專利名稱：利用鋅指核酸酶敲除牛β-乳球蛋白基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用鋅指核酸酶敲除牛 β-乳球蛋白基因的方法。
背景技術(shù)：
基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物體遺傳信息的技術(shù)，常規(guī)基因打靶動(dòng)物生產(chǎn)的兩大限制因素為第一，動(dòng)物體細(xì)胞基因打靶效率很低，10_6 10_7;第二，生產(chǎn)雙等位基因敲除的動(dòng)物時(shí)間周期長，克隆效率低。伴隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，涌現(xiàn)出很多新的技術(shù)和方法來提高基因打靶效率，如采用無啟動(dòng)子篩選的基因打靶策略，動(dòng)物中干細(xì)胞的分離及誘導(dǎo)等。但是這些改進(jìn)對于生產(chǎn)基因打靶動(dòng)物并沒有顯著的推動(dòng)作用，所以基因打靶動(dòng)物的生產(chǎn)一直處于緩慢發(fā)展階段。最近幾年，鋅指蛋白核酸酶(ZFNs)的出現(xiàn)極大地提高了基因打靶的效率，其將成為生產(chǎn)基因敲除動(dòng)物的一個(gè)重要的突破口。牛奶過敏(cow’s milk allergy)是小兒最常見的食物過敏類型之一，在許多歐美發(fā)達(dá)國家，嬰兒牛奶過敏發(fā)生率約為2% 3%。牛奶過敏是指機(jī)體對牛奶蛋白的高反應(yīng)性 (hypersensitivity)。牛奶中含有多種蛋白質(zhì)，其中，α-Sl酪蛋白和β-乳球蛋白是引起牛奶過敏的主要過敏源。乳球蛋白是反芻動(dòng)物如牛、羊和單胃動(dòng)物如豬、馬、貓乳中的主要乳清蛋白，人類和嚙齒類中基本不存在該蛋白(Kontopidis等，2004，J. Dairy Sci. 87 :785-796)。β-乳球蛋白具有凝聚能力和疏水性，一方面可以作為食品添加劑，用于甜點(diǎn)、調(diào)味料和涂抹性食品中；另一方面，乳球蛋白具有較強(qiáng)的視黃醇結(jié)合能力和脂肪酸結(jié)合能力，可以用來包含脂溶性維生素用于乳制品、焙烤食品、運(yùn)動(dòng)飲料和營養(yǎng)增補(bǔ)劑。利用乳球蛋白的熱還原性，還可以模擬和代替無脂食品中的動(dòng)物油，或者將改良的乳球蛋白應(yīng)用于酸奶中， 可使普通酸奶的成膠性提高6-10倍。然而β -乳球蛋白功能的研究報(bào)道還較少，尤其是在牛乳中營養(yǎng)功能的研究方面鮮有報(bào)道。此外，該蛋白在牛奶中的低量表達(dá)或者不表達(dá)對于牛奶過敏是一種有利的緩解措施。通過基因打靶技術(shù)，將該基因失活，是研究其功能和緩解牛奶過敏的一個(gè)理想的手段。鋅指蛋白核酸酶(ZFNs)融合了 DNA調(diào)控元件特異性的結(jié)合DNA的特性以及內(nèi)切核酸酶的催化活性，N末端的鋅指蛋白能夠特異的結(jié)合DNA序列，通過C末端內(nèi)切核酸酶 FokI的催化作用，使得DNA雙鏈分子產(chǎn)生斷裂(DSB)，緊接著DSB就會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)自身修復(fù)機(jī)制。目前主要的修復(fù)機(jī)制有兩種一種是非同源重組的末端連接修復(fù)機(jī)制，另一種是同源重組修復(fù)機(jī)制。前一種修復(fù)機(jī)制是一種易錯(cuò)修復(fù)常常會(huì)產(chǎn)生遺傳信息的改變，而利用同源重組修復(fù)機(jī)制來修復(fù)DSB是一種高保真的修復(fù)方式，一般以另一條姐妹染色體為模板進(jìn)行精確修復(fù)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，前一種修復(fù)機(jī)制占主導(dǎo)作用，借助ZFNs特異性產(chǎn)生DSB， 引發(fā)細(xì)胞非同源重組的末端連接修復(fù)，在DSB位點(diǎn)引入小片段刪除，或者插入，造成移碼突變，或者蛋白關(guān)鍵序列的缺失達(dá)到基因敲除目的(圖1)。
應(yīng)用ZFNs介導(dǎo)基因敲除或者修飾在斑馬魚，擬南芥等模式生物中已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)， 并且效率較高 10 50% (Doyon，Y 等，Nat. Biotech. 2008,26 :702-708 ；Lloyd, A 等，PNAS 2005，102 :2232-2237)。本發(fā)明證實(shí)了利用ZFNs在動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因的刪除或者精細(xì)修飾是一種行之有效的方法，能夠成功獲得基因敲除克隆牛。常規(guī)基因打靶克隆牛的生產(chǎn)流程，包括構(gòu)建基因打靶載體，載體轉(zhuǎn)染，細(xì)胞藥物篩選，細(xì)胞單克隆的鑒定，體細(xì)胞核移植，克隆牛的鑒定。如果需要對第二個(gè)等位基因也進(jìn)行敲除，需要經(jīng)歷上述同樣的過程，即需要進(jìn)行兩次細(xì)胞克隆，并且最后得到的克隆牛含有藥物篩選時(shí)所必須的抗性基因，最后要得到不含有抗性基因的動(dòng)物個(gè)體還要經(jīng)歷一次體細(xì)胞克隆。以牛為例完成上述過程需要的時(shí)間為載體構(gòu)建3個(gè)月，細(xì)胞篩選1個(gè)月，體細(xì)胞核移植、胚胎發(fā)育1個(gè)月，胚胎移植妊娠到小牛出生10個(gè)月。這樣，一次克隆至少需要14個(gè)月的時(shí)間。并且在細(xì)胞篩選過程中，有些甚至無法得到陽性單細(xì)胞克隆。如果實(shí)現(xiàn)無抗性基因的基因敲除牛需要進(jìn)行三次克隆，則所需時(shí)間就至少需要42個(gè)月，周期長、風(fēng)險(xiǎn)高。而本研究證明，利用ZFNs技術(shù)，可以在12個(gè)月內(nèi)得到雙等位基因完全敲除并且不含有抗性基因的克隆牛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用鋅指核酸酶敲除牛β -乳球蛋白基因的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用鋅指核酸酶敲除牛乳球蛋白基因的方法，包括如下步驟1)根據(jù)牛β -乳球蛋白基因序列，設(shè)計(jì)ZFNs-Set 1和ZFNs-Set 2，其作用的DNA 序列分別為ZFNs-Set 1 :CCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGA ZFNs-Set 2 :AGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATAT。2)構(gòu)建ZFNsIet 1和ZFNsIet 2的真核表達(dá)載體，所述真核表達(dá)載體是 pBudCE-ZFNl-2，它的堿基序列如SEQ ID NO :1所示；可以是兩個(gè)獨(dú)立的ZFN真核表達(dá)載體， 也可以是一個(gè)共表達(dá)載體。共表達(dá)載體的構(gòu)建將已經(jīng)鑒定能在牛成纖維細(xì)胞系高效介導(dǎo)BLG基因敲除的一對 ZFNs (PZFm/PZFN2-set 1)構(gòu)建到共表達(dá)載體 pBudCE4. 1 (Invitrogen)上，分別以 PZFNl/PZFN2-set 1為模板，以引物1、2和3擴(kuò)增PZFNl/PZFN2_set 1上的鋅指蛋白核酸酶表達(dá)元件，引物1上含有Not I酶切位點(diǎn)，以引物1、3擴(kuò)增ZFN1，將PCR產(chǎn)物TA克隆連接到 Simple-T(TaKaRa)載體上，測序驗(yàn)證無突變克隆，通過Not I和Bio I雙酶切，將酶切產(chǎn)物連接到pBudCE4. 1載體上，獲得pBudCE-ZFNl。引物2上含有Ml I酶切位點(diǎn)，以引物2、3 擴(kuò)增ZFN2將PCR產(chǎn)物TA克隆連接到simple-T (TaKaRa)載體上，測序驗(yàn)證無突變克隆，通過I和)(ba I雙酶切，將酶切產(chǎn)物連接到pBudCE-ZFNl載體上，獲得pBudCE-ZFNl-2，其堿基序列如SEQ ID NO :1所示，載體構(gòu)建參見圖2。構(gòu)建完成的鋅指蛋白核酸酶共表達(dá)載體，可以同時(shí)表達(dá)一對鋅指蛋白核酸酶，兩個(gè)鋅指蛋白核酸酶分別在CMV和EF-I α強(qiáng)啟動(dòng)子下游，可以瞬時(shí)高效表達(dá)該對鋅指蛋白核酸酶，從而介導(dǎo)BLG基因的敲除。引物 1 :5’ -ATAAGAATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGG-3’引物 2 5，-ACGCGTCGACTAATACGACTCACTATAGGG-3，
引物 3 5，-AAACGATCCTCATCCTGTCTCTT-3，3)將上述表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中，PCR產(chǎn)物測序方法檢測β-乳球蛋白基因發(fā)生敲除的細(xì)胞。本發(fā)明還提供通過上述方法獲得的基因敲除細(xì)胞。本發(fā)明還提供利用鋅指核酸酶生產(chǎn)β -乳球蛋白基因敲除克隆牛的方法。本發(fā)明還提供一種制備乳球蛋白基因敲除的?？寺∨咛サ姆椒ǎ湟郧笆龅幕蚯贸?xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)獲得?？寺∨咛ァ１景l(fā)明進(jìn)一步提供一種制備轉(zhuǎn)基因牛的方法，其是將前述方法制備的克隆胚胎通過非手術(shù)法移入牛子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因牛。本發(fā)明首次利用鋅指核酸酶(ZFNs)成功敲除牛成纖維細(xì)胞中的β-乳球蛋白 (BLG)基因，由此獲得基因敲除克隆牛，與常規(guī)的通過基因打靶技術(shù)獲得克隆牛相比，利用 ZFNs介導(dǎo)的基因敲除，在單細(xì)胞克隆中的敲除效率在15% 40%之間，而常規(guī)的基因打靶效率僅為10_6 10_7，效率提高了 IO4 105，為生產(chǎn)基因敲除動(dòng)物提供了極大的便利。另外，利用ZFNs介導(dǎo)的基因敲除，可以實(shí)現(xiàn)一次轉(zhuǎn)染，得到雙等位基因敲除的細(xì)胞克隆，這在常規(guī)基因打靶過程中是難以實(shí)現(xiàn)的，省去了藥物篩選過程，有利于細(xì)胞單克隆的形成，避免了細(xì)胞需要對抗藥物毒害的過程，對于后續(xù)的體細(xì)胞核移植和胚胎的發(fā)育質(zhì)量起到了關(guān)鍵作用，同時(shí)不含有抗性基因，大大簡化了生物安全評價(jià)過程。


圖1為ZNFs介導(dǎo)BLG基因敲除示意圖。圖2為pBudCE-ZFNl-2表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。圖3為ZFNs介導(dǎo)BLG基因敲除突變類型，其中wt為野生型對照，下劃線堿基為插入序列，…為缺失堿基，括號(hào)數(shù)字代表缺失或者插入堿基個(gè)數(shù)，上角標(biāo)為該突變類型重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)。圖4為發(fā)生基因敲除單細(xì)胞克隆測序結(jié)果峰圖，其中在作用位點(diǎn)附近出現(xiàn)雙峰 (下劃線部分)表明發(fā)生基因敲除，否則為野生型序列。圖5為基因敲除牛測序結(jié)果，其中A 野生型BLG對照；B 克隆牛BLG基因測序結(jié)果，15bp刪除；C 克隆牛BLG基因測序結(jié)果，9bp刪除；B和C為同一頭牛測序結(jié)果，不含有野生型序列，為雙等位基因敲除。圖6為ZFNsIet 1作用位點(diǎn)在不同物種之間的同源性比較，其中方框內(nèi)為ZFNs 切割位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中ZFNs設(shè)計(jì)由Sigma公司完成，引物合成由上海生工完成，序列測定由北京華大完成。Taq酶、T4DNA連接酶、內(nèi)切酶均來自大連TaKaRa公司，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、 mRNA純化試劑盒均購自Applied Biosystems公司，體細(xì)胞克隆所用試劑均購自Sigma公司。酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。
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實(shí)施例IZFN表達(dá)載體的篩選及敲除效率1、ZFN 的篩選BLG(NC_007309. 4)基因序列信息從NCBI網(wǎng)站中獲得，ZFNs設(shè)計(jì)由Sigma公司完成，設(shè)計(jì)ZFNs位點(diǎn)位于第1、2外顯子上。ZFNs-ktl和ZFNsIet 2作用于第一外顯子上， ZFNs-Set 3作用于第二外顯子上。它們作用的DNA序列分別為ZFNs-Set 1 :CCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGA ；ZFNs-Set 2 :AGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATAT ；ZFNs-Set 3 CCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGC。下劃線部分分別為鋅指蛋白結(jié)合序列，中間部分為R)kl內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)。 對應(yīng)的三個(gè) ZFNs 表達(dá)載體分別為:PZFNl/PZFN2-set 1，PZFNl/PZFN2_set 2 和 PZFNl/ PZFN2-set 3。三個(gè)表達(dá)載體在酵母中都能發(fā)揮作用，參考Doyon等，Nat Biotechnol, (2008)26(6) :702ο在牛的成纖維細(xì)胞系中檢測三對表達(dá)載體是否能在對應(yīng)的細(xì)胞基因組DNA序列發(fā)揮切割作用。在ZFNs位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，setl/2-F 5' -AGGCCTCCTATTGTCCTCGT-3’ ； setl/2-R :5，-GCAAAGGACACAGGGAGAAG-3，；set3-F :5，-CAGCCTCACGTAACCTTTGT-3，；set3_R 5， -CCTGCCTTACTGTATGTATC-3，。電轉(zhuǎn)(ΑΜΑΧΑ公司)三對ZFNs的mRNA，電轉(zhuǎn)參數(shù)為T-016，轉(zhuǎn)染劑量為4 μ g mRNA 每IO6個(gè)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)M小時(shí)后提取總細(xì)胞基因組；進(jìn)行細(xì)胞PCR產(chǎn)物回收純化，純化產(chǎn)物測序。如果ZFNs發(fā)揮切割作用，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自身修復(fù)機(jī)制，在切割位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)小片段的刪除或者插入，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果峰圖為雜合峰圖，即該ZFNs可用于后續(xù)基因敲除。以CEL-I酶為主要檢測ZFNs是否發(fā)揮作用的依據(jù)，CEL-I檢測需要突變類型占據(jù)一定比例，否則不能檢出，本發(fā)明證實(shí)，當(dāng)敲除效率為6%時(shí)(TA克隆統(tǒng)計(jì)測序結(jié)果)，CEL-I 檢測結(jié)果為陰性。2、ZFN敲除效率敲除效率的統(tǒng)計(jì)采用TA克隆測序的方式計(jì)算，電轉(zhuǎn)M小時(shí)后提取總細(xì)胞基因組； 進(jìn)行細(xì)胞PCR產(chǎn)物回收純化，T載體連接，測序，序列比對分析，突變類型與總有效測序總數(shù) (野生型與突變型克隆的總和)的比值則為敲除效率。在三對ZFNs中，第一對有較高的敲除效率(6. 9% 31. %)，測序得到多種敲除基因類型(圖3)。第二對效率較低(O 6% )，第三對不發(fā)揮作用。3、ZFN真核表達(dá)載體的構(gòu)建ZFNs-Set 1和ZFNsIet 2兩個(gè)鋅指酶需要同時(shí)表達(dá)才能一起發(fā)揮敲除BLG基因的功能，因此在構(gòu)建載體時(shí)可以分別構(gòu)建ZFNsIet 1和ZFNsIet 2的真核表達(dá)載體，將兩個(gè)載體同時(shí)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)兩個(gè)鋅指酶同時(shí)表達(dá)，也可以將ZFNsIet 1和ZFNsIet 2構(gòu)建到一個(gè)共表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)兩個(gè)鋅指酶，共表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于減少后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、檢測等操作程序，能保證同時(shí)表達(dá)兩個(gè)鋅指酶。以下為共表達(dá)載體的構(gòu)建原理PBudCE-ZFNl-2共表達(dá)載體，堿基序列如SEQ ID NO 1所示。鋅指蛋白核酸酶編碼部分，由兩部分組成結(jié)合特異染色體序列的鋅指蛋白結(jié)合域；非限制性內(nèi)切核酸酶i^okl切割域。鋅指蛋白結(jié)合域的設(shè)計(jì)和構(gòu)建可參考美國 No. 6，453，242和6，534，261。本發(fā)明ZFNs設(shè)計(jì)含有5個(gè)鋅指蛋白單體，可特異結(jié)合15個(gè)堿基對。鋅指蛋白的作用機(jī)理可參考miller等(1985) EMBO J. 4 1609 ；Rhodes (1993) Scientific American Feb. :56_65。非限制性內(nèi)切核酸酶FokI切割域，由IIS型Fok I 內(nèi)切核酸酶構(gòu)成，其作用方式和機(jī)理可參考Li等(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 89: 4375-4279 ;Li 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 90 :2764-2768 ;Kim 等(1994a)Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 91 :883-887 ；結(jié)合域和切割域兩部分構(gòu)成融合表達(dá)蛋白，通過酶切連接的方法連接到表達(dá)載體上。以下為共表達(dá)載體的構(gòu)建過程將已經(jīng)鑒定能在牛成纖維細(xì)胞系高效介導(dǎo)BLG基因敲除的一對 ZFNs (PZFNl/PZFN2-set 1)構(gòu)建到共表達(dá)載體 pBudCE4. 1 (Invitrogen)上， 分別以PZFNl/PZFN2-set 1為模板，以引物1、2和3擴(kuò)增PZFNl/PZFN2_set 1上的鋅指蛋白核酸酶表達(dá)元件，引物1上含有Not I酶切位點(diǎn)，以引物1、3擴(kuò)增ZFNlJf PCR產(chǎn)物TA克隆連接到simple-T (TaKaRa)載體上，測序驗(yàn)證無突變克隆，通過Not I和Bio I雙酶切，將酶切產(chǎn)物連接到pBudCE4. 1載體上，獲得pBudCE-ZFNl。引物2上含有Ml I酶切位點(diǎn)，以引物 2、3擴(kuò)增ZFN2，將PCR產(chǎn)物TA克隆連接到simple-T (TaKaRa)載體上，測序驗(yàn)證無突變克隆， 通過I和Xba I雙酶切，將酶切產(chǎn)物連接到pBudCE-ZFNl載體上，獲得pBudCE-ZFNl-2， 構(gòu)建過程如圖2。構(gòu)建完成的鋅指蛋白核酸酶共表達(dá)載體，可以同時(shí)表達(dá)一對鋅指蛋白核酸酶，兩個(gè)鋅指蛋白核酸酶分別在CMV和EF-I α強(qiáng)啟動(dòng)子下游，可以瞬時(shí)高效表達(dá)該對鋅指蛋白核酸酶，從而介導(dǎo)BLG基因的敲除。引物 1 :5’ -ATAAGAATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGG-3’
引物 2 5，-ACGCGTCGACTAATACGACTCACTATAGGG-3，引物 3 :5，-AAACGATCCT CATCCTGTCT CTT-3，實(shí)施例2單細(xì)胞克隆的獲得以及基因敲除克隆的鑒定1、單細(xì)胞克隆的獲得利用AMAXA電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)牛的成纖維細(xì)胞，選用優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)Τ-016，基因轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到90%以上。轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)為mRNA，在細(xì)胞內(nèi)的半衰期約為8小時(shí)，不會(huì)存在轉(zhuǎn) DNA時(shí)隨機(jī)插入細(xì)胞基因組的情況，對于動(dòng)物的遺傳穩(wěn)定性有良好的保證。同時(shí)不會(huì)有抗性基因的隨機(jī)整合，符合生物安全方面的要求。具體操作方法以質(zhì)粒pBudCE-ZFNl-2為模板，用AppliedBiosystems公司試劑盒回收純化體外轉(zhuǎn)錄的mRNA，DEPC水洗脫溶解，使其終濃度在500ng/ μ 1左右。一對ZFNs 對應(yīng)的mRNA各2 μ g，總的mRNA量為4 μ g，轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量為1 X IO6,電轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞接種于 T25細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)M小時(shí)后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照每500個(gè)細(xì)胞/IOcm皿密度將細(xì)胞接種于IOcm培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充含有15% FBS的DMEM培養(yǎng)基10毫升，在含有5% CO2的37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-7天后，瓶皿表面會(huì)形成分散的單細(xì)胞克隆，在顯微鏡下挑選細(xì)胞分裂相多、細(xì)胞輪廓清晰、細(xì)胞之間緊密、光澤度好的單細(xì)胞克隆，擴(kuò)繁到48孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件不變。3-4天后細(xì)胞鋪滿整個(gè)孔，消化細(xì)胞，取出1/10的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞PCR，用于鑒定細(xì)胞單克隆是否發(fā)生基因敲除；剩余細(xì)胞接種于6孔板，用于后續(xù)陽性克隆的細(xì)胞凍存。2、基因敲除單細(xì)胞克隆的鑒定單細(xì)胞克隆分子的鑒定采用測序技術(shù)，能夠準(zhǔn)確判定基因的DNA序列。具體的操作方法單細(xì)胞克隆在48孔板鋪滿孔后，消化細(xì)胞，取出1/10的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞PCR，PCR產(chǎn)物回收純化，分成兩部分檢測，一部分直接進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序工作。若該克隆發(fā)生了基因敲除，則PCR產(chǎn)物測序峰圖呈現(xiàn)在切割位點(diǎn)后雙峰的結(jié)果，如圖4所示。針對含有特異雙峰結(jié)果的細(xì)胞克隆，將另一部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，精確定位基因敲除位點(diǎn)以及詳細(xì)的序列
fn息ο常規(guī)ZFNs介導(dǎo)基因敲除的分子檢測為CEL-I檢測，本發(fā)明證實(shí)，通過測序方法得到的結(jié)果更加直接，容易操作，并且準(zhǔn)確率可以達(dá)到100%。實(shí)施例3基因敲除單細(xì)胞克隆的胚胎及克隆牛的制備1、基因敲除牛的制備具體過程包括(1)荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)取40日齡荷斯坦奶牛胎兒耳組織，經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍等體外培養(yǎng)操作， 建立牛胎兒成纖維細(xì)胞系。(2)基因敲除單細(xì)胞克隆基因敲除單細(xì)胞克隆的獲得同實(shí)施例2。(3)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎制備及胚胎移植從屠宰廠收集成年牛的卵巢，取直徑2 8毫米的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體，將卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體以50-60枚/孔放入含成熟液 (M199+10%胎牛血清+0. 01U/ml牛促卵泡激素+0. 01U/ml牛促黃體生成激素+1 μ g/ml雌二醇)的四孔板，在38. 5°C,5% C02培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)18 20h后，將成熟的卵母細(xì)胞放入含有0. 1 %透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2 :3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植受體。將帶有第一極體的卵母細(xì)胞移入含M199+10% FBS+7. 5 μ g/ml細(xì)胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，然后用內(nèi)徑為20 μ m 的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細(xì)胞內(nèi)的染色體一并吸除，再放入M199+20% FBS 的溶液中洗三遍后，置于培養(yǎng)箱中備用。將血清饑餓2 4d的供體細(xì)胞(及上述轉(zhuǎn)有抗體雙鏈基因及標(biāo)記載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞)用0. 25%胰蛋白酶消化2 ％iin，選擇直徑為10 12 μ m的體細(xì)胞用20 μ m直徑玻璃管將其移入去核的卵母細(xì)胞透明帶內(nèi)，然后將其放入Zimmerman液(Brophy B等，2003. Nat Biotechnol21 (2) :157-162)中平衡3 5min后放入融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)卵細(xì)胞使供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞接觸面與電場垂直，同時(shí)在直流脈沖的場強(qiáng)為2. 5kV/cm，脈沖時(shí)間為10μ s， 脈沖次數(shù)為2次，脈沖間隔為Is的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構(gòu)胚移入M199+10% FBS液中。將重構(gòu)胚放入5 μ mol/L離子霉素液中，^iin后移至 1. 9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CRlaa+5% FBS液中，在38. 5°C, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。將形態(tài)優(yōu)良的第7天的克隆囊胚移入同期受體母牛的子宮角內(nèi)。受體母牛選擇的都是經(jīng)產(chǎn)母牛，在移植后的第60天進(jìn)行直腸檢測，以確定妊娠率。2、基因敲除牛的分子鑒定基因敲除牛的分子鑒定具體操作過程為取牛耳部組織黃豆粒大小，消化提取耳組織基因組DNA，實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。用上、下游檢測引物F:
85，-AGGCCTCCTATTGTCCTCGT-3，和 R :5，-GCAAAGGACACAGGGAGAAG-3，擴(kuò)增目的序列。純化回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)行TA克隆并對菌落單克隆測序分析。結(jié)果表明，出生的6頭牛犢均為雙等位基因敲除的克隆牛，BLG基因敲除類型為 9bp和15bp刪除(圖5)，與細(xì)胞水平的鑒定結(jié)果一致。實(shí)施例4ZFNs敲除細(xì)胞off-targeting效應(yīng)檢測ZFNs敲除細(xì)胞off-targeting效應(yīng)，是指在ZFNs除了特異性很強(qiáng)的結(jié)合靶序列同時(shí)，也會(huì)作用于其他的相似序列，這樣就會(huì)產(chǎn)生不想要的敲除類型，同時(shí)也可能影響個(gè)體的生長發(fā)育，對于試驗(yàn)結(jié)果可信度造成較大負(fù)面影響。靶位點(diǎn)選擇過程當(dāng)中已經(jīng)排除大量off-targeting位點(diǎn)，在表1中，以set 1為例，除了在牛的全基因組內(nèi)含有1個(gè)特異的靶位點(diǎn)之外，其相似序列相對較少，只有在含有6個(gè)堿基不同時(shí)才會(huì)出現(xiàn)，這樣ZFNs的 off-targeting效應(yīng)在一定程度上被減小。表IZFNs作用位點(diǎn)以及相應(yīng)的off-targeting位點(diǎn)
基因組范圍內(nèi)含有不匹配堿基的序列位點(diǎn)數(shù)量
ZFNs結(jié)合位點(diǎn)序列(劃線序列)
0 1 2 3 4 5 6 7
Set 1 CCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGA1 0 0 0 0 0 12 47
Set 2 AGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATAT1 0 0 0 0 1 7 66
Set 3 CCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGC 1 0 0 0 1 0 0 9為了更好的檢測ZFNs的off-targeting效應(yīng)，本發(fā)明還比較了在不同物種之間 BLG基因序列的相似性，在豬和羊中我們發(fā)現(xiàn)ZFNs作用位點(diǎn)相似性很高(圖6)，在羊的序列中，只含有3個(gè)堿基的差異，ZFNs作用位點(diǎn)相似性高達(dá)91. 7%，豬中含有7個(gè)堿基的不同，因此，用相同條件檢測ZFNs在這兩種細(xì)胞中的作用情況，大量測序結(jié)果表明，在牛細(xì)胞中發(fā)揮作用的ZFNsIet 1在豬和羊的細(xì)胞系中均不發(fā)揮作用，間接證明了 ZFNs作用的特異性。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用鋅指核酸酶敲除牛β-乳球蛋白基因的方法，其特征在于，包括如下步驟1)根據(jù)牛β-乳球蛋白基因序列，設(shè)計(jì)ZFNsIet1和ZFNsIet 2，其作用的DNA序列分別為ZFNs-Set 1 :CCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGA ；ZFNs-Set 2 :AGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATAT ；2)構(gòu)建ZFNs-Set1和ZFNs-Set 2的真核表達(dá)載體；3)將上述真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中，PCR擴(kuò)增，測序檢測β-乳球蛋白基因發(fā)生敲除的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟幻中所述真核表達(dá)載體是 pBudCE-ZFNl-2，它的堿基序列如SEQ ID NO 1所示。
3.通過權(quán)利要求1或2所述的方法獲得的基因敲除細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法在生產(chǎn)基因敲除克隆牛中的應(yīng)用。
5.一種制備乳球蛋白基因敲除的牛克隆胚胎的方法，其以權(quán)利要求3所述的基因敲除細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)獲得牛克隆胚胎。
6.一種制備轉(zhuǎn)基因牛的方法，其是將權(quán)利要求5所述方法制備的克隆胚胎通過非手術(shù)法移入牛子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因牛。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用鋅指核酸酶敲除牛β-乳球蛋白基因的方法，其是根據(jù)牛β-乳球蛋白基因序列，設(shè)計(jì)ZFNs特異位點(diǎn)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入牛的成纖維細(xì)胞中，獲得β-乳球蛋白基因敲除的細(xì)胞。利用ZFNs介導(dǎo)的基因敲除，可以實(shí)現(xiàn)一次轉(zhuǎn)染，得到雙等位基因敲除的細(xì)胞克隆，這在常規(guī)基因打靶過程中是難以實(shí)現(xiàn)的，省去了藥物篩選過程，有利于細(xì)胞單克隆的形成，避免了細(xì)胞需要對抗藥物毒害的過程，對于后續(xù)的體細(xì)胞核移植效率和胚胎的發(fā)育質(zhì)量的提高起到了關(guān)鍵作用，同時(shí)不含有抗性基因，大大簡化了生物安全評價(jià)過程。
文檔編號(hào)C12N15/877GK102212545SQ201110086319
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者丁方榮, 于勝利, 李寧, 李松, 湯波, 羅俊杰 申請人:北京濟(jì)福霖生物技術(shù)有限公司