專利名稱：大白菜控制器官大小基因BrGRF5及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制大白菜器官的基因，特別是一種控制大白菜器官大小的 BrGRF5基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
發(fā)掘和利用與重要經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)的功能基因是實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物優(yōu)良品種培育的有效途徑。在作物育種史上，凡是突破性的成就，都與關(guān)鍵基因的利用密不可分。20世紀(jì)50年代，由于美國(guó)通過(guò)對(duì)抗胞囊線蟲基因的有效利用，從而使得大豆總產(chǎn)量超過(guò)中國(guó)，躍居世界第一，并一直保持至今；60年代，矮桿基因的應(yīng)用導(dǎo)致世界糧食的“綠色革命”和糧食產(chǎn)量的飛躍；70年代，袁隆平先生對(duì)水稻野生不育基因的改良催生了中國(guó)雜交水稻的誕生并轟動(dòng)世界；90年代，世界種業(yè)巨頭對(duì)重要基因資源系統(tǒng)性地研究和應(yīng)用導(dǎo)致了他們?cè)谥袊?guó)的迅猛擴(kuò)張。蔬菜是我們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵贰Ｎ覈?guó)政府在確保糧食安全生產(chǎn)的同時(shí)，也非常重視“菜籃子”工程的建設(shè)。大白菜起源于中國(guó)，是我國(guó)的特色蔬菜。據(jù)調(diào)查，在黃河以北地區(qū)，秋冬大白菜的種植面積占秋菜種植面積的50%左右，東北地區(qū)可達(dá)60%左右。大白菜生長(zhǎng)期較短，生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高，且價(jià)格低，尤其在秋冬大白菜的收獲季節(jié)，其價(jià)格是所有蔬菜中最低的。因此，它適合于城鎮(zhèn)中低收入水平的家庭和廣大農(nóng)民的要求，可以算得上是一般家庭的“當(dāng)家菜”。由于大白菜在我國(guó)及東亞國(guó)家的蔬菜生產(chǎn)和消費(fèi)中占有舉足輕重的地位，因此，挖掘大白菜重要功能基因并用于遺傳改良顯得十分重要。器官大小是大白菜的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀。有效利用控制大白菜器官大小的基因， 在分子水平上有目的調(diào)控器官的大小和形態(tài)，可以滿足市場(chǎng)對(duì)大白菜的不同需求。因此，控制器官大小在提高大白菜產(chǎn)量和質(zhì)量方面具有極為重要的意義。不同物種間，植物種子和器官大小有著顯著的差異，但在物種內(nèi)個(gè)體之間器官的大小相對(duì)一致，說(shuō)明植物器官的大小是受遺傳控制。在植物體中存在著控制器官大小的基因，它們通過(guò)協(xié)調(diào)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)來(lái)決定器官大小。器官大小通常和細(xì)胞數(shù)目相聯(lián)系，已有的研究表明在器官發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分裂受嚴(yán)格控制。例如，在煙草中過(guò)量表達(dá)SUPERMAN 基因可導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少?gòu)亩斐芍仓臧?。擬南芥struwwelpeter突變體由于地上器官中細(xì)胞數(shù)目減少，產(chǎn)生了侏儒表型。擬南芥AINTEGUMENTA (ANT)基因功能缺失突變體減小了葉、花的大小和數(shù)目，而ANT基因的異位表達(dá)增大了營(yíng)養(yǎng)器官(如葉和莖)和花器官。 ANT基因主要通過(guò)影響總細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞分裂程度來(lái)改變成熟器官的大小。該基因并不控制細(xì)胞生長(zhǎng)速率和細(xì)胞周期，而是在器官形成過(guò)程中調(diào)節(jié)器官生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂。這些結(jié)果表明ANT基因很可能維持與生長(zhǎng)相協(xié)調(diào)的持續(xù)的細(xì)胞分裂。ANT基因功能缺失致使細(xì)胞有絲分裂減少，細(xì)胞生長(zhǎng)提前終止，從而使器官減小。相反，ANT基因過(guò)量表達(dá)的植株能使自身細(xì)胞比正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂時(shí)間更長(zhǎng)，因而使器官增大。ANT基因的功能并不僅限于擬南芥，35S: :ANT的表達(dá)也使轉(zhuǎn)基因煙草植株增大。ANT基因編碼一個(gè)具有AP2-domain的轉(zhuǎn)錄因子，它的同源基因已經(jīng)從其它植物中分離出來(lái)。油菜BANT基因在擬南芥中異位表達(dá)也使擬南芥器官增大，這進(jìn)一步支持了不同植物中ANT基因在控制器官大小方面具有保守的功能。ARGOS基因在ANT基因的上游起作用并影響器官細(xì)胞的分裂能力。表達(dá)正義或反義 ARGOS基因的植株器官分別增大或減小，這是因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目和器官生長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的變化而改變了器官大小。GIFl蛋白是人類SYT轉(zhuǎn)錄共激活因子的同源蛋白。通過(guò)對(duì)GIFl功能缺失突變體以及特異抑制GIFl功能的RNAi轉(zhuǎn)基因擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)。突變體和轉(zhuǎn)基因植株都產(chǎn)生了較窄的葉和花瓣。較窄的葉是由在葉寬軸方向上的細(xì)胞數(shù)目減少引起的。這些結(jié)果說(shuō)明GIFl基因參與了調(diào)節(jié)葉和花瓣的生長(zhǎng)和形狀。
植物器官的最終大小不僅與細(xì)胞數(shù)目，而且與細(xì)胞體積有關(guān)。最近的研究表明，不同的細(xì)胞體積或細(xì)胞的極性伸長(zhǎng)都能導(dǎo)致植物器官大小改變。例如，擬南芥angutifolia 突變體影響葉寬方向的細(xì)胞延伸從而產(chǎn)生了較窄的葉。相反過(guò)量表達(dá)AtEXPIO、ARL和 AtGRFl基因都能促進(jìn)細(xì)胞延伸從而產(chǎn)生較大的器官。R0T3基因調(diào)節(jié)葉長(zhǎng)方向的細(xì)胞生長(zhǎng)并決定器官長(zhǎng)度。由于細(xì)胞體積變大，e2ff-l突變體產(chǎn)生了較長(zhǎng)的根和下胚軸。拓?fù)涿竀I 突變后導(dǎo)致細(xì)胞不能正常擴(kuò)張從而產(chǎn)生矮小的植株。擬南芥BIGPETAL (BPE)基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，該基因的下調(diào)表達(dá)促進(jìn)花瓣細(xì)胞擴(kuò)張從而產(chǎn)生較大的花瓣。GRF是一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥中由9個(gè)成員組成。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá) AtGRFl和AtGGRF2使擬南芥產(chǎn)生了較大的葉和子葉，與野生型擬南芥相比轉(zhuǎn)基因植株抽苔時(shí)間延遲。相反，AtGRFl-AtGRF3三突變體產(chǎn)生了較小的葉和子葉，而單突變體沒(méi)有表型。 轉(zhuǎn)基因植株和三突變體葉的變化是細(xì)胞體積的增加或減小引起的。然而，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)AtGRF5同樣可提高轉(zhuǎn)基因植株器官的大小，但其機(jī)制在于促進(jìn)或者維持了細(xì)胞的分離能力，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目的多少達(dá)到調(diào)節(jié)植物器官大小的目的。這些結(jié)果表明，GRF家族成員可正調(diào)控植物器官的大小，但成員之間的調(diào)控機(jī)制存在一定的差異。因此，如果能夠找到控制大白菜器官大小的基因并加以利用，可以對(duì)大白菜品質(zhì)的改良起到非常關(guān)鍵的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種控制大白菜營(yíng)養(yǎng)器官大小的BrGRF5基因及其應(yīng)用。一種控制大白菜營(yíng)養(yǎng)器官大小的BrGRF5基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所
7J\ ο一種由上述BrGRF5基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。一種插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。一種重組細(xì)胞，插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列的載體。上述BrGRF5基因、載體或重組細(xì)胞在經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)改良中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明從大白菜中克隆了一個(gè)BrGRF5基因，并驗(yàn)證了該基因具有控制植物器官大小的功能，經(jīng)試驗(yàn)，通過(guò)過(guò)量表達(dá)該基因，可以獲得比野生型植株產(chǎn)量更高的轉(zhuǎn)基因作物 (如圖1所示)。本發(fā)明的基因可為培育農(nóng)作物新品種提供理論依據(jù)和基因來(lái)源。


圖1為本基因在擬南芥中過(guò)量表達(dá)后與野生型擬南芥植株的對(duì)比照片；A為野生型植株，B為BrGRF5過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例基因的分離與轉(zhuǎn)化 以大白菜福山包頭10天苗齡幼苗的地上部分為材料，取至液氮預(yù)冷的研缽中，力口入液氮快速磨成粉末，將IOOmg粉末裝入1.5ml離心管中，加入Iml Trizol (Invitrogen 公司出售)顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。在4。C，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1. 5ml離心管中。加入200 μ 1氯仿，用手劇烈搖晃15秒鐘，室溫靜置2_3分鐘。4°C， 12000rpm離心10分鐘。取無(wú)色上層水相至一新的離心管中，加入600 μ 1_20°C冰箱預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4。C，12000rpm離心10分鐘，吸去上清液。加入Iml 75%乙醇，渦旋震蕩。4°C，7500rpm離心3分鐘。室溫干燥3_5分鐘，加入30 μ 1的無(wú)RNase 水溶解沉淀，然后置于55°C水浴中溶解10分鐘，迅速冰浴5分鐘后瞬時(shí)離心。利用RT-PCR方法擴(kuò)增BrGRF5基因的編碼序列。具體操作方法如下首先，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，所用反轉(zhuǎn)錄酶為Takara公司生產(chǎn)的M-MLV reversetranscriptase,反應(yīng)體系為 20 μ 1。依次力口入 Ιμ oligo dT>2 μ g RNA 禾口無(wú) RNase水至13. 5 μ 1，在70°C水浴中變性5分鐘，迅速冰浴5分鐘，瞬時(shí)離心，然后依次加入 1 μ 1 IOmM dNTP,4y 15 X RT 緩沖液，0· 5 μ 1 RNase inhibitor 禾Π 1 μ 1 M-MLV reverse transcriptase。輕輕混合均勻，42°C反應(yīng)60分鐘，70°C水浴10分鐘使酶失活。以第一鏈 cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，所用引物為BrGRF5-F 5' -CGGGATCCATGATGAACCTAAGTGGAACTAGTG-3，(SEQ ID NO. 3)BrGRF5-R 5' -TAGTCGACTCAGCTACCAGTGTCGAGTCTTGAC-3，(SEQ ID NO. 4)PCR 反應(yīng)體系為 25μ 1，依次加入 10XPCR 緩沖液 2· 5μ 1，2μ 1 2. 5mM dNTP, 2μ 1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，正向引物0.5μ I(IOmM)，反向引物0.5μ I(IOmM)，5U/1 Taq DNA聚合酶 0. 25 μ 1，最后加水至25 μ 1。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 3分鐘；變性94°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 2 分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后延伸10分鐘，4°C保存。瓊脂糖凝膠電泳后將PCR產(chǎn)物裝入pUC18DNA vector中pUC18DNA vector由 Takara公司產(chǎn)售。將PCR產(chǎn)物與pUC18DNA vector進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系10 μ 1，各組分為Ιμ pUC18DNA vector,2y 1 PCR產(chǎn)物，5 μ 1連接酶液，加水至10 μ 1。在16°C水浴中連接30分鐘，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。將連接好的載體進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)正確無(wú)誤。用Takara公司生產(chǎn)的BamHI和SalI酶切，操作如下酶切體系50μ 1，包括7. 5μ 1 10 X T緩沖液，20 μ 1已插入片段的載體，2 μ 1 BamHI, 2 μ ISalI 禾Π 18. 5 μ 1 水。在 37°C水浴 4 個(gè)小時(shí)。用杭州博日科技有限公司產(chǎn)售的Biospin Gel Extraction Kit回收基因片段，操作如下用干凈、鋒利的手術(shù)刀，將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，并放入1. 5ml離心管中。按1 3的比例加入Extraction buffer。于50°C恒溫水浴中直到凝膠融化。將混合液全部轉(zhuǎn)入Spin column內(nèi)，于6000rpm離心1分鐘，棄去接液管內(nèi)液體。向Spin column 中加入500μ1 Extraction buffer，于12000rpm離心1分鐘，棄去接液管內(nèi)液體。向Spin column中加入750 μ 1 Wash Buffer，于12000rpm離心1分鐘,棄去接液管內(nèi)液體。再次于 12000rpm離心1分鐘，然后將Spin column轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的1. 5ml離心管內(nèi)。向Spin column 中加入50 μ 1 Elution Buffer,并于室溫放置1分鐘 。12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液。將回收的基因片段連接入植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-0CS中，操作如下連接體系10μ 1，包括1μ 1 pCAMBIA2300-35S-0CS，5y 1回收的基因片段，1μ 1 10ΧΤ4連接酶緩沖液和ι μ 1 Τ4連接酶，最后加水至 ομ 1，在16°C下連接12小時(shí)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，操作如下取100 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入3 μ 1構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，冰浴5分鐘，液氮冷凍1分鐘，37°C水浴5分鐘，然后加入Iml LB培養(yǎng)基(1升LB培養(yǎng)基含5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，IOg氯化鈉)，28°C， 200rpm振蕩3小時(shí)。IOOOOrpm離心1分鐘，棄上清，加入100 μ 1 LB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，涂布于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB平板培養(yǎng)基上(1升LB平板培養(yǎng)基含5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，IOg氯化鈉，15g瓊脂)，28°C培養(yǎng)2-3天。選取莖轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404，通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥(Columbia ecotype)。 操作如下將農(nóng)桿菌菌落接種于5ml LB培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩過(guò)夜。按1/50接種于 200ml含相同抗生素的新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl為1. 0,4500rpm離心5分鐘收集菌體，重懸于侵染液中。轉(zhuǎn)化所用侵染液含有5%蔗糖，0.03% Tween(吐溫)-20。將擬南芥的花序浸入侵染液中30秒鐘，把花盆側(cè)放于托盤中，蒙上地膜避光24小時(shí)，第二天取下地膜，將花盆直立。制備1/2MS篩選平板(1/2MS培養(yǎng)基加50mg/L卡那霉素，100mg/L羧芐青霉素)， T1代種子莖70%乙醇消毒5分鐘，2%次氯酸鈉消毒10分鐘后播種于1/2MS篩選平板，每板播種IOOyg的擬南芥種子。4°C春化3天后放于培養(yǎng)箱(22°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗) 中。6天后選出綠色的生長(zhǎng)正常的陽(yáng)性植株，移入蛭石中培養(yǎng)，單株收獲T2代種子。繁殖并鑒定T3代，獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系10個(gè)。基因功能的鑒定T3代純合體株系和野生型擬南芥種子在冰箱中春化3天，消毒后將種子播于含 50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板。于22°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗培養(yǎng)箱中6天。 待幼苗子葉完全張開后，將轉(zhuǎn)基因株系和野生型幼苗轉(zhuǎn)入蛭石中，然后置于培養(yǎng)間(22°C， 16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中培養(yǎng)。培養(yǎng)30天后觀察轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的各個(gè)器官比野生型的對(duì)應(yīng)器官顯著增大，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)請(qǐng)參見表1，說(shuō)明BrGRF5基因的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)植物器官增大，從而增加生物量。表1超量表達(dá)BrGRF5與對(duì)照的比較(P彡0. 05)
權(quán)利要求
1.一種控制大白菜器官大小的BrGRF5基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.一種由上述BrGRF5基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.—種插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。
4.一種重組細(xì)胞，其特征在于，插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ IDNo. 1序列的載體。
5.如權(quán)利要求1所述BrGRF5基因、權(quán)利要求3所述載體或權(quán)利要求4所述重組細(xì)胞在經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種控制大白菜器官的基因，特別是一種控制大白菜器官大小的BrGRF5基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。一種控制大白菜營(yíng)養(yǎng)器官大小的BrGRF5基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明從大白菜中克隆了一個(gè)BrGRF5基因，并驗(yàn)證了該基因具有控制植物器官大小的功能，經(jīng)試驗(yàn)，通過(guò)過(guò)量表達(dá)該基因，可以獲得比野生型植株產(chǎn)量更高的轉(zhuǎn)基因作物。本發(fā)明的基因可為培育農(nóng)作物新品種提供理論依據(jù)和基因來(lái)源。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102229935SQ20111014945
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者劉立鋒, 李利斌, 李化銀, 王鳳德, 高建偉 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所