本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及cvbv26-4基因在降低果蠅免疫力和制備免疫低下型果蠅模型中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

昆蟲是目前地球陸地上最繁盛的物種類群，是人類取之不盡的資源寶庫。近年來，昆蟲的免疫在其基礎(chǔ)和應(yīng)用研究方面受到極大關(guān)注，通過實(shí)驗(yàn)來研究與昆蟲免疫相關(guān)的機(jī)制、信號(hào)等問題，對(duì)害蟲防治、益蟲防病、開發(fā)利用抗菌物、研究人類免疫機(jī)制等有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

果蠅屬于雙翅目、果蠅屬、果蠅科昆蟲，約1000種。其中，果蠅具有生活史短、易飼養(yǎng)、繁殖快、染色體少、突變型多、易于觀察等特點(diǎn)，被廣泛地用作遺傳和演化的室內(nèi)外研究材料，是一種重要的模式生物。在生命科學(xué)發(fā)展的歷史長河中，果蠅扮演了十分重要的角色，是十分活躍的模型生物。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，各種轉(zhuǎn)基因果蠅模型的應(yīng)用也越來越廣泛。

目前，轉(zhuǎn)基因果蠅模型主要用于遺傳學(xué)的研究、發(fā)育的基因調(diào)控的研究、各類神經(jīng)疾病的研究、帕金森氏病、老年癡呆癥、藥物成癮和酒精中毒、衰老與長壽、學(xué)習(xí)記憶與某些認(rèn)知行為等研究中。

低免疫力果蠅模型在對(duì)研究昆蟲免疫相關(guān)機(jī)制、增強(qiáng)人類免疫類藥劑的篩選等方面有重要意義。但是，毒性較強(qiáng)的基因通常容易造成轉(zhuǎn)基因果蠅的死亡；因此，尋找合適的毒性基因是建立免疫低下型果蠅的重要環(huán)節(jié)。

而polydnaviruses(多分dna病毒，pdv)是一類寄生蜂專性共生的特殊病毒，主要包括兩個(gè)屬：分別是存在于膜翅目繭蜂科(braconidae)的繭蜂病毒(bracovirus,bv)與姬蜂科(ichneumonidae)昆蟲體內(nèi)的姬蜂病毒屬(ichnovirus,iv)(turnbull,m.andb.webb(2002).perspectivesonpolydnavirusoriginsandevolution.advancesinvirusresearch,academicpress.58:203-254)。pdv粒子隨雌蜂產(chǎn)卵時(shí)注入到寄生蜂的寄主體體腔內(nèi)，首先侵染血細(xì)胞，隨后侵染所有組織。pdv作為寄生蜂的“強(qiáng)力武器”(bai,s.,x.chen,j.cheng,w.fuandj.he(2005)."effectsofwasp-associatedfactorsofcotesiaplutellaeongrowthanddevelopmentofplutellaxylostellalarvae."actaphytophylacicasinica32(3):235-240)，其主要生理功能是抑制寄主的免疫(dupuy,c.,e.huguetandj.m.drezen(2006)."unfoldingtheevolutionarystoryofpolydnaviruses."virusresearch117(1):81-89,strand,m.r.andg.r.burke(2012)."polydnavirusesassymbiontsandgenedeliverysystems."plospathogens8(7)，卻不造成寄主的死亡，以保證寄生蜂的正常生長發(fā)育(ye,x.,m.shiandx.chen(2014)."originandcharacteristicsofpolydnavirusescarriedbyparasitoidwasps."scientiasinicavitae44(4):342)。菜蛾盤絨繭蜂多分dna病毒(cvbv)是國內(nèi)研究較多的一種多分dna病毒，共有35個(gè)環(huán)狀dna組成，編碼一百多個(gè)毒性基因。因此，有必要對(duì)cvbv基因做更進(jìn)一步地深入研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了cvbv26-4基因在降低果蠅免疫力和制備免疫低下型果蠅中的新用途。

cvbv26-4基因是菜蛾盤絨繭蜂多分dna病毒的35個(gè)基因組片段中的第26個(gè)環(huán)上的第4個(gè)基因，堿基序列如seqidno.1所示；其能夠編碼121個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明提供了cvbv26-4基因在降低果蠅免疫力中的應(yīng)用，所述cvbv26-4基因的堿基序列如seqidno.1所示。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，cvbv26-4基因在促進(jìn)果蠅血細(xì)胞凋亡中的用途，所述cvbv26-4基因的堿基序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了cvbv26-4基因在制備免疫低下型果蠅模型中的應(yīng)用，所述cvbv26-4基因的堿基序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明提供了一種免疫低下型果蠅模型的制備方法，包括：

(1)制備包含有cvbv26-4基因的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒注入白眼野生型果蠅胚胎中，胚胎發(fā)育至成蟲后，獲得紅眼轉(zhuǎn)基因果蠅；所述cvbv26-4基因的堿基序列如seqidno.1所示；

(2)將紅眼轉(zhuǎn)基因果蠅與平衡系進(jìn)行兩輪雜交，依據(jù)后代表型，挑選純合體轉(zhuǎn)基因果蠅；

(3)利用uas/gal4系統(tǒng)，將步驟(2)制得的純合體轉(zhuǎn)基因果蠅與bs8700果蠅品系進(jìn)行雜交，使得cvbv26-4基因在后代果蠅血細(xì)胞中特異性表達(dá)，從而獲得免疫低下型果蠅。

其中，所述白眼野生型果蠅為w1118；平衡系的基因型為w-/w-；sp/cyo；tm2/tm6b。

所述純合體轉(zhuǎn)基因果蠅的基因型為w-/w-；cvbv26-4/cvbv26-4；tm2/tm6b。

本發(fā)明還提供了一種免疫低下型果蠅模型，其染色體中包含有cvbv26-4基因，所述cvbv26-4基因的堿基序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了一種采用上述制備方法制備的免疫低下型果蠅模型。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將菜蛾盤絨繭蜂多分dna病毒基因cvbv26-4轉(zhuǎn)入果蠅基因組，獲得了穩(wěn)定遺傳、純合體的轉(zhuǎn)基因果蠅品系；利用uas/gal4系統(tǒng)，純合體的cvbv26-4轉(zhuǎn)基因果蠅與bs8700果蠅品系進(jìn)行雜交，得到的品系表達(dá)多分dna病毒基因cvbv26-4后，存在血細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，并且在受到病原物侵染時(shí)，具有明顯的免疫缺陷性狀，在對(duì)研究昆蟲免疫相關(guān)機(jī)制、增強(qiáng)人類免疫類藥劑的篩選等方面有重要意義。

(2)本發(fā)明構(gòu)建的cvbv26-4轉(zhuǎn)基因果蠅借助gal4/uas系統(tǒng)的調(diào)控以及雜交試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了cvbv26-4基因在果蠅特定組織的高表達(dá)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中構(gòu)建cvbv26-4轉(zhuǎn)基因果蠅的pcr檢測結(jié)果。

圖2為實(shí)施例1中半定量pcr檢測cvbv26-4在轉(zhuǎn)基因果蠅中的表達(dá)結(jié)果。

圖3為實(shí)施例1中cvbv26-4基因在果蠅血細(xì)胞中特異表達(dá)對(duì)血細(xì)胞影響的檢測結(jié)果。

圖4為實(shí)施例1中cvbv26-4基因引起果蠅幼蟲血細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果。

圖5為實(shí)施例1中cvbv26-4基因影響果蠅免疫的檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、轉(zhuǎn)基因果蠅的構(gòu)建

根據(jù)cvbv26-4基因開放閱讀框(orf,seqidno.1所示)兩端序列以及puasttb載體上多克隆位點(diǎn)序列，結(jié)合同源重組酶的作用方式，設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列如下：

f：5’-ttcgttaacagatctgcggccgcatgatgttcttcagcaaattacc_-3’

r：5’-tcctctagaggtaccctcgagttaactagattgtagataaggata-3’；

采用trizol(invitrogen,carlsbad,ca,usa)提取寄生后小菜蛾血細(xì)胞的總rna，并利用試劑盒smartracecdnaamplificationkit(clontech,usa)構(gòu)建cdna文庫。然后，利用特異性引物f、r從構(gòu)建的cdna文庫中pcr擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的cvbv26-4基因片段，利用同源重組酶(clonexpressiionestepcloningkit，諾唯贊，南京)將片段重組克隆到載體上。重組后的載體轉(zhuǎn)到大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)繁，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證序列的正確性。

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒顯微注射入白眼野生型黑腹果蠅w1118的胚胎中，胚胎發(fā)育至成蟲即為g0代，g0代果蠅中紅眼果蠅即為成功的轉(zhuǎn)基因品系，以此為依據(jù)進(jìn)行篩選。

利用pcr檢測，提取cvbv26-4轉(zhuǎn)基因果蠅和野生型w1118黑腹果蠅的基因組dna，分別用特異性引物f、r對(duì)這些基因組dna進(jìn)行pcr檢測，從cvbv26-4轉(zhuǎn)基因果蠅擴(kuò)增出與cvbv26-4大小一致的片段，而在野生型w1118黑腹果蠅的基因組dna中沒有擴(kuò)增出任何片段。證明菜蛾盤絨繭蜂多分dna病毒cvbv26-4基因成功插入到轉(zhuǎn)基因果蠅的基因組中，轉(zhuǎn)基因果蠅品系構(gòu)建成功(如圖1)。

2、cvbv26-4轉(zhuǎn)基因果蠅純合體品系的構(gòu)建

本實(shí)施例中cvbv26-4插入到三號(hào)染色體上，故將上述步驟1構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)基因品系與平衡系(w-/w-；sp/cyo；tm2/tm6b)進(jìn)行雜交，依據(jù)后代表現(xiàn)型，挑選出子代具有卷翅、大平衡棒的處女果蠅(w-/w-；+/cyo；tm2/cvbv26-4)以及具有體側(cè)2根以上剛毛、肩部多毛的雄果蠅(w-/w-；sp/+；tm6b/cvbv26-4)，并將挑選出的果蠅進(jìn)行雜交；或者挑選出子代具有卷翅、大平衡棒的雄果蠅(w-/w-；+/cyo；tm2/cvbv26-4)以及具有體側(cè)2根以上剛毛、肩部多毛的處女果蠅(w-/w-；sp/+；tm6b/cvbv26-4)，并將挑選出的果蠅進(jìn)行雜交；雜交后代挑選卷翅、體側(cè)2根以上剛毛的純合體的轉(zhuǎn)cvbv26-4基因的果蠅(w-/w-；sp/cyo；cvbv26-4/cvbv26-4)進(jìn)行保種。

3、cvbv26-4轉(zhuǎn)基因果蠅在體內(nèi)的表達(dá)

利用uas/gal4系統(tǒng)，將步驟2中純合體的cvbv26-4轉(zhuǎn)基因果蠅與bs8700(flybaseid:fbti0064641)果蠅品系進(jìn)行雜交，使得cvbv26-4在果蠅血細(xì)胞中特異表達(dá)，并以cvbv26-4轉(zhuǎn)基因品系與野生型w1118雜交作為對(duì)照。提取子代血細(xì)胞總rna反轉(zhuǎn)錄為cdna(具體方法同(1)中)，以管家基因actin做內(nèi)參，用定量特異性引物進(jìn)行半定量檢測。

定量特異性引物如下：

cvbv26-4-qpcr-f：5’-tgttttcctcgtcgccattt-3’；

cvbv26-4-qpcr-f：5’-caaaaacattcgaccgctcc-3’；

dro-actin-qpcr-f：5’-gctgagcgtgaaatcgtccg-3’；

dro-actin-qpcr-r：5’-ggagttgtaggtggtctcgtgga-3’。

圖2結(jié)果表明，在mrna水平上，cvbv26-4轉(zhuǎn)基因品系和w1118的雜交后代無cvbv26-4的表達(dá)，而cvbv26-4轉(zhuǎn)基因品系和bs8700的雜交后代表達(dá)量很高。因此，說明得到了在血細(xì)胞中特異表達(dá)cvbv26-4的轉(zhuǎn)基因果蠅。

4、cvbv26-4基因在果蠅血細(xì)胞中特異表達(dá)對(duì)果蠅的影響

a)cvbv26-4在果蠅血細(xì)胞中特異表達(dá)對(duì)血細(xì)胞影響的檢測結(jié)果

利用cvbv26-4轉(zhuǎn)基因品系與野生型w1118和bs8700的處女果蠅分別雜交，提取子代血細(xì)胞，對(duì)子代幼蟲血細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，并置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

圖3結(jié)果表明，對(duì)照組果蠅幼蟲血細(xì)胞生長狀態(tài)正常，而有cvbv26-4特異表達(dá)的果蠅幼蟲血細(xì)胞，出現(xiàn)部分凋亡的現(xiàn)象，并伴隨有凋亡小體的產(chǎn)生(如圖中白色箭頭所指)。

b)cvbv26-4引起果蠅幼蟲血細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果

利用cvbv26-4轉(zhuǎn)基因品系與野生型w1118和bs8700的處女果蠅分別雜交，提取子代血細(xì)胞，對(duì)子代幼蟲血細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，并按照tunelbrightredapoptosisdetectionkit(諾唯贊生物科技有限公司)說明書所述方法進(jìn)行檢測。

圖4結(jié)果表明，對(duì)照組血細(xì)胞無凋亡信號(hào)(白色斑點(diǎn))；而cvbv26-4在果蠅幼蟲血細(xì)胞中特異表達(dá)能引起果蠅幼蟲血細(xì)胞的凋亡(如白色箭頭所示)。

c)cvbv26-4影響果蠅免疫的檢測結(jié)果

利用cvbv26-4轉(zhuǎn)基因品系與野生型w1118和bs8700的處女果蠅分別雜交，向后代果蠅雄成蟲(約60頭)體內(nèi)注射33nlpbs和金黃色葡萄球菌(od＝0.4)。注射后每隔12h，統(tǒng)計(jì)果蠅生存情況，繪制生存曲線。

圖5結(jié)果表明，注射pbs不影響果蠅的生存率；而注射金黃色葡萄球菌后，cvbv26-4轉(zhuǎn)基因品系與bs8700的雜交后代的存活率顯著(p＝0.00023)低于對(duì)照組(cvbv26-4轉(zhuǎn)基因品系與野生型w1118的雜交后代)，表明cvbv26-4能降低果蠅的免疫。

sequencelisting

<110>浙江大學(xué)

<120>cvbv26-4基因在降低果蠅免疫力和制備免疫缺陷型果蠅模型中的應(yīng)用

<130>

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>366

<212>dna

<213>菜蛾盤絨繭蜂多分dna病毒

<400>1

atgatgttcttcagcaaattaccgcttgttttcctcgtcgccattttgggaacatcattt60

ggtgcatggaatggatatccttatccgtcttctgatggatcgagcggatacttttctact120

caaccgaatggaccacagatcaacccttcccagatacctgatggagcggtcgaatgtttt180

tgtcaacctcataaaggaagtggatacctttacccgcaacctaaagtaggcagtggatac240

ccttacccacaatctaaagaaggaagtggatatccctattctcaaatttatagatcgagc300

ggatattctagttcaccactaaataaaggaatcggattcggatatccttatctacaatct360

agttaa366

<210>2

<211>121

<212>prt

<213>菜蛾盤絨繭蜂多分dna病毒

<400>2

metmetphepheserlysleuproleuvalpheleuvalalaileleu

151015

glythrserpheglyalatrpasnglytyrprotyrproserserasp

202530

glyserserglytyrpheserthrglnproasnglyproglnileasn

354045

proserglnileproaspglyalavalglucysphecysglnprohis

505560

lysglyserglytyrleutyrproglnprolysvalglyserglytyr

65707580

protyrproglnserlysgluglyserglytyrprotyrserglnile

859095

tyrargserserglytyrserserserproleuasnlysglyilegly

100105110

pheglytyrprotyrleuglnserser

115120

<210>3

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttcgttaacagatctgcggccgcatgatgttcttcagcaaattacc46

<210>4

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tcctctagaggtaccctcgagttaactagattgtagataaggata45

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tgttttcctcgtcgccattt20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

caaaaacattcgaccgctcc20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gctgagcgtgaaatcgtccg20

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ggagttgtaggtggtctcgtgga23