意力集中在篩選具有廣泛底物特異性的高分子量六聚體嘌呤核苷磷酸化酶，盡管報(bào)道的底物轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)98 %，但是所用底物濃度為20mmol/L，無法滿足工業(yè)化需要。而將低分子量嘌呤核苷磷酸化酶用于酶法合成利巴韋林的應(yīng)用在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。針對以上情況，構(gòu)建具有高效率表達(dá)、高催化活性的非化學(xué)試劑誘導(dǎo)型的利巴韋林工程菌，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)并提高酶法合成利巴韋林的效率和降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述存在問題，提供一種采用基因工程菌產(chǎn)酶發(fā)酵酶法制備利巴韋林的方法，所述基因工程菌為高效表達(dá)具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶，該制備方法提高了酶活和酶量、縮短了生產(chǎn)周期、提高了生產(chǎn)效率、降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明所涉及的高效表達(dá)具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶基因工程菌已經(jīng)公開，編碼高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆表達(dá)、 重組蛋白純化及酶學(xué)性質(zhì)研究已于2010年12月在《中國生物工程雜志》第30卷第12 期發(fā)表，獲得的高效表達(dá)高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的工程菌E. coli XL-Blue (PPNP816)現(xiàn)保藏于天津科技大學(xué)代謝工程研究室。一種采用基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶制備利巴韋林的方法，步驟如下1)利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌E. coli XL-Blue (pPNP816)，具體方法是利用PCR技術(shù)從枯草芽孢桿菌W168中擴(kuò)增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因pimA，與啟動子部分經(jīng)改造的表達(dá)載體pQE-30連接，構(gòu)建具有高效表達(dá)和高質(zhì)粒穩(wěn)定性的組成型表達(dá)載體PQF-PNP816和基因工程菌 E. coli XL-Blue(PPNP816)；2)基因工程菌高密度產(chǎn)酶發(fā)酵從新鮮活化斜面分別挑取一環(huán)工程菌E. coli XL-Blue(PPNP816)菌苔于種子培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)數(shù)為200r/min、溫度為35°C條件下振蕩培養(yǎng)他；然后將培養(yǎng)的種子接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，接種量按體積百分比計(jì)為2% 10%，產(chǎn)酶發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度33 35 °C、罐壓0. 01 0. 2MPa、用質(zhì)量百分比濃度為25 %的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值 7. 0 7. 2、在空氣流量1 50L/min和攪拌速度200 800r/min條件下使溶氧維持在15 40%、流加質(zhì)量百分比濃度為80%的葡萄糖維持殘?zhí)菫?. 2% 1%、發(fā)酵時間16 20h ；3)酶源制備將發(fā)酵完畢的發(fā)酵液離心后得到菌體細(xì)胞作為酶源，將菌體細(xì)胞用濃度為50mmol/L、pH為7. 6的磷酸鈉緩沖液洗滌兩遍，然后將該酶源用上述磷酸鈉緩沖液重懸作為反應(yīng)液備用；4)酶促反應(yīng)制備利巴韋林以鳥苷和1，2，4_三氮唑-3-甲酰胺(TCA)為反應(yīng)底物，鳥苷與TCA的摩爾比為1 1 1.3，底物在反應(yīng)液中的濃度為50 300mmol/L，在反應(yīng)底物中加入酶源并混合均勻，酶源在反應(yīng)液中的用量按濕重計(jì)為30 120g/L，反應(yīng)溫度為50 60°C，反應(yīng)12 20h，反應(yīng)完畢后經(jīng)離心取得清液，即為產(chǎn)物利巴韋林。所述種子培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖2.5% 5%、牛肉膏 3%、酵母粉 0. 5%-2%、MgS04 ·7Η20 0· 1 % 0· 2%、ΚΗ2Ρ04 0· 1 % 0· 2%、玉米菜 0· 2% 1%、豆?jié)?. 2% 1%、余量為水。所述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖 4 %、酵母膏 0.1% 0.3%、豆?jié)? 2%、玉米菜 2%、MgSO4 · 7Η20 0. 1 % 0. 2 %、 KH2PO4O. 2 % 0. 4 %、FeSO4 0. 0002 % 0. 0004 MnSO4 · H2O 0. 001 0. 004 CoCl2 · 6Η200· 0002%— 0. 0004%, ZnSO4 · 7Η20 0. 0001%— 0. 0002%、余量為水。本發(fā)明所述高效表達(dá)低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的組成型基因工程菌 Ε. coli XL-Blue(PPNP816)，采用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)對高效表達(dá)載體pQE-30進(jìn)行改造構(gòu)建 PQF，其具有如下特點(diǎn)1)用乳糖啟動子替換了來自噬菌體的T5強(qiáng)啟動子，以防因強(qiáng)啟動子過高的啟動效率而使重組蛋白過快表達(dá)致使其來不及折疊或折疊錯誤而無酶活性；2)兩個乳糖操縱基因的去除賦予了載體在無化學(xué)誘導(dǎo)劑IPTG或乳糖誘導(dǎo)下也能高效表達(dá)的特性，這也使得該載體只適合表達(dá)對菌體無毒害作用的蛋白；3)合成的核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS II，保證高效的翻譯；4)兩個強(qiáng)而有利的轉(zhuǎn)錄終止子來自λ噬菌體的t0和來自大腸桿菌 rrnB操縱元的Tl，可以有效預(yù)防轉(zhuǎn)錄中的通讀現(xiàn)象并保證表達(dá)質(zhì)粒的穩(wěn)定性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1)采用基因工程菌，目的蛋白即低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶，得以高效表達(dá)，目的蛋白/菌體總蛋白達(dá)到16% 22%，菌體酶活力有較大提高；2)對載體啟動子和操縱基因進(jìn)行了改造，賦予了該工程菌非誘導(dǎo)型高效表達(dá)目的蛋白和較高質(zhì)粒穩(wěn)定性的一系列特征，很大程度上滿足了工業(yè)化生產(chǎn)對基因工程菌的需要；幻發(fā)酵周期短、菌體密度高，經(jīng)16 20h產(chǎn)酶發(fā)酵即可得到較高酶活的酶源細(xì)胞， 發(fā)酵液光密度值0D_最高可達(dá)60 ；4) 78 85%的轉(zhuǎn)化率雖然較現(xiàn)有工藝(80 98% )低，但本方法的底物鳥苷濃度高達(dá)lOOmmol/L，而現(xiàn)有技術(shù)為肌苷20mmol/L，本方法的酶源用量僅為30 50g濕菌體/L 反應(yīng)液，而現(xiàn)有技術(shù)為50 200g濕菌體/L反應(yīng)液，采用本方法反應(yīng)1 后利巴韋林產(chǎn)量可達(dá)19. 0 20. 7g/L，酶源細(xì)胞反復(fù)利用10次，轉(zhuǎn)化率仍可達(dá)68 78%。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種采用基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶制備利巴韋林的方法，步驟如下1)利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌E. coli XL-Blue (pPNP816)，具體方法是采用PCR技術(shù)，從枯草芽孢桿菌W168基因組上克隆擴(kuò)增編碼低分子量嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因pimA，與表達(dá)載體 PQF連接，構(gòu)建具有高效表達(dá)和高質(zhì)粒穩(wěn)定性的組成型表達(dá)載體PQF-PNP816，表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli XLl-Blue構(gòu)建基因工程菌E. coli XL-Blue (pPNP816)，經(jīng)DNA測序和重組蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明成功構(gòu)建了高效表達(dá)低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的工程菌E. coli XL-Blue (pPNP816)。2)基因工程菌高密度產(chǎn)酶發(fā)酵在500mL三角瓶中，將從新鮮活化斜面分別挑取一環(huán)工程菌E. coli XL-Blue(PPNP816)菌苔于種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖 2. 5%、牛肉膏 1%、酵母粉 0. 75%、MgSO4 · 7H20 0.1%, KH2PO4 0. 1 %、玉米漿 0. 2%、豆?jié)?0. 2%、余量為水，用質(zhì)量百分比濃度為25%的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值7. 0 7. 2，裝液量為25mL，9層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，在轉(zhuǎn)數(shù)為200r/min、溫度為35°C條件下振蕩培養(yǎng)他；將搖瓶種子以10%接種量接入裝有3L產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的5L全自動發(fā)酵罐中， 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖3%，酵母膏0.2%，豆?jié)?%，玉米漿 2%, MgSO4 · 7H20 0.1%, KH2PO4 0. 4%, FeSO4 0. 0004%, MnSO4 · H2O 0. 15%, CoCl2 · 6H20 0· 0002 %、ZnSO4 ·7Η20 0.0001%、水為余量；產(chǎn)酶發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度、罐壓0. 01 0. 05MPa、用質(zhì)量百分比濃度為25%的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值7. 0-7. 2、在空氣流量1
58L/min和攪拌速度200 700r/min條件下使溶氧維持在20 40%、流加質(zhì)量百分比濃度為80%的葡萄糖維持殘?zhí)怯?.2% 1%、發(fā)酵時間18h。將菌液進(jìn)行菌體密度測定、SDS-PAGE蛋白電泳分析和酶活力測定，檢測結(jié)果表明菌體密度OD6tltl達(dá)到56，其中目的蛋白/菌體總蛋白達(dá)20. 6%，產(chǎn)酶發(fā)酵液酶活力為 62200U/L。。3)酶源制備將發(fā)酵完畢的發(fā)酵液離心后得到菌體細(xì)胞作為酶源，將菌體細(xì)胞用濃度為50mmol/L、pH為7. 6的磷酸鈉緩沖液洗滌兩遍，配制成30g濕菌體/L的酶源反應(yīng)液。4)酶促反應(yīng)制備利巴韋林在酶源反應(yīng)液中分別加入濃度均為lOOmmol/L的鳥苷和TCA并混合均勻，反應(yīng)溫度為55°C，反應(yīng)18h，反應(yīng)完畢后經(jīng)離心取得清液，即為產(chǎn)物利巴韋林。產(chǎn)物利巴韋林定量分析取離心后獲得的清液清液，用無菌去離子水稀釋5倍后，采用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)定量檢測利巴韋林，工作條件為Agilent 1200型高效液相色譜儀；可變波長紫外檢測器VWD，檢測波長207nm ；標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器，進(jìn)樣量5μ L ；色譜柱 Kromasil C18，5 μ，25(toimX 4. 6匪；流動相中水乙腈=96 4 (V/V)； 柱溫 30°C ；流速 lml/min0根據(jù)利巴韋林轉(zhuǎn)化率定義，轉(zhuǎn)化率的百分比計(jì)算公式為
產(chǎn)物利巴韋林摩爾濃度 irvw
轉(zhuǎn)化率(％) = - 100/°
底物鳥苷摩爾濃度測定結(jié)果利巴韋林轉(zhuǎn)化率為82. 6%。實(shí)施例2 從新鮮活化斜面分別挑取一環(huán)工程菌E. coli XL-Blue (pPNP816)菌苔進(jìn)行5L全自動發(fā)酵罐產(chǎn)酶發(fā)酵，搖瓶種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例1。將搖瓶種子以10%接種量接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L全自動發(fā)酵罐中進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵。發(fā)酵溫度33°C，罐壓0. 01 0. 05MPa，空氣流量1 8L/min和攪拌速度200 700r/min使溶氧維持在20 40%，發(fā)酵 PH值控制在7. 0 7. 2之間，發(fā)酵時間為20h。菌體密度測定、SDS-PAGE蛋白電泳分析和酶活力測定同實(shí)施例1。菌體密度0D_ 達(dá)到60，其中目的蛋白/菌體總蛋白達(dá)到21. 4%，產(chǎn)酶發(fā)酵液酶活力達(dá)到68800U/mL。發(fā)酵完畢后發(fā)酵液離心分離菌體，進(jìn)行利巴韋林催化。反應(yīng)條件和利巴韋林測定條件同實(shí)施例1。測定結(jié)果利巴韋林轉(zhuǎn)化率為83. 1%。實(shí)施例3:從新鮮活化斜面分別挑取一環(huán)工程菌E. coli XL-Blue(PPNP816)菌苔進(jìn)行30L 全自動發(fā)酵罐產(chǎn)酶發(fā)酵。搖瓶種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。將搖瓶種子以10%接種量接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L全自動發(fā)酵罐中進(jìn)行二級種子培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度35°C，罐壓0. 01 0. 05MPa,空氣流量1 8L/min和攪拌速度200 700r/min使溶氧維持在20 40%，pH 值控制在7. 0 7. 2之間，培養(yǎng)時間為他。將二級種子以10%接種量接入裝有18L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L全自動發(fā)酵罐中進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵。發(fā)酵溫度33°C，罐壓0.01 0. 15MPa，空氣流量5 50L/min和攪拌速度200 800r/min使溶氧維持在20 40%，發(fā)酵pH值控制在 7.0 7. 2之間，發(fā)酵時間為20h。菌體密度測定、SDS-PAGE蛋白電泳分析和酶活力測定同實(shí)施例1。菌體密度0D600 達(dá)到76，其中目的蛋白/菌體總蛋白達(dá)到21. 8%，產(chǎn)酶發(fā)酵液酶活力達(dá)到86800U/mL。發(fā)酵完畢后發(fā)酵液離心分離菌體，進(jìn)行利巴韋林催化。反應(yīng)條件和利巴韋林測定條件同實(shí)施例1。測定結(jié)果利巴韋林轉(zhuǎn)化率為84. 5%。
權(quán)利要求
1.一種采用基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶制備利巴韋林的方法，其特征為步驟如下1)利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌五COli XL-Blue (PPNP816),具體方法是利用PCR技術(shù)從枯草芽孢桿菌W168中擴(kuò)增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因/ //^，與啟動子部分經(jīng)改造的表達(dá)載體pQE-30連接，構(gòu)建具有高效表達(dá)和高質(zhì)粒穩(wěn)定性的組成型表達(dá)載體PQF-PNP816和基因工程菌五 coli XL-Blue (pPNP816)；2)基因工程菌高密度產(chǎn)酶發(fā)酵從新鮮活化斜面分別挑取一環(huán)工程菌五coli XL-Blue (PPNP816)菌苔于種子培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)數(shù)為200r/min、溫度為35°C條件下振蕩培養(yǎng)他；然后將培養(yǎng)的種子接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，接種量按體積百分比計(jì)為29TlO%，產(chǎn)酶發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度 33 35°C、罐壓0. 0Γ0. 2MPa、用質(zhì)量百分比濃度為25%的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值7. 0^7. 2、 在空氣流量廣50L/min和攪拌速度20(T800r/min條件下使溶氧維持在15、0%、流加質(zhì)量百分比濃度為80%的葡萄糖維持殘?zhí)菫?. 2% 1%、發(fā)酵時間16 20h ；3)酶源制備將發(fā)酵完畢的發(fā)酵液離心后得到菌體細(xì)胞作為酶源，將菌體細(xì)胞用濃度為50mmol/L、pH為7. 6的磷酸鈉緩沖液洗滌兩遍，然后將該酶源用上述磷酸鈉緩沖液重懸作為反應(yīng)液備用；4)酶促反應(yīng)制備利巴韋林以鳥苷和1，2，4_三氮唑-3-甲酰胺(TCA)為反應(yīng)底物，鳥苷與TCA的摩爾比為1 廣1. 3，底物在反應(yīng)液中的濃度為5(T300mmOl/L，在反應(yīng)底物中加入酶源并混合均勻，酶源在反應(yīng)液中的用量按濕重計(jì)為3(Tl20g/L，反應(yīng)溫度為5(T60°C，反應(yīng)12 20h，反應(yīng)完畢后經(jīng)離心取得清液，即為產(chǎn)物利巴韋林。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述采用基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶制備利巴韋林的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖2.59Γ5%、牛肉膏19Γ3%、酵母粉 0. 5%-2%、MgSO4 · 7Η20 0. 1% 0· 2%, KH2PO4 0. 1% 0· 2%、玉米漿 0. 2% 1%、豆?jié)?0. 2% 1%、余量為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述采用基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶制備利巴韋林的方法，其特征在于所述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖19Γ4%、酵母膏0. 19Π). 3%、 豆?jié)?1% 2%、玉米漿 1% 2%、MgSO4 · 7Η20 0. 1% 0· 2%、KH2PO4 0. 2% 0· 4%、FeSO4 0. 0002% 0. 0004%、MnSO4 · H2O 0. ΟΟΓΟ. 004%、CoCl2 · 6H20 0. 0002% 0· 0004%、ZnSO4 · 7Η20 0. 0001% 0. 0002%、余量為水。
全文摘要
一種采用基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶制備利巴韋林的方法，首先利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)具有高酶活力的低分子量三聚體嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌E.coliXL-Blue(pPNP816)，然后將該基因工程菌經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后再接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，最后以所得菌體為酶源，以鳥苷和TCA為反應(yīng)底物進(jìn)行酶促反應(yīng)制備利巴韋林。該制備方法采用基因工程菌，酶活性高，目的蛋白得以高效表達(dá)；發(fā)酵周期短、產(chǎn)酶效率高、菌體密度高；底物轉(zhuǎn)化率高，可達(dá)78~85%；而且工藝簡單，環(huán)境污染低，降低了利巴韋林的生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)的推廣和應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK102286574SQ201110158250
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者劉淑云, 夏俊剛, 徐慶陽, 謝希賢, 陳寧 申請人:天津科技大學(xué)