專利名稱：：人rbbp6基因的小干擾rna及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核酸
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說涉及RNA干擾技術(shù)，更具體地涉及具有抑制人RBBP6基因表達的小分子干擾核酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：RNA干擾是指由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，主要通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達。研究表明，長度為21-23nt的小RNA分子(smallinterferingRNA,siRNA)是引起RNA干擾的直接原因(TuschlT,ZamorePD,SharpPA,BartelDP.RNAidouble-strandedRNAdirectstheATP—dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell2000，101:25-33.)。RNA干擾在抑制基因表達方面具有高效性、簡單性和特異性，目前在基因功能研究和疾病治療中發(fā)揮了重要作用。近幾年來，RNA干擾已經(jīng)在腫瘤治療方面取得了一些成果(Uprichard，SusanL.ThetherapeuticpotentialofRNAinterference.FEBSLetters2005，579:5996-6007)。RBBP6，全稱為Retinoblastomabindingprotein6，定位于人類染色體16pl2.2。RBBP6基因編碼的蛋白定位于細胞核內(nèi)。由于氨基端含有保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，RBBP6蛋白具有泛素酯酶活性，可促進Y-box結(jié)合蛋白(細胞周期正向調(diào)控因子)的降解(ScottRE,GiannakourosT，GaoS，PeidisP.FunctionalpotentialofP2P-R:aroleinthecellcycleandcelldifferentiationrelatedtoitsinteractionswithproteinsthatbindtomatrixassociatedregionsofDNA？JCellBiochem2003；90:6-12；ChibiM，MeyerM，SkepuA，GReesDJ，Moolman-SmookJC，PughDJ.RBBP6interactswithmultifunctionalproteinYB-IthroughitsRINGfingerdomain，leadingtoubiquitinationandproteosomaldegradationofYB-1.JMolBiol2008；384908-16)。RBBP6可以與腫瘤抑制因子p53和/或Rb，以及核骨架附著區(qū)結(jié)合因子形成復(fù)合體，通過細胞周期和細胞分化依賴的形式影響基因轉(zhuǎn)錄、基因表達和對細胞核的調(diào)節(jié)(ScottRE,GiannakourosT，GaoS，PeidisP.FunctionalpotentialofP2P-R:aroleinthecellcycleandcelldifferentiationrelatedtoitsinteractionswithproteinsthatbindtomatrixassociatedregionsofDNA？JCellBiochem2003；90:6-12.；LiLiDengB，XingGiTengY，TianC，ChengX,YinXiYangJ,GaoX，ZhuY，SunQ,ZhangLiYangX，HeF.PACTisanegativeregulatorofp53andessentialforcellgrowthandembryonicdevelopment.ProcNatlAcadSciUSA2007；104:7951-6；ScottRE,White-GrindleyE，RuleyHE，CheslerEJ,WilliamsRW.P2P-RexpressionisgeneticallycoregulatedwithcomponentsofthetranslationmachineryandwithPUM2，atranslationalrepressorthatassociateswiththeP2P—RmRNA.JCellPhysiol2005；204:99-105)0RBBP6蛋白在食管癌組織中高水平表達(YoshitakeY，NakatsuraT，MonjiM，SenjuS，MatsuyoshiH，TsukamotoH，HosakaS，KomoriH，F(xiàn)ukumaD，IkutaY，KatagiriT，F(xiàn)urukawaY，ItoH，ShinoharaM，NakamuraY，NishimuraY.Proliferationpotential—relatedprotein,anidealesophagealcancerantigenforimmunotherapy,identifiedusingcomplementaryDNAmicroarrayanalysis.ClinCancerRes2004;10:6437-48)。過表達的RBBP6蛋白可誘導(dǎo)骨肉瘤Saos2細胞的細胞周期阻滯于有絲分裂的前中期，誘導(dǎo)細胞凋亡，并能增強乳腺癌MCF-7細胞對抗腫^M^^HM^it^WilMii(ScottRE,GiannakourosΤ,GaoS,PeidisP.FunctionalpotentialofP2P-R:aroleinthecellcycleandcelldifferentiationrelatedtoitsinteractionswithproteinsthatbindtomatrixassociatedregionsofDNA？JCellBiochem2003；90:6-12；ScottRE,White-GrindleyE，RuleyHE，CheslerEJ,WilliamsRW.P2P-RexpressionisgeneticallycoregulatedwithcomponentsofthetranslationmachineryandwithPUM2，atranslationalrepressorthatassociateswiththeP2P-RmRNA.JCellPhysiol2005；204:99-105；GaoS,ScottRE.P2P-Rproteinoverexpressionrestrictsmitoticprogressionatprometaphaseandpromotesmitoticapoptosis.JCellPhysiol2002；193:199-207；GaoS，ScottRE.StableoverexpressionofspecificsegmentsoftheP2P—RproteininhumanMCF_7cellspromotescamptotheein-inducedapoptosis.JCellPhysiol2003；197445-52；ScottRE,GaoS.P2P-RdeficiencymodifiesnocodazoIeinducedmitoticarrestandUV-inducedapoptosis.AnticancerRes2002，22:3837-42)?；谀壳耙延械年P(guān)于RBBP6基因在食管癌、骨肉瘤和乳腺癌的報道，可以推測RBBP6作為一個癌基因在腫瘤發(fā)生和進展過程中具有重要的功能，并有望成為抗腫瘤治療的有效靶點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一方面，提供了人RBBP6基因在腫瘤治療中的用途，即所述人RBBP6基因促進腫瘤細胞增殖，可作為針對腫瘤細胞的藥物治療靶標。所述藥物可以為小分子化學藥，抗體藥，也可以為核酸類藥物。優(yōu)選的，所述腫瘤細胞的RBBP6基因可作為RNA干擾藥物作用靶標。本發(fā)明的第二方面，提供了分離的人RBBP6基因小分子干擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其中所述靶序列為SEQIDNO1-172中任意一條序列。本發(fā)明還提供了包含SEQIDNO1_172中任意一條序列的核酸構(gòu)建體和慢病毒。優(yōu)選的，所述含有RBBP6基因siRNA序列的核酸構(gòu)建體(也稱為RNA干擾載體)為pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA(表達序列表中SEQIDN0.4)。本發(fā)明還提供了小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含SEQIDNO1_172中任意一條序列編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制人RBBP6基因的表達。所述正義RNA片段和反義RNA片段可以存在于兩條不同的RNA鏈上，或者存在于一條RNA鏈上。優(yōu)選的，所述核糖核酸為發(fā)夾型單鏈RNA分子(shRNA)，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。上述任一項所述的核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為15-27個核苷酸，優(yōu)選為19-23個核苷酸，具體為19、20或者21個核苷酸。本發(fā)明還提供了上述任一項在制備或篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述腫瘤選自結(jié)直腸癌或肝癌。綜上所述，本發(fā)明設(shè)計了針對人RBBP6基因的172個RNA干擾靶點序列，構(gòu)建相應(yīng)的RBBP6shRNA表達載體，其中編碼序列SEQIDNO4的RNA干擾載體pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA能夠顯著下調(diào)RBBP6基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv)作為基因操作工具攜帶RNA干擾載體pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA能夠靶向地將針對RBBP6基因的RNA干擾序列高效導(dǎo)入人結(jié)直腸腫瘤細胞RKO和人肝臟腫瘤細胞SMMC-7721，降低RBBP6基因的表達水平，顯著抑制上述腫瘤細胞的增殖和生長速度，是結(jié)直腸腫瘤和肝臟腫瘤的潛在臨床非手術(shù)治療方式。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的小干擾核酸或者包含小干擾核酸序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人RBBP6基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中RBBP6基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，在腫瘤治療中具有重要意義。圖1表示pGCSIL-GFP質(zhì)粒DNA圖譜。圖2表示pGC-FU質(zhì)粒DNA圖譜。圖3表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人結(jié)直腸腫瘤細胞RKO5天后，RBBP6mRNA的表達水平顯著降低。圖4表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人肝臟腫瘤細胞SMMC-77215天后，RBBP6mRNA的表達水平顯著降低。圖5表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人結(jié)直腸腫瘤細胞RKO5天后，引起細胞增殖抑制。圖6表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人肝臟腫瘤細胞SMMC-77215天后，引起細胞增殖抑制。具體實施例方式發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNA干擾方法下調(diào)人RBBP6基因的表達后可有效地抑制腫瘤細胞的增殖，表明RBBP6基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發(fā)明人進一步合成和測試了多種針對RBBP6基因的siRNA，篩選出了可有效抑制RBBP6的表達進而抑制人結(jié)直腸腫瘤細胞RKO和人肝臟腫瘤細胞SMMC-7721進程的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了一系列干擾人RBBP6基因的小干擾RNA(SiRNA)序列，構(gòu)建了可特異性沉默RBBP6基因表達的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對人RBBP6基因設(shè)計的小干擾RNA及RNA干擾慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)RBBP6基因的表達，并有效地抑制人腫瘤細胞的增殖。本發(fā)明表明RBBP6基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過RNA干擾方式沉默RBBP6基因的表達，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。本發(fā)明的設(shè)計思路為本發(fā)明通過如下方法來篩選獲得一種人RBBP6基因RNA干擾慢病毒從Genbank中調(diào)取人RBBP6基因序列；預(yù)測siRNA位點；合成針對RBBP6基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNAOligo；慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNAOligo連接；構(gòu)建表達RBBP6基因siRNA序列的RNA干擾質(zhì)粒及表達RBBP6基因的過表達質(zhì)粒；將RNA干擾質(zhì)粒與RBBP6基因過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞；Westernblot檢測這些RNA干擾質(zhì)粒對RBBP6基因的蛋白表達水平的抑制作用，并根據(jù)抑制作用結(jié)果篩選有效干擾質(zhì)粒；將篩選得到的RNA干擾質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(PackingMix，Sigma-aldrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞^3T，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默RBBP6基因的慢病毒?；谏鲜龇椒?，本發(fā)明提供了172個干擾RBBP6基因的有效靶點(具體如SEQIDΝ01-172所示)，構(gòu)建了特異干擾人RBBP6基因的慢病毒。同時本發(fā)明還公開一種人RBBP6基因RNA干擾慢病毒(Lv-RBBP6_siRNA)及其制備與應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾方法，在降低RBBP6基因在腫瘤細胞中的表達后，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖和生長。本研究表明，RBBP6基因是一個原癌基因，可促進腫瘤細胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學功能，RBBP6基因可以為腫瘤治療的靶標，慢病毒介導(dǎo)的RBBP6基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京科學出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。實施例1針對人RBBP6基因RNA干擾慢病毒的制備1.篩選針對人RBBP6基因的有效的siRNA靶點從Genbank調(diào)取RBBP6(NM_006910.4,NM_018703.3,NM_032626.5)基因信息；利用上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司的設(shè)計軟件Genechem設(shè)計針對RBBP6基因的有效的siRNA靶點。在RBBP6基因的編碼序列(⑶幻區(qū)域內(nèi)(針對NM_006910.4的1041位至6419位堿基)，每隔一個堿基起始獲得21個堿基的序列，表1列出了其中172條針對RBBP6基因的有效siRNA靶點序列。表1靶向于人RBBP6基因的siRNA靶點序列權(quán)利要求1.一種分離的人RBBP6基因小分子干擾核糖核酸(SiRNA)靶序列，其中所述靶序列為SEQIDNO1-172中任意一條序列。2.包含權(quán)利要求1任一項的序列的核酸構(gòu)建體。3.包含權(quán)利要求1任一項的序列的慢病毒。4.一種小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含權(quán)利要求1的序列編碼的RNA序列，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段能形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA能抑制人RBBP6基因的表達。5.如權(quán)利要求4所述的小分子干擾核糖核酸，其中，所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于同一條RNA鏈上。6.如權(quán)利要求5所述的小分子干擾核糖核酸，其中，所述核糖核酸為發(fā)夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。7.權(quán)利要求4-6任一項所述的小分子干擾核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為15-27個核苷酸。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小分子干擾核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為19-23個核苷酸。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的小分子干擾核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為19、20或者21個核苷酸。10.權(quán)利要求1-9任一項在制備或篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，所述腫瘤選自結(jié)直腸癌或肝癌。12.人RBBP6基因在制備或篩選腫瘤的藥物或制劑中的應(yīng)用。13.如權(quán)利要求12中所述人RBBP6基因的應(yīng)用，其特征在于，所述人RBBP6基因作為針對腫瘤細胞的作用靶標應(yīng)用于制備或篩選腫瘤的藥物或制劑。14.如權(quán)利要求13中所述人RBBP6基因的應(yīng)用，其特征在于，所述針對腫瘤細胞的作用靶標為RNA干擾作用靶標。15.如權(quán)利要求12-14中任一所述人RBBP6基因的應(yīng)用，其特征在于，所述的制備或篩選腫瘤的藥物或制劑中，含有人RBBP6基因的RNA干擾慢病毒。全文摘要本發(fā)明涉及一組針對人RBBP6基因的siRNA、其核酸構(gòu)建體、表達該siRNA的慢病毒載體及慢病毒、以及它們的應(yīng)用。選取人RBBP6基因編碼區(qū)的序列作為siRNA的靶位點，根據(jù)靶位點中連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-23)個堿基序列設(shè)計siRNA。通過基因克隆，獲得表達上述siRNA的核酸構(gòu)建體及慢病毒。細胞實驗證明，上述siRNA能夠序列特異性降低人RBBP6基因的表達并能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖。文檔編號A61K48/00GK102229928SQ20111012141公開日2011年11月2日申請日期2011年5月11日優(yōu)先權(quán)日2011年5月11日發(fā)明者曹躍瓊,朱向瑩申請人:上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司