專利名稱：人GSK-3β基因的小干擾RNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及RNA干擾技術(shù)，更具體地涉及具有抑制人GSK-3P基因表達(dá)的小分子干擾核糖核酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干擾技術(shù)又被形象地稱為基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing),是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional genesilencing,PTGS)。最早有關(guān)RNA干擾的報(bào)道出現(xiàn)在 1990 年，由兩個(gè)不同的研究小組同時(shí)報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物中的RNA干擾現(xiàn)象，以后又在線蟲(chóng)、果蠅、斑馬魚(yú)和小鼠等幾乎所有真核生物中觀察到了 RNA干擾現(xiàn)象。1999年,HamiIton和Baulcombe在發(fā)生RNA干擾的植物中檢測(cè)到了長(zhǎng)度為21-25個(gè)核苷酸的RNA片段，這些RNA片斷被證明是RNA干擾所必需的，稱為小分子干擾RNA(siRNA)。雙鏈siRNA與細(xì)胞源性的相關(guān)酶和 蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)。在RNA干擾過(guò)程中，雙鏈siRNA中的正義鏈被排除出復(fù)合體，反義鏈指導(dǎo)RISC結(jié)合到靶mRNA的相應(yīng)位點(diǎn)，然后由復(fù)合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，從而關(guān)閉靶基因的表達(dá)。研究表明，長(zhǎng)度為21_23nt 的小 RNA分子(small interfering RNA, siRNA)是引起RNA 干擾的直接原因(Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, Bartel DP. RNAi double-strandedRNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23nucleotide intervals.Cell 2000,101 :25-33. )。RNA干擾在抑制基因表達(dá)方面具有高效性、簡(jiǎn)單性和特異性，目前在基因功能研究和疾病治療中發(fā)揮了重要作用。近幾年來(lái)，RNA干擾已經(jīng)在腫瘤治療方面取得了一些成果(Uprichard, Susan L. The therapeuticpotential of RNA interference.FEBS Letters 2005,579 :5996-6007) 糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，最初研究發(fā)現(xiàn)GSK-3是參與糖代謝的主要限速酶之一，GSK-3可使糖原合成酶磷酸化而抑制糖原合成。但近年來(lái)的研究表明，GSK-3除參與糖代謝外，還參與細(xì)胞內(nèi)其他重要生理過(guò)程，如細(xì)胞分化、增殖和凋亡等。GSK-3主要有兩種亞型GSK-3 a和GSK-3 ^，其中GSK-3 ^是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要成分，不僅參與胰島素信號(hào)通路調(diào)節(jié)，還參與Wnt信號(hào)通路和NF-kappa B信號(hào)通路等的調(diào)節(jié)。GSK-3 P在體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制很復(fù)雜，主要的調(diào)節(jié)方式包括磷酸化調(diào)節(jié)、蛋白復(fù)合體形成、細(xì)胞內(nèi)分布和一些抑制劑調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)的底物有酶、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等。人類多種疾病如糖尿病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、情感障礙和炎癥等疾病的發(fā)生都與GSK-3P活性調(diào)節(jié)異常有關(guān)，因此GSK-3P已經(jīng)成為多種疾病治療的潛在靶點(diǎn)。研究GSK-3P功能活性，開(kāi)發(fā)GSK-3P抑制劑已經(jīng)成為新藥開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)，目前研究發(fā)現(xiàn)至少有50多個(gè)有效抑制GSK-3 ^的化合物。目前開(kāi)發(fā)的GSK-3 ^抑制劑在化學(xué)結(jié)構(gòu)上差異很大，在作用機(jī)制上主要以小分子ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑為主。目前，GSK-3P抑制劑臨床應(yīng)用面臨的一個(gè)重要問(wèn)題是其選擇性低，容易引起副作用。因此，臨床還需要開(kāi)發(fā)選擇性更高、特異性更好的GSK-3P的抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠高效、特異性抑制人GSK-3 ^基因表達(dá)的小干擾核
糖核酸。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種分離的人GSK-3 ^基因小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其中所述靶序列為SEQ ID NO 1-10中任意一條序列。本發(fā)明第二方面提供了一種小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含SEQ ID NO 1-10的序列編碼的RNA序列，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段能形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA能抑制人GSK-3 P基因的表達(dá)。對(duì)于上述小分子干擾核糖核酸來(lái)說(shuō)，所述正義RNA片段和反義RNA片段可以存在于兩條不同的RNA鏈上，也可以存在于同一條RNA鏈上。當(dāng)正義RNA片段和反義RNA片段存在于同一條RNA鏈上時(shí)，所述核糖核酸優(yōu)選為發(fā)夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義 RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。對(duì)于上述任一項(xiàng)所述的小分子干擾核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長(zhǎng)度為15-27個(gè)核苷酸，優(yōu)選為19-23個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為19、20或者21個(gè)核苷酸。對(duì)于任一項(xiàng)所述的小分子干擾核糖核酸，其中雙鏈RNA的互補(bǔ)區(qū)域至少有15個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選至少有18個(gè)堿基對(duì)。具體來(lái)講，所述小分子干擾核糖核酸具有GSK-3 ^ SiRNA-I至10所示的核苷酸序列或者具有對(duì)GSK-3 ^ siRNA-1至10所示的核苷酸序列進(jìn)行化學(xué)修飾得到的核苷酸序列，其中，GSK-3 P SiRNA-I 正義鏈 5，-GGACCCAAAUGUCAAACUACC-3 ’反義鏈 5，-UAGUUUGACAUUUGGGUCCCG-3，GSK-3 ^ siRNA-2 正義鏈 5，-CCAGAUCAUGAGAAAGCUAGA-3 ’反義鏈5，-UAGCUUUCUCAUGAUCUGGAG-3，GSK-3 P siRNA-3 正義鏈 5，-GGAAGCUUGUGCACAUUCATT-3，反義鏈5，-UGAAUGUGCACAAGCUUCCAG-3，GSK-3 P siRNA-4 正義鏈 5 ’ -CACUGGUCACGUUUGGAAAGA-3 ’反義鏈5，-UUUCCAAACGUGACCAGUGTT-3，GSK-3 P siRNA-5 正義鏈 5，-CUACCAAAUGGGCGAGACATT-3 ’反義鏈5，-U⑶CUCGCCCAUUUGGUAGIT-3 ’GSK-3 P siRNA-6 正義鏈 5，-UAUAUCUGUUCUCGGUACUTT-3，反義鏈 5，-AGUACCGAGAACAGAUAUATT-3，GSK-3 ^ siRNA-7 正義鏈 5，-AGAAGAAAGAUGAGGUCUATT-3，反義鏈5’ -UAGACCUCAUCUUUCUUCUIT-3’GSK-3 P siRNA-8 正義鏈 5，-CUCAAGAACUGUCAAGUAATT-3 ’反義鏈5’ -UUACUUGACAGUUCUUGAGIT-3，GSK-3 P siRNA-9 正義鏈 5，-GCAUGAAAGUUAGCAGAGATT-3，反義鏈5’ -UCUCUGCUAACUUUCAUGCTT-3’GSK-3 P siRNA-10 正義鏈 5，-GAAGUCUAGCCUAUAUCCATT-3，
反義鏈5’ -UGGAUAUAGGCUAGACUUCTT-3’上述化學(xué)修飾可以為如下修飾中的至少一種(I)對(duì)所述siRNA的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；(2)對(duì)所述siRNA的核苷酸序列中的核糖的2’ -OH的修飾；(3)對(duì)所述siRNA的核苷酸序列中的堿基的修飾。本發(fā)明還涉及上述siRNA或者siRNA化學(xué)修飾產(chǎn)物在制備抗骨質(zhì)疏松藥物或者降低血糖藥物中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含上述siRNA或者siRNA化學(xué)修飾產(chǎn)物。 本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供的針對(duì)人GSK-3 ^的小干擾核糖核酸分子(siRNA)，能夠高效、特異地抑制人GSK-3P基因的表達(dá)，同時(shí)具有較低的毒副作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一組用于抑制人GSK-3P基因表達(dá)的siRNA，所述siRNA具有GSK-3 ^ siRNA 1-10所示的寡聚核酸或者對(duì)GSK-3 ^ siRNA 1-10所示的序列進(jìn)行化學(xué)修飾得到的寡聚核酸。根據(jù)本發(fā)明，所述化學(xué)修飾為如下修飾中的至少一種(I)對(duì)所述siRNA的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；(2)對(duì)所述siRNA的核苷酸序列中核糖的2’ -OH的修飾；(3)對(duì)所述siRNA的核苷酸序列中堿基的修飾。所述化學(xué)修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，所述磷酸二酯鍵的修飾是指對(duì)磷酸二酯鍵中的氧進(jìn)行修飾，包括硫代磷酸修飾，如式I所示；和硼烷化磷酸鹽修飾，如式2所示。兩種修飾都能穩(wěn)定siRNA結(jié)構(gòu)，保持堿基配對(duì)的高特異性和高親和力。
_ _ 0H9 OH
0^rs.O=^-B-H2
Vf Vr
0HOH
(I)(2)所述核糖修飾是指對(duì)核苷酸戊糖中2’ -OH的修飾，即，在核糖的羥基位置引入某些取代基，例如，2’ -氟代修飾，如式3所示；2’ -氧甲基修飾，如式4所示；2’ -氧亞乙基甲氧基修飾，如式5所示；2，4’_ 二硝基苯酚修飾，如式6所示；鎖核酸(LNA)，如式7所示；2’ -氨基修飾，如式8所示；2’ -脫氧修飾，如式9所示。
權(quán)利要求
1.一種分離的人GSK-30基因小分子干擾核糖核酸(SiRNA)靶序列，其中所述靶序列為SEQ ID NO 1-10中任意一條序列。
2.一種小分子干擾核糖核酸(SiRNA)，其包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含權(quán)利要求I的序列編碼的RNA序列，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段能形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA能夠抑制人GSK-3 ^基因的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小分子干擾核糖核酸，其中，所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于同一條RNA鏈上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子干擾核糖核酸，其中，所述核糖核酸為發(fā)夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。
5.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的小分子干擾核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長(zhǎng)度為15-27個(gè)核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的小分子干擾核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長(zhǎng)度為19、20或者21個(gè)核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的小分子干擾核糖核酸，其中雙鏈RNA的互補(bǔ)區(qū)域至少有18個(gè)堿基對(duì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)所述的小分子干擾核糖核酸，其特征在于所述小分子干擾核糖核酸具有GSK-3 ^ siRNA-1至10所示的核苷酸序列或者具有對(duì)GSK-3 ^ siRNA-1至10所示的核苷酸序列進(jìn)行化學(xué)修飾得到的核苷酸序列，其中，GSK-3 ^ siRNA-1 :正義鏈 5’ -GGACCCAAAUGUCAAACUACC-3，反義鏈 5’ -UAGUUUGACAUUUGGGUCCCG-3，GSK-3 ^ siRNA-2 :正義鏈 5’ -CCAGAUCAUGAGAAAGCUAGA-3，反義鏈 5’ -UAGCUUUCUCAUGAUCUGGAG-3，GSK-3 ^ siRNA-3 :正義鏈 5’ -GGAAGCUUGUGCACAUUCATT-3 ’反義鏈 5’ -UGAAUGUGCACAAGCUUCCAG-3，GSK-3 P siRNA-4 :正義鏈 5’ -CACUGGUCACGUUUGGAAAGA-3，反義鏈 5’ -UUUCCAAACGUGACCAGUGTT-3，GSK-3 ^ siRNA-5 :正義鏈 5’ -CUACCAAAUGGGCGAGACATT-3， 反義鏈 5’ -U⑶CUCGCCCAUUUGGUAGIT-3’GSK-3 ^ siRNA-6 :正義鏈 5’ -UAUAUCUGUUCUCGGUACUTT-3 ’反義鏈 5’ -AGUACCGAGAACAGAUAUATT-3，GSK-3 ^ siRNA-7 :正義鏈 5’ -AGAAGAAAGAUGAGGUCUATT-3 ’反義鏈 5’ -UAGACCUCAUCUUUCUUCUIT-3’GSK-3 ^ siRNA-8 :正義鏈 5’ -CUCAAGAACUGUCAAGUAATT-3，反義鏈 5’ -UUACUUGACAGUUCUUGAGTT-3，GSK-3 ^ siRNA-9 :正義鏈 5’ -GCAUGAAAGUUAGCAGAGATT-3，反義鏈 5’ -UCUCUGCUAACUUUCAUGCTT-3’GSK-3 ^ siRNA-10 :正義鏈 5’ -GAAGUCUAGCCUAUAUCCATT-3’反義鏈 5’ -UGGAUAUAGGCUAGACUUCTT-3’。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的小分子干擾核糖核酸，其中所述化學(xué)修飾為如下修飾中的至少一種 (1)對(duì)所述siRNA的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾； (2)對(duì)所述siRNA的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修飾； (3)對(duì)所述siRNA的核苷酸序列中的堿基的修飾。
10.權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)所述的小分子干擾核糖核酸(siRNA)在制備抗骨質(zhì)疏松藥物或降低血糖藥物中的應(yīng)用。
11.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)所述的小分子干擾核糖核酸(siRNA)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組針對(duì)人GSK-3β基因的siRNA以及它們的應(yīng)用。選取人GSK-3β基因編碼區(qū)的序列作為siRNA的靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)中連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-23)個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)siRNA。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，上述siRNA能夠序列特異性降低人GSK-3β基因的表達(dá)，進(jìn)而降低GSK-3β蛋白的表達(dá)水平。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102776176SQ20111011749
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者于永春, 張戈, 徐倍, 曲伸, 李文君, 李鴻, 王吉影, 盛春君, 盛輝, 秦嶺, 程曉蕓 申請(qǐng)人:上海市第十人民醫(yī)院