專利名稱：：增強(qiáng)來(lái)自I-CreI的大范圍核酸酶的切割活性的方法增強(qiáng)來(lái)自卜Crel的大范圍核酸酶的切割活性的方法本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)來(lái)自I-Cre]:的大范圍核酸酶的切割活性的方法，及其用于制造切割目的DNA靶標(biāo)的大范圍核酸酶的應(yīng)用，用于基因組療法(治療遺傳疾病)和基因組改造(制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物和重組細(xì)胞系)的應(yīng)用。同源重組是精確改造給定基因座的最佳途徑。同源基因耙向策略已用于在染色體中敲除內(nèi)源基因(C鄰ecchi，M.R.，Science,1989,244，1288-1292;Smithies，()Nat.Med.，2001,7，1083-1086)或敲入外源序列。其同樣能夠用于基因修正，通常用于修正與單基因疾病相關(guān)的突變。然而由于該過(guò)程的效率低(轉(zhuǎn)染細(xì)胞的10—6到10—9)，事實(shí)上這種應(yīng)用是困難的。最近十年中開(kāi)發(fā)了若干方法來(lái)提高這一產(chǎn)率。(DeSemir等，J;GeneMed.2003,5，625-639;DeSemirD.和AranJ.，GeneTher.2002，9，683—685;Sangiuolo等，BMCMed.Genet.，2002，3，8_;Goncz等，GeneTher.，2001，8，961-965)。增強(qiáng)重組效率的一種精妙的策略是使用大范圍核酸酶將DNA雙鏈斷裂遞送進(jìn)耙基因座中。在自然界中，大范圍核酸酶基本上以歸巢內(nèi)切核酸酶(IIomingEndonuc1ease,HE)為代表。歸巢內(nèi)切核酸酶是一種廣泛的天然大范圍核酸酶家族，包括數(shù)百個(gè)蛋白質(zhì)家族(ChevalierB.S.和B.L.Stoddard,NucleicAcidsRes.，2001，29，3757-3774)。這些蛋白質(zhì)由可動(dòng)遺傳因子編碼，所述可動(dòng)遺傳因子通過(guò)稱作"歸巢"的過(guò)程增殖內(nèi)切核酸酶切割其中不存在該可動(dòng)遺傳因子的同源等位基因，從而刺激同源重組事件,所述事件將該可動(dòng)DNA復(fù)制進(jìn)受者基因座。先驅(qū)工作顯示，它們可用于切割活細(xì)胞中的獨(dú)特位點(diǎn)，從而將切割位點(diǎn)附近的基因靶向增強(qiáng)誦倍或者更多(Rouet.等，Mol.Cell.Biol.，1994,14，8096-8106;Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1996，93，5055-5060;Puchta等，NucleicAcidsRes.，1993,21,5034-5040;Elliott等，Mol.Cell.Biol.，1998,18,93-101;Cohen-Tannoudji等，Mol.Cel丄Biol.，1998，18,1444-1448;Chou:l.ika等，Mo:l..Cell.Biol.，1995，15，1968-1973;Donoho等，Mol.Cell.Biol.,1998，18，4070-4078;Sargent等，Mol.Cell.Biol.，1997，17,267-277)。然而，該技術(shù)的使用受到天然大范圍核酸酶種類(r印ertoire)的限制。因此，進(jìn)行了大量研究來(lái)產(chǎn)生具有定制的特異性的大范圍核酸酶，并且若干實(shí)驗(yàn)室已嘗試改變天然大范圍核酸酶的特異性(Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10,895-905;Epinat.等，NucleicAcidsRes.，2003，31，2952-2962;Arnould等，J.Mol.Biol.，2006,355,443-458;Sussman等，J.Mol.Biol.，2004，342，3卜41;Smith等，NucleicAcidsRes.,2006,34,e149;Seligman等，Genetics,1997,147,1653-1664;國(guó)際PCT申i青W()03/078619，WO2004/031346，WO2006/097784，WO2006/097853.)?？梢酝ㄟ^(guò)進(jìn)化分子改造(也稱作定向進(jìn)化或體外進(jìn)化)來(lái)修飾酶特性(Arnold,F.H.和J.C.Moore，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，1997，58，1_14;Rubingh，D.N.，Curr.Opin.Biotechnol.，1997,8,417-422)，并且若干研究描述了對(duì)穩(wěn)定性(Giver等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1998,95，12809—12813;Zhao，H:和F.H.Arnold,Protein.Eng.，1999，12,47-53.)、活性(Taguchi等，Appl.Environ.Microbiol.,1998，64，492-495)、改變的底物特異性(Yano等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1998，95，55U-5515)和與表面正確相互作用的能力(Egmond等，Adv.Exp.Med.Biol.，1996,379,219-228)的成功優(yōu)化。通常，定向進(jìn)化依賴于或多或少的隨機(jī)誘變，所述隨機(jī)誘變通過(guò)PCR(CadwellR.C.andG.F.Joyce,PCRMethodsApplic.，1992，2，28-33.)和DNA改組(Te咖er，W.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1994,91,10747-10751)實(shí)現(xiàn)，目的變體通過(guò)適宜的篩選方法來(lái)鑒定。推理性設(shè)計(jì)(rationaldesign)是一種完全不同的策略，其依賴于對(duì)結(jié)構(gòu)特性和構(gòu)效關(guān)系的深入了解(Scrutton等，Nature,1990，343，38-43;Craik等，Science,1985，228,291-297)。計(jì)算生物學(xué)的快速發(fā)展以及用于能量計(jì)算的強(qiáng)大軟件的開(kāi)發(fā)對(duì)這類途徑給予了新的推動(dòng)力(Schueler-Furman等，Science,2005，310，638-642)。計(jì)算研究可以用于設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)，包括大范圍核酸酶(Chevalier等，Mo:l..Cell.2002，10,895-905;Ashworth等，Nature,2006，441，656-659)。然而，目前的許多蛋白質(zhì)工程研究以雜合策略為基礎(chǔ)，有時(shí)稱作半推理的(Chica等，Curr.Opin.Biot.echnol.，2005，16,378-384)。這些研究依賴于結(jié)構(gòu)信息(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006,355,443-458;Santoro，S.W.和P.G.Schu:l.tz，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2002，99,4185-4190;Rui等，J.Biol.Chem.,2004，279，46810-46817)和/或計(jì)算機(jī)研究(Hayes等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2002，99，15926-15931)來(lái)顯著降低待加工文庫(kù)的復(fù)雜度。最近，使用兩步式策略定制LAGLIDADG大范圍核酸酶的特異性，兩個(gè)步驟均依賴于半推理性步驟(圖1)。第一步是局部誘變蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的特定殘基，并通過(guò)篩選鑒定特異性改變的變體的集合(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006,355,443-458;Smith等，NucleicAcidsRes.，2006，34，e149;國(guó)際PCT申請(qǐng)W02006/097784，W02006/097853，W02007/049156)。第二步是依賴于這些蛋白質(zhì)的模塊性其基于組合方法，其中裝配來(lái)自不同局部改造的變體的突變組合，從而產(chǎn)生具有可預(yù)測(cè)特異性的全局改造蛋白質(zhì)(Smith等，NucleicAcidsRes.，2006，34，e149;國(guó)際PCT申請(qǐng)W02007/049156)。所組合的亞結(jié)構(gòu)域不是完全獨(dú)立的功能單位，因此必須篩選許多不同的組合，從而找到具有預(yù)計(jì)活性的功能性蛋白質(zhì)。因此，該第二步驟也可以被認(rèn)為是半推理的步驟。盡管這一策略顯示了其產(chǎn)生具有針對(duì)選定靶標(biāo)之新特異性的新大范圍核酸酶的能力，但是經(jīng)改造的大范圍核酸酶的切割活性可能很弱，因此可能需要進(jìn)-步的改造步驟以增強(qiáng)該活性。盡管許多先前的研究顯示，以隨機(jī)誘變?yōu)榛A(chǔ)的定向進(jìn)化能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)特性的大幅改善(Ar謂ld等，J.Mol.Biol.，Epub,lOMay2007),但是這樣的實(shí)驗(yàn)可能是耗時(shí)和費(fèi)力的。因此,"便攜式(portable)"特定突變的鑒定對(duì)制造新的高效大范圍核酸酶而言會(huì)是極有幫助的，所述特定突變改進(jìn)天然或經(jīng)改造的大范圍核酸酶的活性而與其底物特異性無(wú)關(guān)。除了效力問(wèn)題以外，特異性對(duì)許多應(yīng)用而言是另一重要特性，特別是對(duì)治療性應(yīng)用而言。雖然I-Seel:歸巢內(nèi)切核酸酶已表明毒性比ZEP的小(Aliin等，Mol.Ther.,2005，12,610—617;Port.eusM.H.禾口BaltimoreD.，Science,2003，300，763;PorteusM.H.禾口CarrollD.，Nat.Biot.echnol，2005，23，967-973)，這可能是由于其特異性較高，但是在非常高的劑量下其仍可能有害(Gouble等，J.GeneMed.，2006,8,616-622)。迄今為止，大多數(shù)改造的內(nèi)切核酸酶(ZFN和HE)是異二聚體,包括兩種分別改造的單體，每種單體結(jié)合所述靶標(biāo)的一半。通過(guò)兩個(gè)單體在相同細(xì)胞中共表達(dá)而形成異二聚體(PorteusH.M.，Mol.Ther.，2006，13,438-446;Smith等，NucleicacidsRes.，2006，34，e149;國(guó)際PCT申請(qǐng)WO2007/097854和W02007/049156)。然而，由于識(shí)別不同的耙標(biāo)實(shí)際上與兩種同二聚體的形成相關(guān)(Ar畫ld等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458;Bibikova等，Genetics,2002，161，1169-1175)，所以單個(gè)同二聚體有時(shí)可導(dǎo)致非常高水平的毒性(Bibikova等，Genetics,2002,161，1169-1175)。因此，仍然限制單LAGLIMDG歸巢內(nèi)切核酸酶(例如I-Crel)廣泛應(yīng)用的因素的是下面這一事實(shí)除了經(jīng)改造的異二聚體以外，蛋白質(zhì)還能形成同二聚體(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458;國(guó)際PCT申請(qǐng)WO2006/097853，W02006/097854，W02006/097784;Smith等，NucleicAcidsRes.，2006，34，el49),導(dǎo)致可能的位點(diǎn)外(off—site)切割。該問(wèn)題可僅通過(guò)抑制功能性同二聚體形成來(lái)解決，所述抑制在理論上可通過(guò)將兩種單體融合在單鏈分子中來(lái)實(shí)現(xiàn)(Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10，895-905;Epinat等，NucleicAcidsRes.，2005，33，5978-5990)。然而，這類設(shè)計(jì)是相對(duì)危險(xiǎn)的，并且能夠?qū)е洛e(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)(Epinat等，NucleicAcidsRes.，2005，33,5978-5990)。破壞個(gè)體同二聚體的功能性會(huì)是另一種解決方法。本發(fā)明公開(kāi)了能夠增強(qiáng)來(lái)自I-Crel同二聚體大范圍核酸酶的經(jīng)改造大范圍核酸酶活性的特定突變。另外，這些突變之一(G19S替換)破壞功能性同二聚體的形成。來(lái)自于1-Crel的經(jīng)改造蛋白質(zhì)通常是異二聚體，其含有分別改造的兩種不同的單體。這樣的異二聚體通過(guò)在靶細(xì)胞中共表達(dá)兩種不同的單體來(lái)獲得。因?yàn)檫@些單體也可以同二聚化，所以細(xì)胞中實(shí)際存在三種分子種類，唯一有用的是異二聚體，而另外兩種能夠?qū)е骂~外的位點(diǎn)外切割。因此，G19S突變不僅改進(jìn)蛋白質(zhì)活性，而且也改進(jìn)特異性。因此，本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶(原始大范圍核酸酶)切割活性的方法，所述方法包括對(duì)選自以下的至少一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變I-Crel的19位甘氨酸(G19)、54位苯丙氨酸(F54)、87位苯丙氨酸(F87)、79位絲氨酸(S79)、105位纈氨酸(V105)和132位異亮氨酸(1132)。定義-氨基酸指天然或合成氨基酸，包括前述氨基酸的對(duì)映體和立體異構(gòu)體。多肽序列中的氨基酸殘基在本文中根據(jù)單字母代碼命名，其中，例如Q表示Gin或谷氨酰胺殘基，R表示Arg或精氨酸殘基，D表示Asp或天冬氨酸殘基。-酸性氨基酸指天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。-堿性氨基酸指賴氨酸(K)、精氨酸(R)和組氨酸(H)。-小氨基酸指甘氨酸(G)和丙氨酸(A)。_芳香族氨基酸指苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。-核苷酸按如下命名使用單字母代碼命名核苷的堿基a為腺嘌呤，t為胸腺嘧啶，c為胞嘧啶，g為鳥(niǎo)嘌呤。對(duì)于簡(jiǎn)并核苷酸而言，r表示g或a(嘌呤核苷酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d表示g、a或t，v表？];g、a或c，b表示g、t或c，h表示a、t或c，n表？];g、a、t.或c。-"大范圍核酸酶"意指具有12-45bp的雙鏈DM耙序列的內(nèi)切核酸酶。所述大范圍核酸酶是二聚體酶(其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域位于一個(gè)單體上)，或是在單一多肽上包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的單體酶。-"I-CreI"意指具有序列SWISSPR0TP05725(對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQIDNO:l)或pdb登錄號(hào)1g9y(對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQIDNO:48)的野生型I-Crel。7-"大范圍核酸酶變體"或"變體"是指通過(guò)將野生型大范圍核酸酶(天然大范圍核酸酶)氨基酸序列中的至少一個(gè)殘基替換為不同的氨基酸而獲得的大范圍核酸酶。-"功能件:變體"是指能夠切割DM靶序列的變體，優(yōu)選地所述靶標(biāo)是不被母體大范圍核酸酶切割的新靶標(biāo)。例如，這些變體在接觸:[)NA靶序列的位置或與所述I)NA靶標(biāo)直接或間接相互作用的位置上具有氨基酸改變。-"具有新特異性的大范圍核酸酶變體"是指具有與母體大范圍核酸酶不同的切割靶標(biāo)模式的變體。等價(jià)且無(wú)差異地使用的術(shù)語(yǔ)"新特異性"、"經(jīng)修飾的特異性"、"新切割特異性"、"新底物特異性"是指變體針對(duì)DM耙序列中核苷酸的特異性。-"大范圍核酸酶結(jié)構(gòu)域"是指這樣的區(qū)域，其與大范圍核酸酶DNA靶標(biāo)的一半相互作用，并能夠與相同大范圍核酸酶的另一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成能夠切割DNA靶標(biāo)的功能性大范圍核酸酶，所述另一結(jié)構(gòu)域與所述DNA靶標(biāo)的另一半相互作用。-"結(jié)構(gòu)域"或"核心結(jié)構(gòu)域"是指"LAGLI:DADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域",它是LAGLIMDG家族歸巢內(nèi)切核酸酶的特征性a^il^c^l^l^c^折疊，對(duì)應(yīng)于約一百個(gè)氨基酸殘基的序列。所述結(jié)構(gòu)域包含在折疊成反向平行P-片層的四條0鏈(|3:l、|32、p3、04),所述13-片層與DNA靶標(biāo)的一半相互作用。該結(jié)構(gòu)域能夠與另一LAGLIMDG歸巢內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成能夠切割DM靶標(biāo)的功能性內(nèi)切核酸酶，所述另一結(jié)構(gòu)域與所述DNA靶標(biāo)的另一半相互作用。例如，在二聚體歸巢內(nèi)切核酸酶I-Crel(163個(gè)氨基酸)的情況下，LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于殘基6到94。-"單鏈大范圍核酸酶"是指包含通過(guò)肽間隔區(qū)連接的兩個(gè)LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域或核心結(jié)構(gòu)域的大范圍核酸酶。單鏈大范圍核酸酶能夠切割嵌合DM靶序列，所述靶序列包含各自母體大范圍核酸酶靶序列中的不同-一半。單鏈大范圍核酸酶還稱作單鏈衍生物、單鏈大范圍核酸酶、單鏈大范圍核酸酶衍生物或嵌合大范圍核酸酶。-"來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶"是指I-Crel的功能性變體以及來(lái)自所述變體的單鏈大范圍核酸酶。-"亞結(jié)構(gòu)域"是指LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域，其與歸巢內(nèi)切核酸酶DNA靶標(biāo)半位點(diǎn)的不同部分相互作用。兩個(gè)不同的亞結(jié)構(gòu)域獨(dú)立作用，并且一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域中的突變不改變另一亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)合和切割特性。因此,兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合歸巢內(nèi)切核酸酶DNA靶標(biāo)半位點(diǎn)的不同部分。-"g-發(fā)夾"是指LAGLIMDG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域反向平行P-片層的兩條連續(xù)！3-鏈(^|32或|33|34)，其通過(guò)環(huán)或轉(zhuǎn)角相連。"I-CreI位點(diǎn)"是指被I-Crel切割的22到24bp雙鏈DNA序列。I-Crel位點(diǎn)包括野生型(天然)非回文I-Cre]:歸巢位點(diǎn)和衍生的回文序列，如序列5'-t..12C..lia,a..9a..8a-7C—6g—5t—4c—3g—2t—ia4C+2g+3a+4C+5g+6t+7t+8t+gt+i。g+na+i2也稱為C1221(SEQIDNO:2;圖2)。-"DNA靶標(biāo)"、"DNA耙序列"、"靶序列"、"耙位點(diǎn)"、"靶標(biāo)"、"位點(diǎn)"；"目的位點(diǎn)"；"識(shí)別位點(diǎn)"、"識(shí)別序列"、"歸巢識(shí)別位點(diǎn)"、"歸巢位點(diǎn)"、"切割位點(diǎn)"是指被LAGLIMDG歸巢內(nèi)切核酸酶(例如:卜Cre:l:)或來(lái)自I-Cre]:的變體或單鏈嵌合大范圍核酸酶識(shí)別并切割的20到24bp雙鏈回文、局部回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列。這些術(shù)語(yǔ)是指大范圍核酸酶要在其中誘導(dǎo)雙鏈斷裂(切割)的獨(dú)特DNA位置，優(yōu)選地為基因組位置。DNA靶標(biāo)通過(guò)雙鏈多核苷酸一條鏈的5'到3'序列來(lái)定義，如上文針對(duì)C1221所指出的。DNA靶標(biāo)的8切割分別發(fā)生在有義和反義鏈+2和-2位的核苷酸處。除非另有說(shuō)明，否則I-CreI大范圍核酸酶變體對(duì)DNA耙標(biāo)進(jìn)行切割的位置對(duì)應(yīng)于DNA耙標(biāo)有義鏈上的切割位點(diǎn)。-"DNA靶標(biāo)半位點(diǎn)"、"半切割位點(diǎn)"或"半位點(diǎn)"是指DNA靶標(biāo)中與各個(gè)LAGLI膽G歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合的部分。-"嵌合DNA靶標(biāo)"或"雜合DNA靶標(biāo)"是指兩條母體大范圍核酸酶靶序列的不同一半的融合物。另外，所述靶標(biāo)的至少一半可包含與至少兩個(gè)獨(dú)立的亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核苷酸組合(組合DM耙標(biāo))。-"皿"是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一核酸的核酸分子。-"JMM"是指一條序列與另一序列具有足夠?qū)е滦蛄虚g同源重組的同一性，更具體地具有至少95%的同一性，優(yōu)選97%的同一性，更優(yōu)選99%的同一性。-"Mzi&"是指兩條核酸分子或多肽之間的序列同一性?？赏ㄟ^(guò)比較各序列中可為比較目的而排列的位置來(lái)測(cè)定同一性。當(dāng)所比較序列中的一個(gè)位置被相同的堿基占據(jù)時(shí)，則這些分子在該位置上是相同的。核酸或氨基酸序列之間的相似性或同--'性程度是核酸序列間共有的位置上相同或匹配的核苷酸數(shù)量的函數(shù)?？墒褂枚喾N比對(duì)算法和/或程序計(jì)算兩條序列之間的同一性，包括FASTA或BLAST，它們可作為GCG序列分析包(UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)的一部分獲得，并可以例如基于默認(rèn)設(shè)定使用。-"±^"包括哺乳動(dòng)物，以及其他脊椎動(dòng)物(例如鳥(niǎo)類、魚和爬行動(dòng)物)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物"是指任何這樣的脊椎動(dòng)物，包括單孔類、有袋類和胎盤動(dòng)物，它們對(duì)其幼仔哺乳，并且分娩活的幼仔(真哺乳亞綱(eutharian)或胎盤哺乳動(dòng)物)或者產(chǎn)卵(后獸亞綱(metatharian)或非胎盤(nonplacenta:l.)哺乳動(dòng)物)。哺乳動(dòng)物物種的實(shí)例包括人和其他靈長(zhǎng)類(例如猴、猩猩)、嚙齒動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和其他，例如牛、豬和馬。-皿是指在多核苷酸(cDNA、基因)或多肽序列中替換、缺失、插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸/氨基酸。所述突變可影響基因的編碼序列或其調(diào)節(jié)序列。其還可影響基因組序列的結(jié)構(gòu)或所編碼mRNA的結(jié)構(gòu)/穩(wěn)定性。-"位點(diǎn)特異性突變"是指核苷酸序列中特定核苷酸/密碼子的突變，與隨機(jī)突變相反。本發(fā)明的方法根據(jù)本領(lǐng)域公知并且可商業(yè)獲得的標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)誘變方法進(jìn)行。可以如下有利地進(jìn)行根據(jù)公知的重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增包含上文所述突變位置的重疊片段。可以通過(guò)任何公知的體外或體內(nèi)切割測(cè)定法來(lái)測(cè)量可以通過(guò)本發(fā)明方法獲得的經(jīng)改進(jìn)大范圍核酸酶的切割活性，例如國(guó)際PCT申請(qǐng)W02004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003，31,2952-2962;Chames等，NucleicAcidsRes.,2005，33,e178;Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458;Arnould等，J.Mol.Biol.，Epub10May2007中所述的測(cè)定法。例如，可通過(guò)直接重復(fù)重組測(cè)定法，通過(guò)與原始大范圍核酸酶的切割活性比較，使用報(bào)告載體在酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)量本發(fā)明變體的切割活性。報(bào)告載體在間插序列內(nèi)包含報(bào)告基因的兩個(gè)截短的非功能性拷貝(直接重復(fù))和被原始大范圍核酸酶切割的基因組DNA靶序列，所述間插序列克隆到酵母或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。大范圍核酸酶的表達(dá)導(dǎo)致基因組DNA耙序列的切割。該切割誘導(dǎo)直接重復(fù)之間的同源重組,產(chǎn)生功能性報(bào)告基因(例如LacZ)，其表達(dá)可以通過(guò)合適的測(cè)定法監(jiān)測(cè)。用與原始大范圍核酸酶相比經(jīng)改進(jìn)的大范圍核酸酶觀察到更強(qiáng)的信號(hào)。或者可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用染色體測(cè)定法，將經(jīng)改進(jìn)的大范圍核酸酶對(duì)其基因組DM耙標(biāo)的活性與相同基因組基因座上I-Cre]:對(duì)I-Crel位點(diǎn)的活性進(jìn)行比較(Ar畫ld等，J.Mol.Biol.，Epub腦ay2007)。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中-19位的甘氨酸被替換為絲氨酸(G19S)或丙氨酸(G19A),-54位的苯丙氨酸被替換為亮氨酸(F54L)，-87位的苯丙氨酸被替換為亮氨酸(F87L)，_79位的絲氨酸被替換為甘氨酸(S79G)，-105位的纈氨酸被替換為丙氨酸(V105A)，且-132位的異亮氨酸被替換為纈氨酸(I132V)。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)I-Crel單體均被突變；每個(gè)單體中的突變可以是相同或不同的。例如，在一個(gè)單體中弓i入G19S或F87L突變，在另一單體中弓|入V105A或I132V突變。在另--個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變同-單體中的至少兩個(gè)殘基；雙突變體具有與每一單突變體相比更高的切割活性。例如，一個(gè)單體同時(shí)具有V105A和I132V兩個(gè)突變。在所述方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述突變還破壞功能性同二聚體的形成。更優(yōu)選地,所述突變是G19S突變。將G19S突變有利地引入異二聚體I-Cre:[變體的兩個(gè)單體之--中，從而獲得具有增強(qiáng)的切割活性和增強(qiáng)的切割特異性的大范圍核酸酶。另外，為了進(jìn)一步增強(qiáng)切割活性，另一單體可以帶有不同的突變，所述突變削弱功能性同二聚體的形成或者有助于異二聚體的形成。原始大范圍核酸酶可來(lái)自于野生型I-Cre]:(SEQIDNO:1或48)或與SEQIDNO:48具有至少85%同一性、優(yōu)選至少90%同--性、更優(yōu)選至少95%同一性的I-Crel骨架蛋白質(zhì)，例如由SEQIDNO:3(167個(gè)氨基酸)組成的骨架，所述骨架具有I-CreI2位....匕的丙氨酸插入、D75N替換和C端AAD插入(164到166位)。原始大范圍核酸酶可在下述位置上包含一個(gè)或多個(gè)突變,所述位置與I)NA靶序列接觸，或與DNA主鏈或核苷酸堿基直接相互作用或通過(guò)水分子相互作用；這些殘基是本領(lǐng)域公知的(Jurica等，MolecularCell.，1998，2，469-476;Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。優(yōu)選所述突變修飾大范圍核酸酶的切割特異性，并且產(chǎn)生具有新特異性的大范圍核酸酶，其能夠從目的基因上切割:[)NA靶標(biāo)。更優(yōu)選地，所述突變是對(duì)應(yīng)于位于I-Crel氨基酸序列的26-40位的第--功能性亞結(jié)構(gòu)域中的--個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換，其改變對(duì)DNA靶標(biāo)中±8-10位核苷酸的特異性，和/或所述突變是對(duì)應(yīng)于位于I-Crel氨基酸序列的44-77位的第二功能性亞結(jié)構(gòu)域中的替換,其改變對(duì)DNA耙標(biāo)中±3至5位核苷酸的特異性，如前文所述(國(guó)際:PCT申請(qǐng)W()2()06/()97784、W()2()()6六)97853和W()2()()7六)49156;Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458;Smith等，NucleicAcidsRes.，2006,34，e149)。所述替換有利地對(duì)應(yīng)于I-Crel氨基酸序列的26、28、30、32、33、38和/或40、44、68、70、75和/或77位。所述替換可以是用選自A、D、E、G、II、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L和W的氨基酸替換原始氨基酸。為了切割其中n—4是t.或者n+4是a的DNA靶標(biāo)，所述變體在44位有利地是谷胺酰胺(Q);為了切割其中n—4是a或者n+4是t的DNA靶標(biāo)，所述變體在44位有利地是丙氨酸(A)或天冬酰胺；為了切割其中n—9是g或者n+9是c的DNA靶標(biāo)，所述變體在38位有利地是精氨酸(:R)或賴氨酸(K)。原始大范圍核酸酶可以是能夠切割回文或假回文DNA靶序列的同二聚體。[酬或者，所述原始大范圍核酸酶是由兩個(gè)單體組成的異二聚體，每個(gè)單體在I-Crel的26到40位和/或44到77位包含不同的突變,并且所述大范圍核酸酶能夠切割目的非回文基因組DNA耙序列。異二聚體大范圍核酸酶有利地是專性異二聚體變體，其具有至少-一對(duì)突變，其對(duì)應(yīng)于第一和第二單體中使兩個(gè)I-Crel單體之間發(fā)生分子間相互作用的對(duì)應(yīng)殘基，其中所述突變對(duì)的第一突變處于第一單體中，所述對(duì)的第二突變處于第二單體中，所述突變對(duì)防止每個(gè)單體形成功能性同二聚體,并且允許形成能夠切割目的基因組DM靶標(biāo)的功能性異二聚體。為了形成專性異二聚體，單體有利地具有至少一個(gè)以下突變對(duì)，分別針對(duì)第一和第二單體a)用堿性氨基酸(優(yōu)選精氨酸)替換8位的谷氨酸(第一單體)，和用酸性氨基酸(優(yōu)選谷氨酸)替換7位的賴氨酸(第二單體)；第一單體還可包含用精氨酸替換7和96位的至少一個(gè)賴氨酸殘基。b)用堿性氨基酸(優(yōu)選精氨酸)替換61位的谷氨酸(第一單體)，和用酸性氨基酸(優(yōu)選谷氨酸)替換96位的賴氨酸(第二單體)；第一單體還可包含用精氨酸替換7和96位的至少一個(gè)賴氨酸殘基。c)用芳香氨基酸(優(yōu)選苯丙氨酸)替換97位的亮氨酸(第一單體)，和用小氨基酸(優(yōu)選甘氨酸)替換54位的苯丙氨酸(第二單體)；第一單體還可包含用色氨酸替換54位的苯丙氨酸，第二單體還可包含用甲硫氨酸替換58位的亮氨酸或57位的賴氨酸,和[畫]d)用堿性氨基酸(優(yōu)選精氨酸)替換137位的天冬氨酸(第-一單體)，和用酸性氨基酸(優(yōu)選谷氨酸)替換51位的精氨酸(第二單體)。例如，第一單體可具有突變D137R,第二單體可具有突變R51D?；蛘?，第一單體可具有突變K7:R、E8R、E61:R、K96R和L97F，或者K7R、E8R、F54W、E61:R、K96R和L97F，第二單體可具有突變K7E、F54G、L58M和K96E，或者K7E、F54G、K57M和K96E。優(yōu)選地，一個(gè)單體包含用酸性氨基酸(優(yōu)選天冬氨酸)替換7位的賴氨酸殘基(K7E),另一單體包含用堿性氨基酸(優(yōu)選賴氨酸)替換8位谷氨酸殘基(E8K)。更優(yōu)選地，一個(gè)單體包含G19S突變和K7E突變而另一單體包含E8K突變，或一個(gè)單體包含G19S突變和E8K突變而另一單體包含K7E突變。也可以在接觸磷酸主鏈的位置上(例如最終C端環(huán)上)引入其他替換(137到143位；Prieto等，NucleicAcidsRes.，Epub22April2007)。優(yōu)選地，所述殘基涉及所述DNA切割位點(diǎn)的結(jié)合和切割。更優(yōu)選地，所述殘基處于I-Crel的138、139、142或143位上?？梢栽谝粋€(gè)變體中突變兩個(gè)殘基，條件是各個(gè)突變?cè)谶x自以下的不同殘基對(duì)中138和139位殘基對(duì)以及142和143位殘基對(duì)。所引入的突變改變最終C端環(huán)中所述氨基酸與I-Crel位點(diǎn)中磷酸主鏈的相互作用。優(yōu)選地，用疏水氨基酸替換138或139位上的殘基，以避免與DNA切割位點(diǎn)的磷酸主鏈形成氫鍵。例如，用丙氨酸替換138位的殘基，或用甲硫氨酸替換139位的殘基。有利地用小氨基酸(例如甘氨酸)替換142或143位的殘基，以減小這些氨基酸殘基側(cè)鏈的大小。更優(yōu)選地，最終C端環(huán)中的所述替換改變了變體針對(duì)I-Crel位點(diǎn)中±1到2、±6到7和/或±11到12位的特異性。另外，可以突變單體整條序列上的其他殘基。突變的例子包括以下突變，以I-Crel氨基酸序列為參考I24V，R70S，將75位上天冬氨酸突變成不帶電的氨基酸，優(yōu)選天冬酰胺(D75N)或纈氨酸(D75V),以及單體序列C端一半(I-Crel的80到163位)中的替換。另外，可以在單體的N:H2端和/或C()()H端插入一個(gè)或多個(gè)殘基。例如，在NH2端引入甲硫氨酸殘基，在NH2端和/或C00H端引入標(biāo)簽(表位HA-標(biāo)簽(YPYDVPDYA;SEQIDNO:49)或S-標(biāo)簽(KETAAAKFERQ麗DS;SEQIDNO:50)或多聚組氨酸序列)；所述標(biāo)簽可用于檢測(cè)和Z或純化大范圍核酸酶。在NH2端引入標(biāo)簽時(shí)，標(biāo)簽序列可以替換變體最前面的氨基酸(變體的至少第一個(gè)甲硫氨酸，和最終的第二個(gè)氨基酸；標(biāo)簽從甲硫氨酸開(kāi)始)或者插入變體的第-一個(gè)(甲硫氨酸)與第二個(gè)氨基酸之間或者第-一個(gè)與第三個(gè)氨基酸之間(不含甲硫氨酸的標(biāo)簽)。變體也可以包含核定位信號(hào)(NLS);所述NLS可用于將所述變體輸入細(xì)胞核中。NLS的一個(gè)例子是KKKRK(SEQIDNO:51)。NLS可以被恰好插入變體的第一甲硫氨酸后，或恰好插入N-端標(biāo)簽后。本發(fā)明還涉及可通過(guò)....匕述方法獲得的來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶(經(jīng)改進(jìn)的大范圍核酸酶)，所述大范圍核酸酶至少包含選自G19S、G19A、F54L、F87L、S79G、V105A和:[i32v的突變，排除選自以下的:卜cre:[變體-I--CreIG19A、K28A、Y33S、Q38R、S40K、R70S、D75N-I--CreIG19A、K28A、Q38R、S40K、R70S、D75N、F87L-1--CrelG19A、K28A、Y33S、Q38R、S40K、D69G、R70S、D75N-]:--CreIY33R、S4()Q、Q44A、R7():H、D75N、F87L、1132T、VI51A-I--CrelY33R、S40Q、Q44A、R70H、D75N、F87L、F94L、V125A、E157G、K160R-I--CrelY33H、F54L、N86D、K100R、L104M、V105A、N136S、K159R-1--CrelS32T、Y33H、Q44K、R68Y、R70S、177R、Q92R、K96R、K107R、I132VT143A-I--CrelS32A、Y33H、Q44A、R68Y、R70S、D75Y、I77K、I132V-I--CrelN2I、S32G、Y33H、Q44A、R68Y、R70S、D75Y、177K、K96R、V105A-1--CrelS32A、Y33H、F43L、Q44A、R68Y、R70S、D75Y、177K、V105A、K159R-]:--CreIG19S、,Q、Y33G、Q38C、R68N、:R70S、S72F、I:77R-I--CrelY33G、Q38C、R68N、R70S、177R、F87L-I--CrelN30Q、Y33G、Q38C、F54L、R68N、R70S、I77R-1--CrelN30Q、Q31L、Y33G、Q38C、R68N、R70S、177R、P83Q、F87L和—:[--CrelN3()Q、Y33G、Q38C、:R68N、R7()S、]:77R、V1()5A。本發(fā)明包括來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶，其與上文定義的序列具有至少85%的同一性，優(yōu)選至少90%的同一性，更優(yōu)選至少95%(96%、97%、98%、99%)的同一性，所述大范圍核酸酶與原始大范圍核酸酶(如上文定義的I-Crel或I-Crel變體)相比具有改進(jìn)12的切割活性。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生來(lái)自I-Crel的異二聚體大范圍核酸酶的方法，所述大范圍核酸酶基本不含由所述異二聚體大范圍核酸酶中每種單體結(jié)合所產(chǎn)生的兩種同二聚體的至少一種，所述方法包括在細(xì)胞中共表達(dá)來(lái)自I-Cre:[的異二聚體大范圍核酸酶的兩種單體，其中兩種單體之一包含G19S突變。根據(jù)所述方法的一個(gè)有利的實(shí)施方案，其他單體帶有破壞功能性同二聚體形成或有助于異二聚體形成的其他突變,從而產(chǎn)生基本不含同二聚體的異二聚體大范圍核酸酶。通過(guò)所述方法產(chǎn)生的來(lái)自I-Crel的異二聚體大范圍核酸酶更具特異性，因?yàn)閮蓚€(gè)單體結(jié)合所產(chǎn)生的兩種同二聚體中至少-一種是沒(méi)有功能的。另外，由于上文所述的G19突變的存在，所述大范圍核酸酶具有增強(qiáng)的切割活性。本發(fā)明還涉及可通過(guò)上文所述方法獲得的來(lái)自I-Crel的異二聚體大范圍核酸酶，所述核酸酶基本不含由所述異二聚體大范圍核酸酶中每種單體結(jié)合所產(chǎn)生的兩種同二聚體中的至少-種。本發(fā)明的主題還包括來(lái)自如上所述的大范圍核酸酶的單鏈嵌合大范圍核酸酶(融合蛋白)。所述單鏈大范圍核酸酶可包含兩個(gè)I-Crel單體、兩個(gè)I-Crel核心結(jié)構(gòu)域(:卜Cre]:的6到94位)或二者的組合。優(yōu)選地，兩個(gè)單體/核心結(jié)構(gòu)域或二者的組合通過(guò)肽連接子連接。肽連接子的例子是SEQIDNO:52和68。本發(fā)明的大范圍核酸酶包括如....匕文定義的改進(jìn)的大范圍核酸酶、異二聚體大范圍核酸酶和單鏈嵌合衍生物。本發(fā)明的大范圍核酸酶可包含上文定義的至少一個(gè)NLS和./或一個(gè)標(biāo)簽;所述NLS和/或標(biāo)簽可以在第一和/或第二單體中。本發(fā)明的主題還包括編碼如上所述的大范圍核酸酶的多核苷酸片段；所述多核苷酸可編碼同二聚體或異二聚體變體中的一個(gè)單體，或編碼單鏈衍生物的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域/單體。本發(fā)明的主題還包括用于表達(dá)本發(fā)明大范圍核酸酶的重組載體。所述重組載體包含至少--個(gè)上文所述編碼變體或單鏈大范圍核酸酶的多核苷酸片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體包含兩個(gè)不同的多核苷酸片段，每個(gè)片段各編碼異二聚體變體的單體之一?？稍诒景l(fā)明中使用的載體包括但不限于病毒載體、質(zhì)粒、RNA載體,或者可由染色體、非染色體、半合成或合成的核酸所組成的線性或環(huán)形DNA或RNA分子。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制與之連接的核酸的載體(附加型載體)和/或表達(dá)與之連接的核酸的載體(表達(dá)載體)。大量的合適載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可以商品獲得。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、細(xì)小病毒(parvovirus)(例如腺相關(guān)病毒)、冠狀病毒、負(fù)鏈RNA病毒如正粘病毒(orthomyxovirus)(例如流感病毒)、桿狀病毒(例如狂犬病毒和皰疹性口腔炎病毒(vesicularstomatitisvirus))、副粘病毒(paramyxovirus)(例如麻疹病毒和仙臺(tái)病毒(Sendai))、正鏈RNA病毒如小RNA病毒(picornavirus)和a病毒，以及雙鏈DNA病毒，其包括腺病毒、皰疹病毒(例如1和2型單純皰疹病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒)和痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒和金絲雀痘病毒)。其他病毒包括例如諾瓦克病毒、披膜病毒(togavirus)、黃病毒(flavivirus)、呼腸孤病毒(reoviruses)、乳多空病毒(papovavirus)、嗜月干DNA病毒(hepadnavirus)禾口月干炎病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例包括禽白血病_肉瘤、哺乳動(dòng)物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV組、慢病毒、泡沫病毒(spumavirus)(Coffin,J.M.，Ret.roviridae:Thevirusesandtheirreplication,InFundamentalVirology,第三版，B.N.Fields,等編輯，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia,1996)。優(yōu)選的載體包括慢病毒載體，尤其是自失活(selfinactivacting)的慢病毒載體。載體可包含選擇標(biāo)記，例如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、組氨醇脫氫酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、單純皰疹病毒胸苷激酶、腺苷脫氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶；用于釀酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1;大腸桿菌(E.coli)中的四環(huán)素、利福平或氨芐青霉素抗性。優(yōu)選地，所述載體是表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明變體/單鏈衍生物的序列置于適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的控制下，以允許產(chǎn)生或合成所述大范圍核酸酶。因此，所述多核苷酸包含在表達(dá)盒中。更具體地,載體包含復(fù)制起點(diǎn)、與所述編碼多核苷酸有效連接的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)(使用基因組DNA時(shí))、多腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。其還可包含增強(qiáng)子。啟動(dòng)子的選擇將取決于多肽在其中表達(dá)的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述變體是異二聚體，編碼各個(gè)單體的兩多核苷酸包含在一個(gè)載體中，所述載體能夠驅(qū)動(dòng)兩多核苷酸同時(shí)表達(dá)。合適的啟動(dòng)子包括組織特異性和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子是由提高的重金屬水平誘導(dǎo)的真核金屬硫蛋白(metallothionine)啟動(dòng)子，應(yīng)答于異丙基-13-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的原核lacZ啟動(dòng)子，和由提高的溫度誘導(dǎo)的真核熱休克啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例是骨骼肌肌酸激酶、前列腺特異性抗原(PSA)、a-抗胰蛋白酶、人表面活性劑(SP)A和B蛋白、|3-酪蛋白和酸性乳清蛋白基因。根據(jù)所述載體的另一有利的實(shí)施方案，其包含靶向構(gòu)建體，所述靶向DNA構(gòu)建體包含與如上述基因組DNA靶切割位點(diǎn)周圍的區(qū)域具有同源性的序列?；蛘撸幋a大范圍核酸酶的載體和包含靶向DNA構(gòu)建體的載體是不同的載體。更優(yōu)選地，靶向DNA構(gòu)建體包含a)與如上述基因組DNA切割位點(diǎn)周圍的區(qū)域具有同源性的序列，禾口b)側(cè)翼是a)中序列的待引入序列。優(yōu)選使用至少50bp、優(yōu)選多于10()bp、更優(yōu)選多于2()()bp的同源序列。事實(shí)上，共有的DNA同源性位于斷裂位點(diǎn)上游和下游的側(cè)翼區(qū)域中，且待引入的DNA序列應(yīng)位于兩臂之間。對(duì)基因組治療的目的而言，待引入的序列優(yōu)選是修復(fù)目的基因中突變的序列(基因矯正或功能基因的恢復(fù))。或者,其可以是用于以某種特定方式改變?nèi)旧wDNA的任何其他序列，包括用于修飾特異序列、用于減弱或激活目的內(nèi)源基因、用于失活或缺失目的內(nèi)源基因或其部分、用于向目的位點(diǎn)中引入突變或用于引入外源基因或其部分的序列。本發(fā)明還涉及通過(guò)上文所述的多核苷酸或載體(優(yōu)選表達(dá)載體)修飾的原核或真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物，其特征是其所有或部分細(xì)胞通過(guò)上文所述的多核苷酸或載體進(jìn)行了修飾。本文使用的"細(xì)胞"是指原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞，或真核細(xì)胞如動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞。本發(fā)明的主題還包括上文所述可通過(guò)上文所述方法獲得的具有19位突變的經(jīng)改進(jìn)的大范圍核酸酶、一種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在與人P-2-微球蛋白和人XPC基因不同的基因座中用于分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外基因工程、以及體內(nèi)或體外基因組工程中的非治療目的的用途。本發(fā)明的主題還包括上文所述可通過(guò)上文所述方法獲得的具有54或105位突變的經(jīng)改進(jìn)的大范圍核酸酶、一種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在與中國(guó)倉(cāng)鼠次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和人2-微球蛋白基因不同的基因座中用于分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外基因工程、以及體內(nèi)或體外基因組工程中的非治療目的的用途。本發(fā)明的主題還包括上文所述可通過(guò)上文所述方法獲得的具有87位突變的經(jīng)改進(jìn)的大范圍核酸酶、一種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在與人e-2微球蛋白基因、人RAG2基因和人XPC基因不同的基因座中用于分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外基因工程、以及體內(nèi)或體外基因組工程中的非治療目的的用途。本發(fā)明的主題還包括上文所述可通過(guò)上文所述方法獲得的具有132位突變的經(jīng)改進(jìn)的大范圍核酸酶、一種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在與中國(guó)倉(cāng)鼠次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因、人MG2基因和人P-2-微球蛋白基因不同的基因座中用于分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外基因工程、以及體內(nèi)或體外基因組工程中的非治療目的的用途。本發(fā)明的主題還包括上文所述可通過(guò)上文所述方法獲得的具有79位突變的經(jīng)改進(jìn)的大范圍核酸酶、-種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物用于分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外基因工程、以及體內(nèi)或體外基因組工程中的非治療目的的用途。本發(fā)明的主題還包括上文所述可通過(guò)上文所述方法獲得的具有G19S突變的異二聚體大范圍核酸酶、一種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物、非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物用于分子生物學(xué)、體內(nèi)或體外基因工程、以及體內(nèi)或體外基因組工程中的非治療目的的用途。非治療目的包括例如(i)用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的包裝細(xì)胞系中特異性基因座的基因打靶；(ii)用于植株改善和代謝工程的谷類植物中特異性基因座的基因打靶；(iii)用于除去基因修飾谷類植物中標(biāo)志物的靶向重組，(iv)用于除去基因修飾微生物菌株中標(biāo)志物的靶向重組(例如用于抗生素生產(chǎn))。根據(jù)所述用途的一個(gè)有利的實(shí)施方案，其用于誘導(dǎo)含有I)NA靶序列之目的位點(diǎn)中的雙鏈斷裂，從而誘導(dǎo)DNA重組事件、DNA丟失或細(xì)胞死亡。根據(jù)本發(fā)明，所述雙鏈斷裂是用于修復(fù)特定序列、修飾特定序列、恢復(fù)功能性基因而替換突變基因，弱化或活化內(nèi)源目的基因、將突變引入到目的位點(diǎn)中、引入外源基因或其部分、失活或消滅內(nèi)源基因或其部分、使染色體臂易位或者使:[)NA不被修復(fù)并降解。本發(fā)明的主題還涉及基因工程方法,其特征在于包括以下步驟使包含上文所定義之DNA靶標(biāo)的載體上目的位點(diǎn)中的雙鏈核酸斷裂，所述斷裂通過(guò)使所述載體與上文所定義的大范圍核酸酶相接觸而實(shí)現(xiàn),從而誘導(dǎo)與另一載體進(jìn)行同源重組，所另一載體與所述大范圍核酸酶的切割位點(diǎn)周圍的序列有同源性。本發(fā)明的主題還涉及基因組工程方法，其特征在于包括以下歩驟1)使基因座處發(fā)生雙鏈斷裂,所述斷裂通過(guò)使雜交DM靶標(biāo)與所述大范圍核酸酶相接觸而實(shí)現(xiàn),其中所述基因座含有上文所定義的大范圍核酸酶的至少一種DNA靶標(biāo)；2)將所述斷裂的基因組基因座維持在適于與靶向DNA構(gòu)建體進(jìn)行同源重組的條件下，所述構(gòu)建體包含待引入到所述基因座中的序列，其兩側(cè)是與所靶向基因座有同源性的序列。本發(fā)明的主題還涉及基因組工程方法,其特征在于包括以下步驟1)使基因座處發(fā)生雙鏈斷裂，所述斷裂通過(guò)使切割位點(diǎn)與上文所定義的所述大范圍核酸酶相接觸而實(shí)現(xiàn),其中所述基因座含有上文所定義的大范圍核酸酶的至少-種DNA靶標(biāo)；2)將所述斷裂的基因組基因座維持在適于與和所述切割位點(diǎn)周圍區(qū)域有同源性的染色體DNA進(jìn)行同源重組的條件下。本發(fā)明的主題還包括上文所定義的至少一種大范圍核酸酶、或一種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)在制備用于在有此需求的個(gè)體中預(yù)防、改善或治療遺傳性疾病的藥物中的用途，所述藥物可以任意方式施用給所述個(gè)體。本發(fā)明的主題還包括在有此需求的個(gè)體中預(yù)防、改善或治療遺傳性疾病的方法，所述方法包括以下步驟以任意方式將包含上文所定義的至少一種大范圍核酸酶的組合物施用給所述個(gè)體。在該情況下，如上文所定義的大范圍核酸酶的使用至少包括以下步驟(a)在個(gè)體的體細(xì)胞組織中，在包含所述大范圍核酸酶的至少一個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)的基因之目的位點(diǎn)處誘導(dǎo)雙鏈切割，和(b)向該個(gè)體中引入耙向DNA，其中所述耙向DM包含(1)與切割位點(diǎn)周圍區(qū)域有同源性的DNA，和(2)在該靶向DNA與染色體DNA之間發(fā)生重組時(shí)修復(fù)目的位點(diǎn)的DNA。在適于將耙向DNA引入目的位點(diǎn)的條件F將耙向DNA引入所述個(gè)體。根據(jù)本發(fā)明，所述雙鏈切割通過(guò)對(duì)個(gè)體施用所述大范圍核酸酶而整體(intoto)誘導(dǎo)，或者通過(guò)將所述大范圍核酸酶引入到取自個(gè)體的體細(xì)胞內(nèi)并在修飾后放回所述個(gè)體內(nèi)而進(jìn)行離體誘導(dǎo)。在所述用途的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述大范圍核酸酶與靶向DNA構(gòu)建體組合，所述靶向DNA構(gòu)建體包含修復(fù)基因中突變的序列，其兩側(cè)是與所述大范圍核酸酶的基因組DNA切割位點(diǎn)周圍的基因區(qū)域有同源性的序列，如上文所述。所述修復(fù)突變的序列是具有正確序列的基因片段或者是外顯子敲入構(gòu)建體。就矯正基因而言，基因的切割發(fā)生在突變附近，優(yōu)選在突變的500bp范圍內(nèi)。靶向構(gòu)建體包含基因片段，其含有基因組DM切割位點(diǎn)兩側(cè)至少200bp的同源序列(最小修復(fù)基質(zhì))用于修復(fù)切割，并含有用于修復(fù)突變的正確基因序列。因此,用于基因矯正的靶向構(gòu)建體包含最小修復(fù)基質(zhì)或由其組成；其優(yōu)選為200pb到6000pb，更優(yōu)選為lOOOpb到2000pb。為了恢復(fù)功能基因,基因的切割發(fā)生在突變的上游。優(yōu)選所述突變是該基因序列中第一個(gè)已知的突變,從而該基因中所有下游突變都可同時(shí)被矯正。所述靶向構(gòu)建體包含基因組DNA切割位點(diǎn)下游的外顯子，它們?cè)诳騼?nèi)融合(如同在cDNA中--樣)，并在3'端具有多聚腺苷酸化位點(diǎn)以終止轉(zhuǎn)錄。待引入序列(外顯子敲入構(gòu)建體)的兩側(cè)是切割位點(diǎn)周圍的內(nèi)含子或外顯子序列，從而允許所改造基因(外顯子敲入基因)轉(zhuǎn)錄成為能編碼功能性蛋白質(zhì)的mRNA。例如，外顯子敲入構(gòu)建體的兩側(cè)是上游和下游的序列。本發(fā)明的主題還包括上文所定義的至少一種大范圍核酸酶、或一種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)在制備用于在有此需求的個(gè)體中預(yù)防、改善或治療由具有DNA中間體的傳染原引起的疾病的藥物中的用途，所述藥物通過(guò)任意方式施用給所述個(gè)體。本發(fā)明的主題還包括在有此需求的個(gè)體中預(yù)防、改善或治療由具有DNA中間體的傳染原引起的疾病的方法,所述方法至少包括以下步驟通過(guò)任意方式將上文所定義的組合物施用給所述個(gè)體。本發(fā)明的主題還包括上文所定義的至少一種大范圍核酸酶、或--種或兩種多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)在體外用于抑制傳染原的傳播、滅活或消除傳染原的用途，或者用于物品消毒的用途,其中所述傳染原具有DNA中間體,存在于生物來(lái)源產(chǎn)品或旨在用于生物用途的產(chǎn)品中。本發(fā)明的主題還包括組合物，其特征在于至少包含-種大范圍核酸酶、一種或兩種衍生的多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)，如上文所述。在所述組合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，其包含靶向DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含修復(fù)目的位點(diǎn)的序列，其兩側(cè)是與如上所述的靶標(biāo)基因座有同源性的序列。優(yōu)選地，所述靶向DNA構(gòu)建體被包含在重組載體中或被包含在表達(dá)載體中，所述載體包含編碼所述大范圍核酸酶的多核苷酸，如本發(fā)明中所定義。本發(fā)明的主題還包括給產(chǎn)品或材料消毒以除去其中具有DNA中間體之傳染原的方法，所述方法至少包括以下步驟將生物來(lái)源產(chǎn)品、旨在用于生物用途的產(chǎn)品或物品與上文所定義的組合物接觸一定時(shí)間，所述時(shí)間足以抑制所述傳染原的傳播、滅活或消除所述傳染原。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述傳染原是病毒。例如，所述病毒是腺病毒(Adll，Ad21)、皰疹病毒(H:SV;VZV;EBV;CMV;6、7或8型皰疹病毒)、嗜肝DNA病毒(H:BV)、乳多空病毒(HPV)、痘病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒(HTLV、HIV)。本發(fā)明的主題還包括產(chǎn)品，其至少含有大范圍核酸酶或者編碼所述大范圍核酸酶的一種或兩種表達(dá)載體，以及上述包含靶向構(gòu)建體的載體,所述產(chǎn)品作為組合制劑同時(shí)、分別或依次使用，用于預(yù)防或治療遺傳性疾病。對(duì)治療的目的而言，以治療有效量施用所述大范圍核酸酶和可藥用賦形劑。如果所施用的量是有生理意義的，則這樣的組合被稱作以"治療有效量"施用。如果一種藥劑的存在導(dǎo)致接受者生理狀況可檢測(cè)的變化,則它是有生理意義的。在本文中，如果一種藥劑的存在導(dǎo)致目標(biāo)疾病的一個(gè)或多個(gè)癥狀的嚴(yán)重程度減輕以及對(duì)損傷或異常的基因組矯正，則它是有生理意義的。在本發(fā)明用途的一個(gè)實(shí)施方案中，所述大范圍核酸酶基本上是非免疫原性的，即不引發(fā)或幾乎不引發(fā)不利的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，可使用大量改善或消除這類有害免疫反應(yīng)的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大范圍核酸酶基本不含N-甲?；琢虬彼?。避免不想要的免疫反應(yīng)的另一種方法是將大范圍核酸酶與聚乙二醇(〃PEG")或聚丙二醇(〃PPG")(優(yōu)選500到20，000道爾頓的平均分子量(MW))綴合。與PEG或17PPG的綴合(如Davis等(US4，179，337)所述)例如可提供具有抗病毒活性的非免疫原性生理活性水溶性內(nèi)切核酸酶綴合物。Saifer等(US5，006，333)中還描述了使用聚乙二醇聚丙二醇共聚物的類似方法。大范圍核酸酶可作為多肽或者作為編碼所述多肽的多核苷酸構(gòu)建體/載體使用。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任何適用于特定細(xì)胞類型的便利手段而在體外、離體或在體內(nèi)將其(單獨(dú)或者與至少一種合適的載體或運(yùn)載體組合和/或與靶向DNA組合)引入細(xì)胞中。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，所述大范圍核酸酶和包含靶標(biāo)DM和/或編碼大范圍核酸酶之核酸的載體(如果存在的話)被細(xì)胞從胞質(zhì)輸入或轉(zhuǎn)移至核內(nèi)的作用位點(diǎn)。大范圍核酸酶(多肽)可有利地與下述物質(zhì)結(jié)合脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺(PEI)、和/或膜易位肽(Bonett.a，TheScientist,2002，16，38;Ford等，GeneTher.，2001，8，卜4;Wadia和Dowdy，Curr.Opin.Biotechnol.，2002，13,52-56);在后一種情況下，所述大范圍核酸酶的序列與膜易位肽的序列融合(融合蛋白)。可通過(guò)大量方法(例如注射、直接攝入、射彈轟擊、脂質(zhì)體、電穿孔)將包含靶標(biāo)DNA和/或編碼大范圍核酸酶之核酸的載體引入細(xì)胞中。可使用表達(dá)載體在細(xì)胞中穩(wěn)定或瞬時(shí)地表達(dá)大范圍核酸酶。在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(見(jiàn)CurrentProtocolsinHumanGenetics:第12章"VectorsForGeneTherapy"&第13章"DeliverySystemsforGeneTherapy")。任選地，可優(yōu)選在重組蛋白中摻入核定位信號(hào)以確保其在核內(nèi)表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)改造能夠切割目的基因組DNA耙序列之變體的方法來(lái)獲得來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶(原始大范圍核酸酶),如之前Smith等Nuc:[eicAcidsRes.，2006，34el49中所述，所述方法至少包括以下步驟(a)構(gòu)建第一系列I-Crel變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第一功能性亞結(jié)構(gòu)域中含有至少一個(gè)替換，所述第一功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-Crel的26到40位，(b)構(gòu)建第二系列I-Cre]:變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第二功能性亞結(jié)構(gòu)域中具有至少一個(gè)替換，所述第二功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-Crel的44到77位，(c)從步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點(diǎn)的變體，在所述位點(diǎn)中(i)I-Crel位點(diǎn)中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體己被存在于所述基因組耙標(biāo)中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體所替換,且(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)的-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換，(d)從步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點(diǎn)的變體，在所述位點(diǎn)中(i)ICreI位點(diǎn)中5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組耙標(biāo)中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)中_5到-3位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換，(e)從步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I_CreI位點(diǎn)的變體，在所述位點(diǎn)中(i)I-Crel位點(diǎn)中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體己被存在于所述基因組耙標(biāo)中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體所替換,且(ii)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換，(f)從步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點(diǎn)的變體，在所述位點(diǎn)中(i)I-Crel位點(diǎn)中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組耙18標(biāo)中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換，(g)將來(lái)自步驟(c)和步驟(d)的兩個(gè)變體中26到40位及44到77位中的突變?cè)趩蝹€(gè)變體中組合，以獲得切割下述序列的新的同二聚體I-Crel變體，所述序列中(i)-l()到_8位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)中5到-3位的核苷酸三聯(lián)體相同，(iv)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)中_5到-3位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(h)將來(lái)自步驟(e)和步驟(f)的兩個(gè)變體中26到40位及44到77位中的突變?cè)趩蝹€(gè)變體中組合，以獲得切割下述序列的新的同二聚體I-Crel變體,所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體相同，(ii)-5到_3位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)該I-Crel位點(diǎn)中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體所替換,和(iv)10到-8位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(i)將步驟(g)與步驟(h)中獲得的變體相組合以形成異二聚體，以及(j)選擇和/或篩選來(lái)自步驟(i)的能夠切割所述基因組DNA耙標(biāo)的異二聚體。步驟(a)和(b)可包括引入其它突變以提高突變體的結(jié)合和/或切割性能,尤其是在與DNA靶序列接觸或者與所述DNA靶標(biāo)直接或間接相互作用的其它位置上。這些步驟可通過(guò)制備組合文庫(kù)來(lái)實(shí)施，如PCT國(guó)際申請(qǐng)WO2004/067736和Arnould等(J.Mol.Biol.，2006，355，443-458)中所述。可通過(guò)使用體外或體內(nèi)切割測(cè)定來(lái)進(jìn)行步驟(c)、(d)、(e)、(f)和/或(j)中的選擇和/或篩選，如PCT國(guó)際申請(qǐng)W()2()04/()67736、Epinat等(NucleicAcidsRes.，2003，31,2952-2962)、Chames等(NucleicAcidsRes.，2005,33，e178)和Arnould等(J.Mol.Biol.，2006,355,443-458)中所述。優(yōu)選地,通過(guò)重組介導(dǎo)的所述DNA雙鏈斷裂的修復(fù)在下述條件下在體內(nèi)進(jìn)行步驟(c)、(d)、(e)、(f)和/或(j)，在所述條件下，由所述變體產(chǎn)生的突變DNA靶序列中的雙鏈斷裂導(dǎo)致陽(yáng)性選擇標(biāo)志物或報(bào)告基因的激活或者陰性選擇標(biāo)志物或報(bào)告基因的失活，如在PCT國(guó)際申請(qǐng)W02004/067736、Epinat.等(NucleicAcidsRes.，2003，31，2952-2962)、Chames等(NucleicAcidsRes.,2005,33,e178)和Arnould等(J.Mol.Biol.，2006,355，443-458)中所述。可根據(jù)公知的重疊PCR技術(shù)，通過(guò)擴(kuò)增包含兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域中之每一個(gè)的重疊片段來(lái)進(jìn)行歩驟(g)和(h)中的(分子內(nèi))突變組合。通過(guò)定向誘變?cè)诓襟E(g)或步驟(h)的組合變體上引入上文定義的19、54、79、105和/或132位上的突變。步驟(i)中的(分子內(nèi))變體組合是通過(guò)共表達(dá)步驟(g)的-一種變體和步驟(h)的一種變體從而允許形成異二聚體來(lái)進(jìn)行的。例如，可通過(guò)編碼所述變體的一種或兩種重組表達(dá)載體修飾宿主細(xì)胞。然后在允許表達(dá)所述變體的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，從而在所述19宿主細(xì)胞中形成異二聚體，如先前在PCT國(guó)際申請(qǐng)W02006/097854和Arnould等(J.Mol.Biol.，2006,355,443-458)中所述的?；蛘?，可通過(guò)由源自上述改造大范圍核酸酶變體之方法的方法引入下述修飾來(lái)獲得本發(fā)明的異二聚體大范圍核酸酶-在以下兩種類型的原始骨架蛋白(scaffoldprotein)上進(jìn)行步驟(a)和步驟(b):具有G19S突變的第一I-Crel骨架(單體A)和不具有G19S突變的第二I-Crel骨架(單體B);所述第二骨架可具有如上文所述破壞功能性同二聚體形成的其他突變，以及-通過(guò)以下步驟進(jìn)行步驟(c)-(f)的選擇和/或篩選將上文所述的單體A或B的變體文庫(kù)轉(zhuǎn)化到表達(dá)含有相應(yīng)突變(分別來(lái)自單體B或A)的I-Crel突變體的宿主細(xì)胞中，以允許形成異二聚體，利用其中I-Crel位點(diǎn)的一半在±3至5位或±8至10位被修飾而另一半未被修飾的非回文DM靶標(biāo)選擇功能性異二聚體變體。通過(guò)將來(lái)自相同單體(A)或(B)的兩種變體的突變組合在一個(gè)單體中來(lái)進(jìn)行步驟(g)和(h)。通過(guò)將步驟(g)中所得的來(lái)自單體(A或B)之一的變體與步驟(h)中所得的來(lái)自另一個(gè)單體的變體相組合來(lái)進(jìn)行步驟(i)。本發(fā)明的大范圍核酸酶的用途以及使用所述大范圍核酸酶的方法還包括上述使用編碼所述大范圍核酸酶的多核苷酸、載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的用途和方法的另一有利的實(shí)施方案，所述大范圍核酸酶、多核苷酸、載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物與上述靶向DNA構(gòu)建體聯(lián)合。優(yōu)選地，所述編碼大范圍核酸酶單體的載體包含如上所述的靶向DNA構(gòu)建體。編碼本發(fā)明所述來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶的兩個(gè)單體的多核苷酸序列可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備。例如，通過(guò)使用特定引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從cDNA模板擴(kuò)增它們。優(yōu)選將所述cDNA的密碼子選擇成有助于所述蛋白質(zhì)在期望的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。能夠切割來(lái)自目的基因組序列的DNA靶標(biāo)的來(lái)自I-Crel的單鏈大范圍核酸酶通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法制備(Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003，31，2952-62;Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10,895-905;Steuer等，Chembiochem.,2004，5，206-13;國(guó)際PCT申請(qǐng)WO()3六)78619和W02()04六)31346)。任何這些方法都可用于構(gòu)建本發(fā)明所述單鏈大范圍核酸酶?？赏ㄟ^(guò)公知的重組DNA和基因工程技術(shù)獲得包含所述多核苷酸的重組載體并將其引入宿主細(xì)胞中?？扇缦律a(chǎn)本發(fā)明所述來(lái)自:卜Cre:l:的大范圍核酸酶在適合單體共表達(dá)的條件下，在通過(guò)一種或兩種表達(dá)載體修飾的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/植物或宿主細(xì)胞中共表達(dá)上文所述的兩個(gè)I-Crel單體，并通過(guò)任何適當(dāng)?shù)氖侄螐乃拗骷?xì)胞培養(yǎng)物或從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/植物中回收異二聚體大范圍核酸酶。本發(fā)明所述的單鏈大范圍核酸酶是通過(guò)在適于融合蛋白表達(dá)的條件下，在利用一種表達(dá)載體修飾的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/植物或宿主細(xì)胞中，融合含有上文所述的兩種單體的融合蛋白來(lái)制得的，并通過(guò)任何合適的方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/植物中回收所述單鏈大范圍核酸酶。20本發(fā)明的主題還包括上文所述的至少--種可通過(guò)上文所述方法獲得的來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶作為用于制備其它大范圍核酸酶的骨架的用途。例如，為了制備新的另一代歸巢內(nèi)切核酸酶,可在所述單體上進(jìn)行另一輪誘變和選擇/篩選。除非另有說(shuō)明，否則本發(fā)明的實(shí)施將使用本領(lǐng)域內(nèi)的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡解釋。參閱，例如CurrentProt.ocolsinMolecularBiology(FrederickM.AUSUBEL，2000，Wiley禾卩sonInc，LibraryofCongress,USA);MolecularCloning:ALaboratoryMa皿al，第三版，(Sarabrook等，2001，ColdSpringHarbor,NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress)^OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編輯，1984);Mullis等美國(guó)專利號(hào)4，683，195;NucleicAcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins編輯1984);TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins編輯1984);CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，Alan:R.Liss，Inc.，1987);I:mmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986);B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984);theseries,MethodsInENZYM0L0GY(主編J.Abelson禾口M.Simon,AcademicPress,Inc.，NewYork),尤其是第154和155巻(Wu等編輯)以及第185巻，〃GeneExpressionTechnology〃(D.Goeddel編車茸)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller禾卩M.P.Calos編車lj;，1987，ColdSpringHarborLaboratory);ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer禾口Walker編輯，AcademicPress,London,1987);IIandbookOfExperimentalImmunology,第I-IV巻(D.M.Weir禾卩C.C.Blackwell編車骨.，1986);以及ManipulatingtheMouseErabryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1986)。除了上述特征以外，本發(fā)明還包括在以F內(nèi)容中顯現(xiàn)的其他特征，所述內(nèi)容涉及說(shuō)明本發(fā)明的用于增強(qiáng)來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶切割活性的方法的實(shí)施例及附圖，在附圖中-圖1表示來(lái)自LAGLIDADG家族的歸巢內(nèi)切核酸酶的結(jié)構(gòu)和用于改造它們的組合方法。A.與其DNA靶標(biāo)結(jié)合的I-Crel歸巢內(nèi)切核酸酶的三維結(jié)構(gòu)。催化核心被兩個(gè)a"a"a折疊包圍，所述折疊在DM大溝上形成鞍形相互作用界面。B.改造I-Crel和其他LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶之特異性的兩步式方法。通過(guò)原始骨架的半推理誘變并篩選具有局部改變的特異性的功能性變體，產(chǎn)生新內(nèi)切核酸酶的大集合。然后使用組合方法將這些突變體裝配成具有完全重新設(shè)計(jì)的特異性的大范圍核酸酶。通過(guò)在同一a"a"a折疊內(nèi)組合兩組突變來(lái)產(chǎn)生同二聚體蛋白質(zhì)("半-大范圍核酸酶")，共表達(dá)兩種這樣的"半_大范圍核酸酶"能夠產(chǎn)生切割目的靶標(biāo)的異二聚體類型("定制大范圍核酸酶")。-圖2展示了Rosal靶序列及其衍生物。10GGG—P、5GAT—P和5TAT—P是發(fā)現(xiàn)被先前獲得的I-Cre]:突變體切割的密切衍生物。它們與G1221(被:卜Cre:l:骨架蛋白質(zhì)切割的回文序列)的區(qū)別在于帶框的基序。C1221、10GGG_P、5GAT_P和5TAT—P首先被描述為24bp序列，但是結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)提示，只有22bp與蛋白質(zhì)/DNA相互作用相關(guān)。然而，仍在括號(hào)中標(biāo)出了±12位。rosal是位于小鼠R0SA26基因座8304位的DNA序列。在rosal.2靶標(biāo)中，靶標(biāo)中部的GTTC序列被替換為存在于C1221中的堿基GTAC。rosal.3是來(lái)自rosal.2左側(cè)部分的回文序列，rosal.4是來(lái)自rosal.2右側(cè)部分的回文序列。如圖中所示，來(lái)自10GGG—P、5GAT—P和5TAT—P的加框基序存在于耙標(biāo)的rosal系列中。-圖3展示了用于在酵母報(bào)告載體中g(shù)ateway克隆I)NA耙標(biāo)的質(zhì)粒pCLS1055的圖譜。_圖4展示了用于大范圍核酸酶0RF克隆和在酵母中表達(dá)的LEU2標(biāo)記質(zhì)粒pCLS0542的圖譜。-圖5展示了I-Crel突變體對(duì)rosal.3DNA耙標(biāo)的切割。將首次篩選中找到的63個(gè)陽(yáng)性結(jié)果重排于一個(gè)96孔板中，并通過(guò)二次篩選(以一式四份的方式)驗(yàn)證。圈出了在實(shí)施例1中選擇的22個(gè)突變體。-圖6展示了I-Crel組合突變體對(duì)rosal.4靶標(biāo)的切割。將首次篩選中找到的69個(gè)陽(yáng)性結(jié)果重排于一個(gè)96孔板中，并通過(guò)二次篩選(以一式四份的方式)驗(yàn)證。圈出了在實(shí)施例2中選擇的15個(gè)突變體。-圖7展示了用于大范圍核酸酶克隆和在酵母中表達(dá)的KanR標(biāo)記質(zhì)粒pCLS1107的圖譜。-圖8展示了異二聚體I-Cre:l:組合突變體對(duì)rosal.2和rosal靶標(biāo)的切割。A.用r固l.2靶標(biāo)篩選I-Crel突變體組合的實(shí)例。B.用r固l靶標(biāo)篩選I-Crel突變體的相同組合。B5、B6、D5、D6、F5、F6、H5和H6:用pCLS1107空質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的、表達(dá)切割rosal.3之I-Crel突變體的酵母菌株。-圖9展示了對(duì)rosal靶標(biāo)的切割。將一系列切割rosal.4的I-CreI突變體隨機(jī)誘變并與切割rosal.3的突變體共表達(dá)。用rosal靶標(biāo)測(cè)試切割。在每個(gè)四點(diǎn)簇中，右側(cè)的兩個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于一式兩份的切割rosal的原始異二聚體之一，而左側(cè)的兩個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于與未突變的rosal.3切割酶共表達(dá)的相同經(jīng)突變的rosal.4切割酶(突變體m14,在表III和IV中描述)。圈出了顯示出改進(jìn)的rosal切割的兩個(gè)優(yōu)化突變體，對(duì)應(yīng)于ra13與M()j(Cl())或者m13與M0—2(E2)的共表達(dá)。M0_1和M0_2進(jìn)一步描述于表V中。-圖10展示了對(duì)rosal靶標(biāo)的切割。隨機(jī)誘變一系列切割rosal.3的I-Crel突變體，并與切割rosal.4的精細(xì)化突變體共表達(dá)。用rosal靶標(biāo)測(cè)試切割。圈出了顯示有效rosal切割的突變體。在濾膜中-B11對(duì)應(yīng)于異二聚體S19V24Y44R68S70N75V77/E28R33R38K40A44朋8Q70A105R107A151G153E158:-C9對(duì)應(yīng)于異二聚體S19V24Y44R68S70Q75I77/E28R33R38K40A44H68Q70A105R107A151G153E158;-C11和E8對(duì)應(yīng)于異二聚體V24Y44S68S70R75177A105/E28R33R38K40A44H68Q70A105R107A151G153E158，和-E6對(duì)應(yīng)于異二聚體V24Y44S68S70R75177G79/E28R33R38K40A44H68Q70A105R107A151G153E158。H10是陰性對(duì)照，Hll和H12是不同強(qiáng)度的陽(yáng)性對(duì)照。為了比較改進(jìn)切割r固l.3靶標(biāo)之突變體前后異二聚體針對(duì)rosal靶標(biāo)的活性在每個(gè)簇中，右側(cè)的兩個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于實(shí)施例4中所述異二聚體之一，左側(cè)的兩個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于具有額外突變的異二聚體，如實(shí)施例5中所述。-圖11展示了針對(duì)rosal.3回文靶標(biāo)篩選實(shí)施例5中顯示有效rosal切割的精細(xì)化突變體(圈出)作為酵母中同二聚體。在濾膜中-Bll對(duì)應(yīng)于ra()—1突變體(S19V24Y44R68S7()N75V77);C9對(duì)應(yīng)于m()—2突變體(S19V24Y44R68S70Q75177);Cll和E8對(duì)應(yīng)于m0—3突變體(V24Y44S68S70R75177A105)且E6對(duì)應(yīng)于m0_4突變體(V24Y44S68S70R75177G79)。H10是陰性對(duì)照，1111和IU2是不同強(qiáng)度的陽(yáng)性對(duì)照。在每個(gè)簇中，右側(cè)的兩個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于實(shí)施例6中所述針對(duì)rosal.3靶標(biāo)篩選的同二聚體之一，左側(cè)的兩個(gè)點(diǎn)是陰性對(duì)照或不同強(qiáng)度的陽(yáng)性對(duì)照。-圖12代表B2M系列的耙標(biāo)。10GAA_P、10CTG_P、5TAG_P和5TTT_P是發(fā)現(xiàn)被先前獲得的I-Crel突變體切割的密切衍生物。它們與G1221(被I-Crel骨架蛋白質(zhì)切割的回文序列)的區(qū)別在于帶框的基序。C1221、10GAA—P、10CTG—P、5TAG—P和5TTT—P首先被描述為24bp序列，但是結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)說(shuō)明只有22bp與蛋白質(zhì)/DNA相互作用相關(guān)。然而，仍在括號(hào)中標(biāo)出了±12位。B2M11.2和B2M11.3是通過(guò)-一半靶標(biāo)的鏡像重復(fù)而從B2M11靶標(biāo)獲得的兩個(gè)回文序列。如果我們認(rèn)為B2M11.2和B2M11.3靶標(biāo)中±11、±7和±6位上的核苷酸對(duì)切割沒(méi)有影響，則進(jìn)而可以認(rèn)為這兩個(gè)靶標(biāo)是發(fā)現(xiàn)被I-Crel靶標(biāo)切割的IONNN和5NNN靶標(biāo)的組合。將所有靶標(biāo)C1221革巴標(biāo)(被:卜Cre:l:切割的回文序列)進(jìn)行比對(duì)。-圖13展示了組合突變體對(duì)B2M11.2靶標(biāo)的切割。該圖展示了用B2M11.2靶標(biāo)首次篩選I-Crel組合突變體的一個(gè)例子。在第一層頂部濾膜中，B3位置(圈出)上陽(yáng)性突變體的序列是KNAHQS/AYSYK(與表VI11的命名相同)。在第二層濾膜(底部)中，F(xiàn)7位置上的陽(yáng)性突變體的序列是KNGHQS/AYSYK。在兩圖中，HI2均對(duì)應(yīng)于弱陽(yáng)性對(duì)照(c)。-圖14展示了優(yōu)化的突變體對(duì)B2M11.2靶標(biāo)的切割。從兩個(gè)突變體KNAHQS,ZAYSYK和KNGHQS/AYSYK的隨機(jī)誘變獲得切割B2M11.2的一系列I-CrelN75優(yōu)化的突變體。用B2M11.2靶標(biāo)測(cè)試切割。圈出切割B2M11.2的突變體，例如B3對(duì)應(yīng)于32A33:H44A68Y7()S75Y77K/2Y53R66C(與表IX的命名相同)。H12是陽(yáng)性對(duì)照。-圖15展示了組合突變體對(duì)B2M11.3靶標(biāo)的切割。該圖展示了用B2M11.3靶標(biāo)首次篩選I-Crel組合突變體的例子。HIO、Hll和H12分別是陰性對(duì)照(CI)和兩個(gè)不同強(qiáng)度的陽(yáng)性對(duì)照(C2和C3)。在濾膜中，G5位置(圈出)上陽(yáng)性突變體的序列是KQSGCS/QNSNR(與表X的命名法相同)。-圖16展示了異二聚體組合突變體對(duì)B2M11靶標(biāo)的切割。該圖展示了用B2M11靶標(biāo)篩選I-Crel突變體的組合。在第5列中圈出一系列陽(yáng)性異二聚體組合突變體。它們均對(duì)'應(yīng)于表XI中所列的32A33H44A68Y70S75Y77K132V/30Q33G38C68N70S75N77R異二聚體。-圖17展示了優(yōu)化的異二聚體組合突變體對(duì)B2M11靶標(biāo)的切割。將切割B2M11.3的一系列I-CrelN75優(yōu)化突變體與切割B2M11.2的突變體共表達(dá)。例如，G9對(duì)應(yīng)于30Q33G38C68N70S75N77R與32A33H44A68Y70S75Y77K2Y53R66C的異二聚體。用B2M11耙標(biāo)測(cè)試切割。在每個(gè)四點(diǎn)簇中將相同的異二聚體組合測(cè)試兩次(左側(cè)的兩個(gè)點(diǎn))，但是點(diǎn)(右上方)對(duì)應(yīng)于32A33:H44A68Y7()S75Y77K2Y53R66C/3()Q33G38C68N7()S75N77R對(duì)照(在對(duì)切割B2M11.3的大范圍核酸酶進(jìn)行隨機(jī)誘變之前)。來(lái)自每個(gè)簇的第四個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于陰性對(duì)照(無(wú)大范圍核酸酶)，或者對(duì)應(yīng)于強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照(I-Scel與I-Scel靶標(biāo))，或者對(duì)應(yīng)于中等強(qiáng)度陽(yáng)性對(duì)照(從改變了密碼子使用的ORF表達(dá)的I-Scel蛋白，在該測(cè)定法中其與ISceI靶標(biāo)產(chǎn)生更低的信號(hào))。_圖18展示了用于在gateway克隆后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)大范圍核酸酶的質(zhì)粒pCLS1069的圖譜。-圖19展示了用于在用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的報(bào)告載體中g(shù)ateway克隆DNA靶標(biāo)的質(zhì)粒pCLS1058。-圖20展示了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中報(bào)告系統(tǒng)的設(shè)計(jì)。起始密碼子下游132bp被I-Scel切割位點(diǎn)中斷的嘌呤霉素抗性基因處于EFIa啟動(dòng)子的控制下(1)。轉(zhuǎn)基因在CH0-Kl細(xì)胞中以單拷貝穩(wěn)定表達(dá)。為了在相同的染色體環(huán)境中引入大范圍核酸酶靶位點(diǎn)，修復(fù)基質(zhì)由以下組成i)無(wú)啟動(dòng)子的潮霉素抗性基因，ii)完整的lacZ表達(dá)盒和iii)兩條同源序列臂(1.lkb和2.3kb)。構(gòu)建了若千修復(fù)基質(zhì)，其差別僅在于中斷l(xiāng)acZ基因的識(shí)別位點(diǎn)(2)。因此，產(chǎn)生了非常相似的細(xì)胞系作為Al細(xì)胞系、ISceI細(xì)胞系和I-Crel細(xì)胞系。當(dāng)lacZ修復(fù)基質(zhì)(長(zhǎng)度2kb)與表達(dá)切割識(shí)別位點(diǎn)(3)的大范圍核酸酶的載體共轉(zhuǎn)染時(shí)，重建了功能性lacZ基因。可以從轉(zhuǎn)染后藍(lán)色菌落或灶點(diǎn)的數(shù)量推斷大范圍核酸酶誘導(dǎo)的重組水平。-圖21展示了用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)I-CrelN75的質(zhì)粒pCLS1088的圖譜。-圖22展示了切割HprCH3DNA耙標(biāo)序列的大范圍核酸酶的切割效率。在用修復(fù)基質(zhì)和不同量的大范圍核酸酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染含有:HprC:H3染色體報(bào)告系統(tǒng)的CH()細(xì)胞后，檢測(cè)LacZ基因的修復(fù)頻率，所述表達(dá)載體編碼原始的改造異二聚體(HprCH3.3/HprCH3.4)或其G19S衍生物(HprCH3.3/HprCh3.4G19S或HprCH3.3G19S/HprCh3.4)。-圖23展示了MG1.10系列耙標(biāo)。10GTT—P、10TGG—P、5CAG—P和5GAG—P是發(fā)現(xiàn)被先前獲得的Cre:[突變體切割的密切衍生物。它們與G1221(被I-Cre]:骨架蛋白質(zhì)切割的回文序列)的區(qū)別在于帶框的基序。C1221、10GT乙P、10TGG—P、5CAG—P和5GAG—P首先被描述為24bp序列，但是結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)說(shuō)明只有22bp與蛋白質(zhì)/DNA相互作用相關(guān)。然而，仍在括號(hào)中標(biāo)出了±12位。MG1.10.2和MG1.10.3是通過(guò)一半靶標(biāo)的鏡像重復(fù)而從MG1.10靶標(biāo)獲得的兩個(gè)回文序列。如果我們認(rèn)為RAG1.10.2和MG1.10.3靶標(biāo)中±11、±7和±6位上的核苷酸對(duì)切割沒(méi)有影響，則進(jìn)而可以認(rèn)為這兩個(gè)靶標(biāo)是發(fā)現(xiàn)被I-Crel靶標(biāo)切割的10NNN和5NNN耙標(biāo)的組合。將所有耙標(biāo)與I-Crel切割的回文序列C1221耙標(biāo)進(jìn)行比對(duì)。-圖24展示了在CIIO細(xì)胞中的染色體外測(cè)定法中，含有或不含有G19S突變的M2和M3I-Cre:[突變體對(duì)RAG1.10、RAG1.10.2和RAG1.10.3耙標(biāo)的切割。圖A中展示了對(duì)回文耙標(biāo)RAGl.10.2和RAG1.10.3的切割，而圖B中展示了異二聚體大范圍核酸酶對(duì)MG1.10的切割。將相同實(shí)驗(yàn)中I-Scel對(duì)I-Scel靶標(biāo)的切割作為陽(yáng)性對(duì)照展示。-圖25展示了在CHO細(xì)胞中的染色體外測(cè)定法中，監(jiān)測(cè)三種MG1.10異二聚體針對(duì)三種RAGl.l()耙標(biāo)的活性。背景對(duì)應(yīng)于用空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將相同實(shí)驗(yàn)中:卜Sce]:對(duì)S1234I-Scel靶標(biāo)的切割作為陽(yáng)性對(duì)照展示。-圖26展示了針對(duì)三種XPC耙標(biāo)(C1、C3和C4)，對(duì)三種XPC單鏈分子X(jué)2-L卜H33、SCX1和SCX2進(jìn)行酵母篩選。SCX1是X2(K7E)-L1-H33(E8K，G19S)分子，SCX2代表X2(E8K)-L1-:H33(K7E，G19S)分子。對(duì)每個(gè)四點(diǎn)酵母簇而言，左側(cè)兩個(gè)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而右側(cè)兩個(gè)點(diǎn)是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)品質(zhì)和有效性的多種內(nèi)對(duì)照。實(shí)施例1:產(chǎn)生切割rosal.3的大范圍核酸酶該實(shí)施例顯示，I-Crel突變體能夠切割來(lái)自rosal靶標(biāo)左側(cè)部分的回文形式24rosal.3DNA靶序列(圖2)。本實(shí)施例中描述的靶序列是22bp回文序列。因此，僅以前l(fā)l個(gè)核苷酸描述它們，隨后是后綴P。例如，耙標(biāo)rosal.3還被記為caacatgatgt—P;SEQIDNO:9。rosal.3耙標(biāo)在±1、±2、±3、±4、±5、±7、±9、±10和±11位與5GAT—P相似，兩條序列僅在±6和士8位不同。推測(cè)位置士6對(duì)結(jié)合和切割活性幾乎沒(méi)有影響。如Arnould等，JMolBiol.2006;355,443-458和國(guó)際PCT申請(qǐng)W02006/097784和W02006/097853中所述，先前通過(guò)在24、44、68、70、75和77位誘變I-CrelN75獲得了能夠切割5GAT—:P(caaaacgatgt—P;SEQIDNO:5)的突變體。在該實(shí)施例中，檢驗(yàn)了切割5GAT—P耙標(biāo)的突變體是否也能夠切割rosal.3靶標(biāo)。1)材料和方法國(guó)際PCT申請(qǐng)W02004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003,31，2952-2962;Ch(，es等，NucleicAcidsRes.，2005，33，el—78,禾口Arnould等，J.Mol.Biol.，2006,355,443-458中描述了在哺乳動(dòng)物或酵母細(xì)胞中產(chǎn)生大范圍核酸酶的方法和基于切割所誘導(dǎo)的重組的測(cè)定，其用于篩選具有改變的特異性的變體。這些測(cè)定產(chǎn)生可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測(cè)的功能性LacZ報(bào)告基因。a)構(gòu)建靶標(biāo)載體如下克隆靶標(biāo)側(cè)翼是gateway克隆序列的對(duì)應(yīng)于靶序列的寡核苷酸從Proligo定購(gòu)5'tggcatacaagtttcaacatgatgtacatcatgt.tgacaatcgtct.gtca3'(SEQIDNO:11)。使用Gateway方案(INVITR0GEN)，將通過(guò)PCR擴(kuò)增單鏈寡核苷酸而產(chǎn)生的雙鏈靶DM克隆進(jìn)酵母報(bào)告載體(pCLSl()55,圖3)中。將酵母報(bào)告載體轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母菌株FYBL2-7B(MATa，ura3A851，trplA63，leu2A1，lys2△202)中。b)I-Crel突變體如先前Arnould等，J.Mol.Biol.，2006,355,443-458以及國(guó)際PCT申請(qǐng)W02006/097784和WO2(K)6六)97853中所述，在突變了I-Crel:中24、44、68、70、75和77位的:文庫(kù)中鑒定切割5GA乙P的I-Crel突變體。將它們克隆進(jìn)DNA載體(pCLS0542，圖4)中，并在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株FYC2-6A(MATa，trplA63，leu2△1，his3△200)中表達(dá)。c)接合表達(dá)大范圍核酸酶的克降并在酵母中篩選:篩選如先前所述進(jìn)行(Arnould等，J.Mol.Biol.2006，355，443-458)。使用菌落網(wǎng)格(gridder)(QpixII，GENETIX)進(jìn)行接合。使用低網(wǎng)格密度(約4個(gè)點(diǎn)/cm2)將突變體在覆蓋YPD平板的尼龍濾膜上劃網(wǎng)格。在相同的濾膜上進(jìn)行第二次劃網(wǎng)格的過(guò)程從而印上第二層，所述第二層對(duì)每個(gè)靶標(biāo)而言由具有不同報(bào)告子的酵母菌株組成。將膜置于富含固體瓊脂YPD的培養(yǎng)基上，并在30。C孵育一夜，以允許接合。接著,將濾膜轉(zhuǎn)移至合成培養(yǎng)基上并在37t:孵育五天，以選擇帶有表達(dá)載體和靶標(biāo)載體的二倍體，所述合成培養(yǎng)基缺乏亮氨酸和色氨酸，并含有半乳糖(2%)作為碳源。5天后,將濾膜置于固體培養(yǎng)基上并在37。C孵育，以監(jiān)測(cè)13-半乳糖苷酶活性,所述固體培養(yǎng)基在0.5M磷酸鈉緩沖液pH:7.0中含有0.02%X-Ga1、0.1%SDS、6X二甲基甲酰胺(DMF)、7mMP_巰基乙醇、1%瓊脂糖。通過(guò)掃描分析結(jié)果，并使用合適的軟件進(jìn)行量化。d)突變體測(cè)序?yàn)榱嘶厥胀蛔凅w表達(dá)質(zhì)粒，使用標(biāo)準(zhǔn)方案提取酵母DNA并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。然后通過(guò)MILLEGENSA對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行突變體ORF的測(cè)序。或者，通過(guò)PCR從酵母DNA中擴(kuò)增ORF(Akada等，Biotechniques，2000,28，668-670，672，674)并通過(guò)MILLEGENSA直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。2)結(jié)果針對(duì)rosal.3DNA靶標(biāo)(caacatgatgt_P;SEQIDNO:9)的切割，篩選先前在文庫(kù)中鑒定的切割5GAT—P耙標(biāo)的I-Crel突變體，所述文庫(kù)中突變了I-Crel的24、44、68、70、75和77位。發(fā)現(xiàn)了總計(jì)63個(gè)陽(yáng)性克隆，將其重排于96孔板中并通過(guò)二次篩選驗(yàn)證(圖5)。在這些陽(yáng)性克隆中選擇了22個(gè)(在圖5中圈出)。對(duì)這22個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序。結(jié)果它們對(duì)應(yīng)于表I中描述的18種不同蛋白質(zhì)。表I:能切割rosal.3DNA耙標(biāo)的I-Crel突變體。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*mlO中的82T是預(yù)料外的突變，其可能是由于對(duì)酵母DNA測(cè)序之前的PCR反應(yīng)。實(shí)施例2:制造切割rosal.4的大范圍核酸酶該實(shí)施例顯示，I-Crel:突變體能夠切割來(lái)自rosal靶標(biāo)右側(cè)部分的回文形式rosal.4DNA靶序列(圖2)。本實(shí)施例中描述的所有靶序列是22bp回文序列。因此,僅以前11個(gè)核苷酸描述它們，隨后是后綴—P。例如，靶標(biāo)rosal.4還被記為tgggat.tatgt_P(SEQIDNO:10)。rosa14耙標(biāo)在±1、±2、±3、±4、±5禾B±7位與5TAT—P相似，并在±1、±2、±7、±8、±9和士10位與10GGG—P相似。推測(cè)±6和±11位對(duì)結(jié)合和切割活性幾乎沒(méi)有影響。如Arnould等，JMol.Biol.，2006;355,443-458以及國(guó)際PCT申請(qǐng)W02006/097784和W02006/097853中所述，先前通過(guò)在44、68、70位誘變I-CrelN75獲得了能夠切割5TAT—P的突變體。如Smith等，NucleicAcidsResearch,2006，34，e149和國(guó)際PCT申i青W02007/049156中所述，通過(guò)在28、30、33、38、40和70位上誘變I-CrelN75獲得了能夠切割10GGG—P耙標(biāo)的突變體。兩組蛋白質(zhì)均在70位上被突變。然而，推測(cè)存在兩個(gè)可分離的功能性亞結(jié)構(gòu)域。這意味著該位置對(duì)針對(duì)靶標(biāo)堿基±8到10的特異性幾乎沒(méi)有影響。因此，為了檢驗(yàn)組合突變體是否能夠切割rosal.4靶標(biāo)，將來(lái)自切割5TAT_P(caaaact.atgt_P;SEQIDNO:6)的蛋白質(zhì)44、68禾D70位的突變與來(lái)自切割10GGG—P(cgggacgtcgt—P;SEQIDNO:4)的蛋白質(zhì)的28、30、33、38和40突變相組合。1)材料和方法實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例1中所述和如下進(jìn)行構(gòu)建組合突變體在Smith等，NucleicAcidsRes.，2006，34，e149;國(guó)際PCT申請(qǐng)W02007/049156，和Arnould等，J.Mol.Bio:l..，2006，355，443-458;國(guó)際PCT申i青WO2006/097784和WO2006/097853中分別針對(duì)10GGG_P或5TAT_P耙標(biāo)鑒定了切割10GGG_P或5TAT_P的I-Crel突變體。為了產(chǎn)生含有來(lái)自兩個(gè)系列的突變的來(lái)自I-Crel的編碼序列，分別進(jìn)行擴(kuò)增I-Crel編碼序列5'端(1-43位aa)或3'端(39-167位)的重疊PCR反應(yīng)。對(duì)5'和3'兩端而言，使用對(duì)載體(pCLS0542，圖4)特異的引物GallOF5'-gcaact.ttagtgct.gacacatacagg-3，(SEQIDNO:12)或GallOR5，-acaaccttgattggagacttgacc-3'(SEQIDNO:13)以及對(duì)I-Crel編碼序列氨基酸39-43特異的引物assF5'-ctannnttgaccttt-3'(SEQIDNO:14)或assR5，-aaaggtcaa翻tag-3，(SEQIDNO:15)(其中翻編碼40位殘基)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。合并用相同引物從擴(kuò)增反應(yīng)獲得并且對(duì)40位殘基而言具有相同編碼序列的PCR片段。然后，將從使用引物GallOF和assR或者assF和GallOR的反應(yīng)獲得的每個(gè)PCR片段庫(kù)以等摩爾比混合。最后，使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Gietz,R.D.和:R.A.Woods,MethodsEnzyraol.2002,350,87-96)，使用通過(guò)Nco]:和Eag'I消化而線性化的75ng載體DNA(pCLS0542)和25ng兩種重疊PCR片段的每種最終庫(kù)，轉(zhuǎn)化酵母釀酒酵母菌株FYC2-6A(脆Ta，trplA63，leu2△1，his3△200)。通過(guò)酵母中的體內(nèi)同源重組產(chǎn)生同時(shí)含有兩組突變的完整編碼序列。2)結(jié)果通過(guò)在I-CrelN75骨架上結(jié)合44、68和70位的突變和28、30、33、38和40位的突變來(lái)構(gòu)建I-Crel組合突變體，得到復(fù)雜度2208的文庫(kù)。組合突變體的例子展示于表II中。將該文庫(kù)轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中，并針對(duì)對(duì)rosal.4DNA靶標(biāo)(tgggattatgt—P;SEQIDNO:10)的切割篩選了3456個(gè)克隆(復(fù)雜度的1.5倍)。發(fā)現(xiàn)了總計(jì)69個(gè)陽(yáng)性克隆，將其重排于96孔板中，并通過(guò)二次篩選驗(yàn)證(圖6)。在這些陽(yáng)性克隆中，選擇了15個(gè)克隆(在圖6中圈出)。測(cè)序后，結(jié)果這15個(gè)克隆對(duì)應(yīng)于切割rosal.4DNA靶標(biāo)的8種不同的新內(nèi)切核酸酶(表II)。表II:組合變體對(duì)rosal.4耙標(biāo)的切割<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>*僅展示了2208個(gè)組合中的105個(gè)。+表明在測(cè)序的陽(yáng)性克隆中發(fā)現(xiàn)了功能性組合突變體。實(shí)施例3:產(chǎn)生切割rosal的大范圍核酸酶在實(shí)施例1和2中鑒定了能夠切割每種來(lái)自rosal的回文耙標(biāo)(rosal.3和rosal.4)的I-Crel突變體。在酵母中共表達(dá)這樣的突變體對(duì)(一個(gè)切割rosal.3，一個(gè)切割rosal.4)。共表達(dá)后，應(yīng)當(dāng)存在三種活性分子種類兩種同二聚體和-種異二聚體。測(cè)試應(yīng)當(dāng)形成的異二聚體是否切割非回文的rosal和rosal.2DNA耙標(biāo)。1)材料和方法a)在卡那霉素杭件載體中克降突變體為了在酵母中共表達(dá)兩種I-Crel突變體，在用卡那霉素抗性基因標(biāo)記的酵母表達(dá)載體(pCLS1107，圖7)中亞克隆切割rosal.4序列的突變體。通過(guò)使用對(duì)pCLS0542和pCLS1107通用的弓|物GallOF5，-gcaactttagtgctgacacatacagg-3，(SEQIDNO:12)禾口Ga:[l()R5'-acaaccttgattggagacttgacc-3，(SEQIDNO:13)進(jìn)行的:PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增突變體。使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，使用約25ngPCR片段和經(jīng)DraIII和NgoMIV消化而線性化的25ng載體DNA(pCLS1107)轉(zhuǎn)化酵母釀酒酵母菌株FYC2-6A(MATa，trpl△63，leu2A1，his3A200)。通過(guò)在酵母中體內(nèi)同源重組來(lái)產(chǎn)生I-Crel突變體的完整編碼序列。然后將含有亞克隆到pCLSl107載體中的切割rosal.4耙標(biāo)的突變體的每個(gè)酵母菌株與表達(dá)rosal.4靶標(biāo)的酵母接合，進(jìn)行驗(yàn)證。為了回收表達(dá)質(zhì)粒的突變體，使用標(biāo)準(zhǔn)方案提取酵母DNA，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌和制備大腸桿菌DNA。b)辨船表汰用pCLSl107表達(dá)載體中編碼切割rosal.4靶標(biāo)之突變體的DNA轉(zhuǎn)化在pCLS()542表達(dá)載體中表達(dá)切割rosal.3靶標(biāo)之突變體的酵母菌株。在_LGlu+G418培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。c)格合大細(xì)鵬,就德并械舯賺使用菌落網(wǎng)格(gridder)(Qpix]:]:,GE國(guó):X)進(jìn)行接合。使用低網(wǎng)格密度(約4個(gè)點(diǎn)Zcm2)將突變體在覆蓋YPD平板的尼龍濾膜上劃網(wǎng)格。在相同的濾膜上進(jìn)行第二次劃網(wǎng)格的過(guò)程從而印上第二層，所述第二層對(duì)每個(gè)靶標(biāo)而言由具有不同報(bào)告子的酵母菌株組成。將膜置于富含固體瓊脂YPD的培養(yǎng)基上,并在3(TC孵育一夜，以允許接合。接著,將濾膜轉(zhuǎn)移至合成培養(yǎng)基上并在37"C孵育五天，以選擇帶有表達(dá)載體和靶標(biāo)載體的二倍體，所述合成培養(yǎng)基缺乏亮氨酸和色氨酸，添加G418，并含有半乳糖(2%)作為碳源。5天后，將濾膜置于固體瓊脂糖培養(yǎng)基上并在37。C孵育，以監(jiān)測(cè)13-半乳糖苷酶活性，所述固體瓊脂糖培養(yǎng)基在0.5M磷酸鈉緩沖液pH7.0中含有0.02%X-Ga1、0.1%SDS、6X二甲基甲酰胺(固F)、7mM13-巰基乙醇、1%瓊脂糖。通過(guò)掃描分析結(jié)果,并使用合適的軟件進(jìn)行量化。2)結(jié)果切割rosal.3靶標(biāo)(表I中所述ml到m18)的突變體和切割rosal.4靶標(biāo)(表II中所述)的八個(gè)突變體的共表達(dá)在所有情況下都導(dǎo)致對(duì)rosal.2靶標(biāo)的有效切割(篩選例子如圖8A中所示)。測(cè)試的所有組合概括于表III中。大部分這些組合還能夠切割rosal天然靶標(biāo)，所述rosal天然靶標(biāo)與rosal.2序列的差別僅在于+1位的lbp(圖2)。如圖8B中所示，用rosal天然靶標(biāo)觀察到的信號(hào)與用rosal.2靶標(biāo)觀察到的信號(hào)相比較弱。切割rosalDNA靶標(biāo)的組合展示于表IV中。表I]::I::導(dǎo)致切割rosa1.2靶標(biāo)的組合切割rosal.4的突變體28、30、33、38、40/44、68和70位氨基酸(例如ENRRR/A!!Q代表E28、謂、R33、R38、R40/A44、H68和Q70)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>"+"表示異二聚體突變體切割了rosalDNA靶標(biāo)。實(shí)施例4:通過(guò)對(duì)切割rosal.4的蛋白質(zhì)進(jìn)行隨機(jī)誘變并與切割rosal.3的蛋白質(zhì)進(jìn)行裝配來(lái)產(chǎn)生切割rosal的大范圍核酸酶已通過(guò)將切割回文rosal.3和rosal.4靶標(biāo)的突變體進(jìn)行裝配而鑒定了能夠切割非回文rosal.2和rosal靶標(biāo)的I-Crel突變體。然而，這些組合能夠有效切割rosal.2，但是難以切割與rosal.2的差異僅在于1位的lbp的rosal。用rosal觀察到的信號(hào)不足。因此，對(duì)切割rosal的蛋白組合進(jìn)行了隨機(jī)誘變，并篩選了有效切割rosal的變體。根據(jù)與其靶標(biāo)結(jié)合的I-Cre]:蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，4個(gè)中央堿基對(duì)(-2到2位)不與:卜Cre]:蛋白接觸(Chevalier,B.S.andB.L.Stoddard,NucleicAcidsRes.，2001,29，3757-3774;Chevalier等，Nat..Struct.Biol.，2001，8，312-316;Chevalier等，J.Mol.Biol.2003，329，253-269)。因此,難以合理地選擇一組位置來(lái)誘變，在蛋白質(zhì)的C端部分(最后83個(gè)氨基酸)或在整個(gè)蛋白質(zhì)上進(jìn)行了誘變。隨機(jī)誘變產(chǎn)生高復(fù)雜度文庫(kù)，并且通過(guò)僅對(duì)切割rosal的異二聚體的兩個(gè)組件之--進(jìn)行誘變，來(lái)限制待測(cè)試變體文庫(kù)的復(fù)雜度。因此，隨機(jī)誘變切割rosal.4的蛋白質(zhì)，并且測(cè)試與切割rosal.3的蛋白質(zhì)共表達(dá)時(shí)它們是否能夠切割rosal。1)材料和方法a)隨機(jī)誘變?nèi)鏙BSdNTP-誘變?cè)噭┖兄蠮ENABIOSCIENCEGmbH的方案所述，通過(guò)PCR在兩步式PCR方法中以選擇的突變體庫(kù)為基礎(chǔ)創(chuàng)建隨機(jī)誘變文庫(kù)，所述PCR使用Mn2+或作為8-氧代-dGTP和dPTP的dNTP衍生物。為了對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行隨機(jī)誘變，使用的弓I物是preATGCreFor5'-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3';SEQ]:I)NO:16)禾口ICrelpost.Rev5'_ggctcgaggagctcgtct.agaggatcgctcgagt.tatcagt.cggccgc_3'(SEQIDNO:17)。為了對(duì)蛋白質(zhì)的C端部分進(jìn)行隨機(jī)誘變，使用的引物是AA78a83For(5'-ttaagcgaaatcaagccg-3，;SEQIDNO:18)和含dNTP衍生物的ICrelpostRev;使用無(wú)dNTP衍生物的引物preATGCre:For和AA78a83Rev(5，-cggcttgatttcgcttaa-3，；SEQIDNO:19)，用高保真t.aq聚合酶擴(kuò)增蛋白質(zhì)的剩余部分。通過(guò)使用對(duì)pCLS0542(圖4)和pCLS1107(圖7)通用的這些引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增突變體庫(kù)。使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，使用約75ngPCR片段和經(jīng)DraIII和NgoMIV消化而線性化的75ng載體DM(pCLSl.107)轉(zhuǎn)化酵母釀酒酵母菌株FYC2-6A(MATa，trpl△63,leu2A1，his3A200)。通過(guò)在酵母中體內(nèi)同源重組來(lái)產(chǎn)生I_CreI突變體的完整編碼序列。通過(guò)如實(shí)施例1中所述的測(cè)序來(lái)驗(yàn)證具有陽(yáng)性結(jié)果的克隆。b)驗(yàn)麵就総頓辨髓險(xiǎn)含&固1革R纖,纖巾使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，用帶有LEU2基因標(biāo)記的pCLS()542載體中切割rosal.3靶標(biāo)的突變體轉(zhuǎn)化酵母菌株FYBL2-7B(MATa，ura3A851，trplA63，leu2A1，lys2A202)，所述酵母菌株含有進(jìn)入酵母報(bào)告載體pCLS1055(圖3)的rosal靶標(biāo)。得到的酵母菌株用作如實(shí)施例3中所述接合測(cè)定法的靶標(biāo)。2)結(jié)果將切割rosal.4的四種突變體(根據(jù)表IV為ERRR/AHQ、ERRR/ARN、ERRK/AHQ和ERRK/VRA)合并，對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)C端部分進(jìn)行隨機(jī)誘變并轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母。然后將4464個(gè)轉(zhuǎn)化克隆與酵母菌株接合，所述酵母菌株(i)在報(bào)告質(zhì)粒中含有rosal靶標(biāo)，(ii)表達(dá)切割rosal靶標(biāo)的變體，其選自實(shí)施例1中所述變體。使用三種菌株，其表達(dá)I-Cre]:V24Y44S68S70R75177(或VYSSRI)突變體，或I-CrelV24Y44R68S70Q75I77(或VYRSQI)突變體，或I-CreIV24Y44R68S70Y75T77(或VYRSYT)突變體(見(jiàn)表I)。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)克隆在與這樣的酵母菌株接合時(shí)與用相同酵母菌株誘變之前相比引發(fā)對(duì)rosal靶標(biāo)的更好的切割?？傊?，兩種蛋白質(zhì)在與VYSSRI:、VYRSQI或VYRSYT(表V和圖9)形成異二聚體時(shí)能夠有效切割rosal。有趣的是，兩種蛋白質(zhì)均含有A105和R107殘基。:展示對(duì)rosalDNA靶標(biāo)的強(qiáng)切割活性的功能性突變體組合<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>*通過(guò)隨機(jī)誘變產(chǎn)生的突變?yōu)楹隗w實(shí)施例5:通過(guò)隨機(jī)誘變切割rosal.3的蛋白質(zhì)并與切割rosal.4的精細(xì)化蛋白質(zhì)裝配而對(duì)切割rosal的大范圍核酸酶進(jìn)行精細(xì)化通過(guò)將切割rosal.3的突變體與切割rosal.4的精細(xì)化突變體裝配來(lái)鑒定能夠切割rosal靶標(biāo)的I-Crel突變體。為了提高大范圍核酸酶的活性，對(duì)切割rosal的異二聚體的第二組分進(jìn)行隨機(jī)誘變。在本實(shí)施例中，將切割rosal.3的突變體隨機(jī)誘變，然后篩選與實(shí)施例4所鑒定的切割rosal.4的精細(xì)化變體相組合的切割rosal的更有效的變體。1)材料和方法實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例4中所述，只是將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)通過(guò)NcoI和Eagl消化而線性化的pCLS0542載體(圖4)中。將KanE表汰載體中的突變體克降講含有rosal靶標(biāo)的酵母茼株中使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，用pCLS1107載體中切割rosal.4靶標(biāo)的M0_1和M0_2精細(xì)化突變體轉(zhuǎn)化酵母菌株FYBL2-7B(MATa，ura3A851，t.rpl△63，leu2△1，lys2△202)，所述酵母菌株含有進(jìn)入酵母報(bào)告載體(pCLS1055,圖3)的rosal靶標(biāo)。得到的酵母菌株用作如實(shí)施例3中所述接合測(cè)定法的靶標(biāo)。2)結(jié)果將切割rosal.3的四種突變體的兩個(gè)庫(kù)(根據(jù)表IV，1號(hào)庫(kù)VYRSNI、VYYSYR、VYRSNV和VYNSRI和2號(hào)庫(kù):VYYSYR、VYSSRI、VYRSQI和VYRSYT)在所有蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)C端部分進(jìn)行隨機(jī)誘變并轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母。然后將8928個(gè)轉(zhuǎn)化克隆與酵母菌株接合，所述酵母菌株(i)在報(bào)告質(zhì)粒中含有rosal靶標(biāo)，(ii)表達(dá)切割rosal.4靶標(biāo)的變體。使用兩種這樣的菌株，其表達(dá)I-CrelE28R33R38R40A44H68Q70N75A105R107(或M0J)突變體或者I-CrelE28R33R38K40A44H68Q70N75A105R107A151G153E158(或M0—2)突變體。發(fā)現(xiàn)五個(gè)克隆在與這樣的酵母菌株接合時(shí)與用相同酵母菌株誘變之前相比引發(fā)對(duì)rosal靶標(biāo)的更好的切割(圖IO)。測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)應(yīng)于四種蛋白質(zhì)。總之，鑒定了在與M0_1或M0_2形成異二聚體時(shí)能夠有效切割rosal的四種蛋白質(zhì)(表VI)。:針對(duì)rosalDNA耙標(biāo)顯示出強(qiáng)切割活性的功能性突變體組合<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*由隨機(jī)誘變弓I起的突變?yōu)楹隗w。通過(guò)對(duì)作為同二聚體切割rosal.3靶標(biāo)的I-Crel突變體庫(kù)的隨機(jī)誘變獲得這4種新蛋白質(zhì)(描述于實(shí)施例1和表I中)。有趣的是，與原始I-Crel突變體相比它們各自僅具有一個(gè)單氨基酸突變(G19S、V105A或S79G)(表VII)。例如，m0—2與m14的差異在于單個(gè)G19S突變。類似地,在本實(shí)施例中再次發(fā)現(xiàn)了實(shí)施例6中描述的A105突變，但是這次不與任何其他突變相關(guān)聯(lián)。這些3氨基酸突變提高了異二聚體針對(duì)rosal靶標(biāo)的活性(圖10)。具有G19S突變時(shí)該效果特別顯著。通過(guò)比較異二聚體針對(duì)rosal靶標(biāo)的活性而最好地展示了引入G19S突變所導(dǎo)致的改進(jìn)，所述異二聚體是通過(guò)在酵母中共表達(dá)突變體m14與M0—1或M0—2(圖9)以及突變體m0_2與M0_2(圖10)形成的。因此，G19S突變本身似乎足以提高活性。表VII:用于隨機(jī)誘變的實(shí)施例1所述I-Crel突變體和實(shí)施例5中所述精細(xì)化突變體。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>標(biāo)出了24、44、68、70、75和77位的氨基酸(例如VYRSYI代表V24、Y44、R68、S70、Y75和177)。w由隨機(jī)誘變?cè)斐傻耐蛔優(yōu)楹隗w。實(shí)施例6:增強(qiáng)異二聚體針對(duì)rosal靶標(biāo)之活性、消除同二聚體針對(duì)rosal.3回文靶標(biāo)之活性的G19S突變。在實(shí)施例5中鑒定了I-Crel精細(xì)化突變體，所述I-Crel精細(xì)化突變體在酵母中共表達(dá)形成異二聚體時(shí)能夠有效切割rosal靶標(biāo)(圖10)。實(shí)施例5顯示，在異二聚體的組件之一中添加的G19S增強(qiáng)了其對(duì)rosal靶標(biāo)的活性(表VI:、表VII、圖9和圖10)。該實(shí)施例顯示，G19S突變消除了同二聚體對(duì)回文rosal.3靶標(biāo)的活性。1)材料和方法實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例1中所述。2)結(jié)果現(xiàn)在針對(duì)回文rosal.3靶標(biāo)，以同二聚體對(duì)酵母中表達(dá)的實(shí)施例5所述精細(xì)化I-Crel突變體進(jìn)行篩選(圖11)。帶有突變V105A或S79G的突變體mO_3和m0_4作為同二聚體對(duì)rosal.3耙標(biāo)有活性。相反，帶有G19S突變的突變體m0—1和m0—2作為同二聚體對(duì)rosal.3回文靶標(biāo)無(wú)活性。因?yàn)橛行懈顁osal.3靶標(biāo)的VYRSNV和VYRSQI突變體(見(jiàn)實(shí)施例1)與mO_l和m0_2各自的區(qū)別僅在于19位的G，所以這些結(jié)果顯示，G19S突變足以顯著破壞同二聚體蛋白質(zhì)的活性。這些結(jié)果與mO_l和m0_2與其他蛋白質(zhì)形成異二聚體時(shí)G19S位的效果相反，在上述情況下導(dǎo)致活性的提高(實(shí)施例5)。通過(guò)該步驟無(wú)法確定該活性喪失是否由該同二聚體形成、結(jié)合或切割中的缺陷導(dǎo)致。然而，19位是催化位點(diǎn)的一部分(Chevalier等，Biochemistry,2004，43，14015-14026)，并且Glyl9與相鄰的Asp20.一起參與金屬陽(yáng)離子結(jié)合，這提示對(duì)切割步驟的直接影響。除了效力問(wèn)題以外，特異性對(duì)許多應(yīng)用而言是另一重要特性，特別是對(duì)治療性應(yīng)用而言。因此，G19S突變會(huì)有力地提高特異性，所述突變消除或強(qiáng)烈降低帶有該替換的同二聚體的活性。因?yàn)檫@--突變還在僅具有-個(gè)這類替換的異二聚體中提高活性，所以其將證明是改造具有更好一般特性的大范圍核酸酶的珍貴工具，前提是這一突變將該特性賦予任何或至少若干來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶，而不是僅賦予本實(shí)施例中所列的大范圍核酸酶。實(shí)施例7:產(chǎn)生切割B2M11.2的大范圍核酸酶本實(shí)施例顯示，I-Crel突變體能夠切割來(lái)自B2M11靶標(biāo)左側(cè)部分之回文形式的B2M11.2DNA靶序列(圖12)。本實(shí)施例中描述的靶序列是22bp回文序列。因此，僅以前11個(gè)核苷酸描述它們，隨后是后綴—P。例如，耙標(biāo)B2M11.2還被記為t.gaaattaggt_P(SEQIDNO:25)。B2M11.2在±1、±2、±3、±4、±5禾P±7位與5TAG_P相似，并在±1、±2、±7、±8、±9和±10位與10GAA—P相似。推測(cè)位置±6和±11對(duì)結(jié)合和切割活性幾乎沒(méi)有影響。先前通過(guò)在44、68、7()、75和77位誘變I-CrelN75獲得了能夠切割5TAG—Ptarget(caaaactaggt_P;SEQIDNO:22)的突變體(Arnould等，J.Mol.Biol.,2006，355，443-458以及國(guó)際PCT申請(qǐng)W02006/097784和WO2006/097853)。如先前在Smith等，NucleicAcidsResearch，2006,34，e149中所述，通過(guò)在28、30、32、33、38、40位上誘變I-CrelN75和D75獲得了能夠切割10GAA—P耙標(biāo)(cgaaacgtcgt_P;SEQIDNO:20)的突變體。因此，組合這樣的突變體對(duì)會(huì)允許切割B2M11.2靶標(biāo)。因此，為了檢驗(yàn)組合的突變體是否能夠切割B2M11.2耙標(biāo)，將來(lái)自切割5TAG—P(caaaactaggt—P;SEQIDNO:22)的蛋白質(zhì)中44、68、7()和77位的突變和來(lái)自切割10GAA—P(cgaaacgtcgt_P;SEQIDNO:20)的蛋白質(zhì)中28、30、32、33、38和40位突變組合。[O308]1)材料和方法a)私瞎癒載A如實(shí)施例1中所述使用下述寡核苷酸克隆耙標(biāo)5'tggcatacaagttttgttctcaggtacctgagaacaacaatcgtctgtca3，(SEQIDNO:27)，對(duì)應(yīng)于從PROLIGO訂購(gòu)的側(cè)翼是gateway克隆序列的靶序列。b)私瞎亂合，備在Smith等，NucleicAcidsRes.2006，34,e149;國(guó)際PCT申請(qǐng)W02007/049156和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458;國(guó)際PCT申請(qǐng)WO2006/097784和WO2006/097853中分別針對(duì)10GAA_P或5TAG_P耙標(biāo)鑒定了切割10GAA_P或5TAG_P的I-Crel突變體。如實(shí)施例2中所述通過(guò)分別的重疊PCR反應(yīng)產(chǎn)生含有來(lái)自兩個(gè)系列的突變的來(lái)自:卜Cre]:的編碼序列。c)接合大范g核JJT酶表汰克降并在酵母中篩詵實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例1中所述。d)辨翻/芊實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例1中所述。2)結(jié)果通過(guò)在I-CrelN75或D75骨架上結(jié)合44、68、70、75和77位的突變和28、30、33、38和40位突變，構(gòu)建I-Crel組合突變體,得到復(fù)雜度2014的文庫(kù)。組合的例子展示于表VIII:中。將這些文庫(kù)轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中，并針對(duì)對(duì)B2M1丄2DNA靶標(biāo)(tgaaattaggt—P;SEQIDNO:25)的切割篩選了4464個(gè)克隆(復(fù)雜度的2.2倍)。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)陽(yáng)性克隆具有非常低的活性水平，其在測(cè)序和通過(guò)二次篩選驗(yàn)證后顯示對(duì)應(yīng)于兩種不同的內(nèi)切核酸酶(見(jiàn)表VIII)。陽(yáng)性結(jié)果顯示于圖13中。表VI11::組合變體對(duì)B2M11.2耙標(biāo)的切割44、68、70、75和77位氨基酸(AYSYK代表A44Y68、S70、Y75和K77)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>*僅展示了2014個(gè)組合中的176個(gè)。+表示在鑒定的陽(yáng)性結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了功能性突變體。^MLS:通過(guò)隨機(jī)誘變切割B2M11.2的大范圍核酸酶來(lái)產(chǎn)生更高效地切割B2M11.2的大范圍核酸酶。通過(guò)裝配切割回文10GAA—P和5TAG—P靶標(biāo)的突變體來(lái)鑒定切割回文B2M11.2耙標(biāo)的I-Crel突變體(實(shí)施例7)。然而，這些組合中僅有兩個(gè)能夠切割B2M11.2并且效率非常低。因此，隨機(jī)誘變切割B2M11.2的2個(gè)蛋白質(zhì)組合，并篩選更高效地切割B2M11.2的變體。根據(jù)與其靶標(biāo)結(jié)合的I-Crel蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，I-Crel蛋白質(zhì)中用于第一組合方法的殘基(28、30、32、33、38和40與44、68、70、75和77)之間不接觸(Chevalier,B.S.和B.L.Stoddard,NucleicAcidsRes.2001，29,3757-3774:Chevalier等，Nat.Struct.Biol.2001,8,312-316，Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，難以推理性地選擇一組位置來(lái)誘變，在蛋白質(zhì)的C端部分(最后83個(gè)氨基酸)或整個(gè)蛋白質(zhì)上進(jìn)行了誘變。1)材料和方法實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例5中所述。372)結(jié)果將切割B2M11.2的兩個(gè)突變體(I-Crel32G33H44A68Y70S75Y77K禾tlI-Crel32A33H44A68Y70S75Y77K,根據(jù)表VIII的命名法也稱作KNGHQS/AYSYK和KNAHQS/AYSYK)合并，隨機(jī)誘變并轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中。然后將4464個(gè)轉(zhuǎn)化克隆與在報(bào)告質(zhì)粒中含有B2M1丄2耙標(biāo)的酵母菌株接合。發(fā)現(xiàn)32個(gè)克隆在與該酵母菌株接合時(shí)引發(fā)B2M11.2靶標(biāo)的切割，對(duì)應(yīng)于至少14種不同的新內(nèi)切核酸酶(見(jiàn)表IX)。陽(yáng)性結(jié)果的例子展示于圖14中。:針對(duì)B2M11.2耙標(biāo)優(yōu)化的突變體優(yōu)化的突變體B2M11.2"B2M11.2耙標(biāo)I-Crel32A33H44A68Y70S75Y77K/2Y53RI-Crel32A33H44A68Y70S75Y77K,^Y53R66C+I-Crel32A33H44A68Y70S75Y77K/'132V+I-Crel32G33H44A68Y70S75Y77K/W96R105A+I-Crel32G33H44A68Y70S75Y77K/'120G+ICrel32A33H44A68Y70S75Y77K/'43L105A159R+ICrel32G33H44A68Y70S75Y77K/'50R+I-Crel32G33H44A68Y70S75Y77K/々i9A50R+I-Crel32G33M4A68Y70S75Y77K/'81V129A154G+I-Crel32G33H44A68Y70S75Y77K/'129A161P+I-Crel32G33H44A68Y70S75Y77K,勺—17G+I-Crel32G33H44A68Y70S75Y77K/'81TI-Crel32G33H44A68Y70S75Y77K/'103T+標(biāo)明B2M11.2耙標(biāo)的切割*通過(guò)隨機(jī)誘變產(chǎn)生的突變?yōu)楹隗w。實(shí)施例9:產(chǎn)生切割B2M11.3的大范圍核酸酶本實(shí)施例顯示，I-Crel突變體能夠切割來(lái)自B2M1丄1靶標(biāo)右側(cè)部分的回文形式的B2M11.3DNA靶序列(圖12)。本實(shí)施例中描述的所有靶序列是22bp回文序列。因此，僅以前11個(gè)核苷酸描述它們，隨后是后綴P。例如，靶標(biāo)B2M11.3還被記為tctgactt.tgt_P;SEQIDNO:26。B2M11.3在±1、±2、±3、±4、±5、±6禾P±7位與5TTT—P相似，并在±1、±2、±6、±7、±8、±9和士10位與10CTG—P相似。推測(cè)位置±11對(duì)結(jié)合和切割活性幾乎沒(méi)有影響。先前通過(guò)在44、68、70、75和77位誘變I_CreIN75獲得了能夠切割5TTT_P靶標(biāo)(caaaactttgt—P;SEQIDNO:23)的突變體(Arnould等，J.Mol.Biol.2006，355，443-458和國(guó)際PCT申請(qǐng)W()2()06/()97784,W()2(K)6六)97853)。如Smith等，NucleicAcidsRes.，2006，34，e149中所述，通過(guò)在28、30、32、33、38、40和70位上誘變I-CrelN75和D75獲得了能夠切割10CTG—P靶標(biāo)(cctgacgtcgt—P;SEQIDNO:21)的突變體。因此，組合這樣的突變體對(duì)會(huì)允許切割B2M11.3靶標(biāo)。兩組蛋白質(zhì)均在70位上被突變。然而，先前證明I-Crel:中存在兩個(gè)可分離的功38能性結(jié)構(gòu)域(Smith等，NucleicAcidsRes.，2006,34，e149)。這意味著，該位置對(duì)針對(duì)靶標(biāo)堿基士10到8位的特異性幾乎沒(méi)有影響。因此，為了檢驗(yàn)組合的突變體是否能夠切割B2M11.3耙標(biāo)，將來(lái)自切割5TTT—P(caaaactttgt—P;SEQIDNO:23)的蛋白質(zhì)中44、68、70、75和77位的突變與來(lái)自切割10CTG—P(cctgacgtcgt—P;SEQIDNO:21)的蛋白質(zhì)中的28、30、32、33、38、40突變相組合。1)材料和方法構(gòu)建組合突變體Smith等，NucleicAcidsRes.，2006，34，e149;國(guó)際PCT申請(qǐng)W()20()7/(M9156，andArnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458;國(guó)際PCT申請(qǐng)WO2006/097784和WO2006/097853中分別針對(duì)10GAA_P或5TAG—P耙標(biāo)鑒定了切割10GAA_P或5TAG—P的I-Crel突變體。如實(shí)施例2中所述通過(guò)分別的重疊PCR反應(yīng),產(chǎn)生含有來(lái)自兩個(gè)系列的突變的來(lái)自:卜Cre:l:的編碼序列，只是克隆在通過(guò)Drain和NgoM]:V消化而線性化的酵母表達(dá)載體pCLS1107(KanE;圖7)中進(jìn)行。2)結(jié)果通過(guò)在I-CrelN75或D75骨架上將44、68、70、75和77位的突變與28、30、33、38和40位突變相組合，構(gòu)建I-Crel:組合突變體，得到復(fù)雜度1600的文庫(kù)。組合突變體的例子展示于表X中。將該文庫(kù)轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中，并針對(duì)對(duì)B2M11.3DNA耙標(biāo)(tct.gact.ttgt_P;SEQIDNO:26)的切割篩選了3348個(gè)克隆(復(fù)雜度的2.1倍)。發(fā)現(xiàn)一個(gè)陽(yáng)性克隆，其在測(cè)序和通過(guò)二次篩選驗(yàn)證后顯示對(duì)應(yīng)于新的內(nèi)切核酸酶(見(jiàn)表X)。該陽(yáng)性結(jié)果對(duì)B2M11.3靶標(biāo)的切割顯示于圖15中。:組合突變體對(duì)B2M11.3耙標(biāo)的切割*<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*僅展示了1600個(gè)組合中的240個(gè)。+表示組合突變體對(duì)B2M11.3靶標(biāo)的切割。實(shí)施例10:通過(guò)共表達(dá)與切割B2M11.3的蛋白質(zhì)裝配在一起的切割B2M11.2的大范圍核酸酶來(lái)產(chǎn)生切割B2M11的大范圍核酸酶在實(shí)施例7、8和9中鑒定了能夠切割每個(gè)來(lái)自回文B2M11的靶標(biāo)(B2M11.2和B2M11.3)的I-Cre]:突變體。將這樣的突變體對(duì)(一個(gè)切割B2M11.2，一個(gè)切割B2M11.3)在酵母中共表達(dá)。共表達(dá)后，應(yīng)當(dāng)存在三種活性分子種類兩種同二聚體和一種異二聚體。測(cè)試應(yīng)當(dāng)形成的異二聚體是否切割B2M11靶標(biāo)。1)材料和方法a)將pCLS()542中的優(yōu)化突變體克隆進(jìn)B2M:11靶標(biāo)酵母中使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，用帶有LEU2基因標(biāo)記的pCLS0542載體(圖4)中切割B2M11.2耙標(biāo)的優(yōu)化突變體轉(zhuǎn)化酵母菌株FYBL2-7B(MATa，ura3△851，trplA63，leu2△1，lys2A202)，所述酵母菌株含有進(jìn)入酵母報(bào)告載體(pCLS1055，圖3)的B2M11靶標(biāo)。將突變體耙標(biāo)酵母作為耙標(biāo)，用于如實(shí)施例1和3中所述針對(duì)切割B2M11.3的突變體(在用卡那霉素標(biāo)記的pCLS1107載體中)的接合測(cè)定(圖7)。b)接合大范圍核酸酶共表達(dá)克隆并在酵母中篩選實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例3中所述。2)結(jié)果切割B2M11.2與B2M11.3的突變體的共表達(dá)在大部分情況下導(dǎo)致B2M11靶標(biāo)的切割(圖16)。功能性組合概括與表XI中。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>+表示異二聚體突變體切割B2M11耙標(biāo)w通過(guò)隨機(jī)誘變產(chǎn)生的突變?yōu)楹隗w實(shí)施例ll:通過(guò)隨機(jī)誘變切割B2M11.3的大范圍核酸酶并與切割B2M11.2的蛋白質(zhì)共表達(dá)，產(chǎn)生更高效地切割B2M11的大范圍核酸酶通過(guò)共表達(dá)切割回文B2M11.2和B2M11.3耙標(biāo)的突變體來(lái)鑒定切割回文B2M11耙標(biāo)的I-Cre]:突變體(實(shí)施例7、8、9和10)。然而，能夠切割B2M11的陽(yáng)性組合的效率和數(shù)量很小。因此，隨機(jī)誘變切割B2M11.3的蛋白質(zhì)，并篩選在與針對(duì)B2M11.2優(yōu)化的突變體組合時(shí)更高效地切割B2M11的變體。根據(jù)與其靶標(biāo)結(jié)合的ICreI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，ICreI蛋白質(zhì)中用于第一組合方法的殘基(28、3()、32、33、38和40與44、68、7()、75和77)之間不發(fā)生接觸(Chevalier,B.S.andB.L.StoddardBL,NucleicAcidsRes.，2001,29，3757-3774;Chevalier等，Nat.Struct.Biol.2001，8，312-316;Chevalier等，J.Mol.Biol.2003,329，253-269)。因此,難以推理性地選擇一組位置來(lái)誘變,在蛋白質(zhì)的C端部分(最后83個(gè)氨基酸)或整個(gè)蛋白質(zhì)上進(jìn)行誘變。1)材料和方法如實(shí)施例4中所述進(jìn)行隨機(jī)誘變。制備突變體靶標(biāo)酵母，并作為靶標(biāo)用于實(shí)施例10中所述的接合測(cè)定。2)結(jié)果隨機(jī)誘變切割B2M11.3的突變體(I-CreI30Q33G38C68N70S75N77R，根據(jù)表XI的命名法也稱作KQSGCS/QNSNR)，并轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中。然后將6696個(gè)轉(zhuǎn)化克隆與選41自如實(shí)施例8中所述的酵母菌株接合，所述酵母菌株(i)在報(bào)告質(zhì)粒中含有B2M11靶標(biāo)(ii)表達(dá)切割B2M11.2耙標(biāo)的優(yōu)化變體。使用兩個(gè)這樣的菌株，其表達(dá)I-Crel32A33H44A68Y70S75Y77K/132V突變體或I-Crel32G33H44A68Y70S75Y77K/2I96R105A突變體(見(jiàn)表x:i:i:)。發(fā)現(xiàn)i()i個(gè)克隆在與這樣的酵母菌株接合時(shí)引發(fā)B2Mii靶標(biāo)的切割。在一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)不與KQSGCS/QNSNR蛋白質(zhì)共表達(dá)時(shí)這些克隆均不引發(fā)B2M11的切割。我們的結(jié)論是，101個(gè)陽(yáng)性結(jié)果中含有在與KQSGCS/QNSNR形成異二聚體時(shí)能夠切割B2M11的蛋白質(zhì)。這樣的異二聚體突變體的例子列于表XII中。這些陽(yáng)性結(jié)果對(duì)B2M11靶標(biāo)的切割的例子展示于圖17中。圖XII:導(dǎo)致切割B2M11耙標(biāo)的組合<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>+表示異二聚體變體切割B2M11靶標(biāo)。*由隨機(jī)誘變導(dǎo)致的突變?yōu)楹隗w。在改進(jìn)的突變體中發(fā)現(xiàn)了若干不同的突變，其中G19S和V105A突變?cè)谇拔拿枋?。V1()5A突變不與任何其他的額外突變結(jié)合，表明其足以改進(jìn)I-Cre:[30Q33G38C68N70S77R蛋白質(zhì)的活性。在實(shí)施例5中已經(jīng)觀察到，V105A突變足以改進(jìn)切割rosal靶標(biāo)的完全不同的異二聚體的活性。因此，V105A突變發(fā)揮"便攜式"基序的作用，其自身即能夠增強(qiáng)不同I-CreI衍生物的活性。實(shí)施例12:通過(guò)隨機(jī)誘變切割:B2M11.3的大范圍核酸酶、與切割:B2M11.2的蛋白質(zhì)共表達(dá)和在CHO細(xì)胞中篩選,產(chǎn)生更高效地切割B2M11.2的大范圍核酸酶通過(guò)在酵母中的共表達(dá)切割回文B2M11.2和B2M11.3靶標(biāo)的突變體(優(yōu)化或未優(yōu)化的)，鑒定更高效地切割回文B2M11靶標(biāo)的I-Crel突變體(實(shí)施例11)。然而，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能的異二聚體是非常有用的，并且使用染色體外測(cè)定法得到的能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中切割B2M11的陽(yáng)性組合的效率和數(shù)量可能與酵母細(xì)胞中不同。因此，如實(shí)施例11中所述對(duì)切割B2M11.2的最佳蛋白質(zhì)進(jìn)行誘變，并且篩選在與針對(duì)B2M11.3優(yōu)化的突變體相組合時(shí)以良好的效率切割B2M11的變體。根據(jù)與其靶標(biāo)結(jié)合的I-Crel蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，I-Crel蛋白質(zhì)中用于第一組合方法的殘基(28、30、32、33、38和40與44、68、70、75和77)之間不發(fā)生接觸(ChevalierB.S.和B.L.Stoddard,NucleicAcidsRes.2001，29，3757-74;Chevalier等，Nat.Struct.Biol.2001，8，312-316;Chevalier等，J.Mol.Biol.2003，329，253-269)。因此，難以推理性地選擇一組位置來(lái)誘變，在蛋白質(zhì)的C端部分(最后83個(gè)氨基酸)或整個(gè)蛋白質(zhì)上進(jìn)行誘變。1)材料和方法a)通過(guò)隨機(jī)誘變構(gòu)建文庫(kù)如JBSdNTP-誘變?cè)噭┖兄蠮ENABIOSCIENCEGmbH的方案所述，通過(guò)PCR在兩步式PCR方法中以選擇的突變體庫(kù)為基礎(chǔ)創(chuàng)建隨機(jī)誘變文庫(kù)，所述PCR使用Mn2+或作為8-氧代-dGTP和dPTP的dNTP衍生物。使用的引物是att.Bl-ICrelFor(5'-ggggacaagtttgtacaa33￡l3gC￡lggCttCg￡l3gg￡lg3t￡lg33CC3tggCC￡l3teCC33￡lt3t￡l3C3￡l3g3gttCC_3，;SEQIDNO:28)和attB2-ICreIRev(5，-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc-3，;SEQIDNO:29)。將獲得的PCR產(chǎn)物體外克隆進(jìn)來(lái)自I:NV:[T:ROGEN(pCLS1()69，圖18)的CHOGateway表達(dá)載體pCDNA6.2中。同時(shí)，將用于文庫(kù)的選定突變體以相同方式克隆在該載體中。通過(guò)測(cè)序(MILLEGEN)驗(yàn)證所克隆的突變體和陽(yáng)性結(jié)果的文庫(kù)克隆。b)在用于CHO篩選的載體中構(gòu)建B2M11靶標(biāo)通過(guò)兩步式:PCR從酵母靶標(biāo)載體(如實(shí)施例1中所述)中擴(kuò)增:B2M11靶標(biāo)，所述兩步式PCR使用引物Mls(5，-aaaaagcaggctgattggcatacaagtt-3，；SEQIDNO:30)和M2s(5，_ag￡i￡iagct.gggt.gatt.gac￡igacgattg_3，？SEQIDNO:31)，之后使用attBlad即bis(5，_ggggacEiEigtttgtgic股iEiEi股igca-3，？SEQIDNO:32)和attB2adapbis(5，-gggg&iccactttgtEictmgaaagct-3';SEQIDNO:33)。引物來(lái)自Pro:l.igo。使用Gateway方案(]:NV]:TR()GEN)將最終的PCR克隆進(jìn)CHO報(bào)告載體(pCLS1058，圖19)中。通過(guò)測(cè)序(MILLEGEN)驗(yàn)證所克隆的靶標(biāo)。c)哺乳動(dòng)救細(xì)胞中的染色體外測(cè)i定根據(jù)供應(yīng)商(QIAGEN)的方案，用Polyfect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。每個(gè)測(cè)定中，用兩種突變體各12.5ng(12.5ng切割回文B2M11.2靶標(biāo)的突變體，和12.5ng切割回文B2M11.3靶標(biāo)的突變體)共轉(zhuǎn)染150ng靶標(biāo)載體。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)去除培養(yǎng)基，并添加150ii1裂解/暴露緩沖液用于15-半乳糖苷酶液體測(cè)定(1升緩沖液含有l(wèi)()()m:[裂解緩沖液(Tris-HCl10mMpH7.5、NaCl150mM、TritonX1000.1%、BSA0.1mg/ml、蛋白酶抑制劑)，10mlMg100X緩沖液(MgCl2100mM、P-巰基乙醇35%)，110mlONPG8mg/ml禾口780ml磷酸鈉0.1MpH7.5)。在37。C下孵育后，在420nm處測(cè)量光吸收。整個(gè)過(guò)程在自動(dòng)化的Ve:l.ocityllBioCel平臺(tái)上進(jìn)行。2)結(jié)果將切割B2M11.2的優(yōu)化突變體(如表XII中所述，I_CreI32G33H44A68Y70S75Y77K/120G、32A33H44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C、32G33H44A68Y70S75Y77K/2I96R105A和32A33H44A68Y70S75Y77K/132V)隨機(jī)誘變并轉(zhuǎn)化進(jìn)Gateway載體(圖15)中。純化了1920個(gè)轉(zhuǎn)化克隆的DNA質(zhì)粒，然后與CHOB2M11靶標(biāo)載體和切割B2M11.3靶標(biāo)的優(yōu)化變體(選自實(shí)施例ll所述變體)共轉(zhuǎn)染。發(fā)現(xiàn)六十個(gè)克隆引發(fā)B2M11靶標(biāo)的切割。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)這些克隆在不與切割B2M11.3靶標(biāo)的優(yōu)化變體共轉(zhuǎn)染時(shí)均不引發(fā)B2M11切割。因此結(jié)論是，6()個(gè)陽(yáng)性結(jié)果中含有在與切割B2M11.3耙標(biāo)的優(yōu)化變體形成異二聚體時(shí)能夠切割B2M11的蛋白質(zhì)。這樣的異二聚體突變體的例子列于表XIII中，將觀察到的切割活性作為P-半乳糖苷酶活性的度量。再次發(fā)現(xiàn)了突變G19S和V105A，其為單獨(dú)的(V105A)或與其他突變組合(G19S)。表)(]::[i::導(dǎo)致b2:m:ii靶標(biāo)切割的功能性突變體組合^<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>w數(shù)值是CH:()細(xì)胞中染色體外測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值(吸光度單位)。實(shí)施例13:通過(guò)導(dǎo)致19位甘氨酸替換成絲氨酸(G19S)的定點(diǎn)誘變來(lái)精細(xì)化切割HprCH3耙位點(diǎn)的大范圍核酸酶。為了進(jìn)一步確認(rèn)G19S替換提高來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶切割活性的能力，將該突變摻入切割22bp(非回文)耙序列HprCH3(tcgagatgtcatgaaagagatgga;SEQIDNO:34)的異二聚體HprCH3.3(KNSHQS/QRRDlZ42A43L)ZHprCH34(KNTHQS/RYSNN/72T)中兩種蛋白質(zhì)的每一種中。HprCH3靶序列位于Crit.eculusgriseus(中國(guó)倉(cāng)鼠)HPRT基因的外顯子3(17至lj38位)中。為了評(píng)價(jià)原始的和G19S衍生突變體的切割活性，使用CH()細(xì)胞中的染色體報(bào)告系統(tǒng)(圖20)。在該系統(tǒng)中，CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的單拷貝LacZ基因被HprCH3位點(diǎn)中斷，因此是非功能性的。用HprCH3.3/HprCH3.4的CHO表達(dá)質(zhì)粒和LacZ修復(fù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，這允許通過(guò)同源重組恢復(fù)功能性LacZ基因。先前已顯示,雙鏈斷裂能夠誘導(dǎo)同源重組；因此LacZ基因的修復(fù)頻率指示了基因組H:prCH:3靶位點(diǎn)的切割效率。1)材料和方法a)定點(diǎn)誘變?yōu)榱讼騂prCH3.3和HprCH3.4編碼序列中引入G19S替換，進(jìn)行擴(kuò)增I-Crel編碼序列5'端(1-24位殘基)或3'端(14-167位殘基)的兩個(gè)分別的重疊PCR反應(yīng)。對(duì)5'和3'兩端而言，PCR都使用下述弓I物進(jìn)行與載體具有同源性的弓i物CCM2For5'-aagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc—3，(SEQIDNO35)或CCMRev5'_t.ctgatcgattcaagtcagtgtctctctagatagcgagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc-3，SEQIDNO36)以及就含有替換突變G19S的14-24位氨基酸而言對(duì)I-Crel編碼序列具有特異性的引物G19SF5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3'(SEQIDNO37)或G19SR5'_gatgatgctaccgtcagagt.ccacaaagccggc_3，(SEQIDNO38)。得到的PCR產(chǎn)物彼此具有33bp的同源性。隨后使用兩種片段每一種的等分試樣以及CCM2For和CCMRev引物，通過(guò)PCR裝配片段。b)在CH()表汰載體中克降突變體將用Sacl-Xbal消化的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)質(zhì)粒pCLS1088(圖21)中相應(yīng)的Sacl-Xbal位點(diǎn)中，所述質(zhì)粒是含有I-CrelN75編碼序列的CHOgateway表達(dá)載體pCDNA6.2(INVITROGEN)。通過(guò)測(cè)序(MILLEGEN)驗(yàn)證IiprCI-13.3-G19S或HprCH3.4-G19S編碼序列對(duì)I-Cre]:N75編碼序列的替換。c)哺乳云力物細(xì)朐中的染色體測(cè)定將帶有報(bào)告系統(tǒng)的CHO細(xì)胞系以每10cm平皿2X105個(gè)細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基中(Kaighn，s改良的F-12培養(yǎng)基(F12-K)，補(bǔ)充有2mML-谷氨酰胺、青霉素(誦I/ml)、鏈霉素(l()()iig/ml)、兩性霉素B(Fongizone)(()25ug/ml)(INVITROGEN-LIFESCIENCE)和10%FBS(SIGMA-ALDRICHC腿IE))。第二天，用Polyfect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將2ug的lacz修復(fù)基質(zhì)載體與不同量的大范圍核酸酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。在37°C孵育72小時(shí)后，將細(xì)胞在0.5%戊二醛中于4。C下固定10分鐘，在含0.02%NP40的100ml磷酸鹽緩沖液中洗滌兩次，并用以下的染色緩沖液(1()mM磷酸鹽緩沖液、l慮MgCl2、33niMK六氰基鐵(ni)、33mlK六氰基鐵(II)、0.1%(v/v)X-Gal)染色。之后在37。C下孵育過(guò)夜，在光學(xué)顯微鏡下檢查平板，并計(jì)數(shù)LacZ陽(yáng)性細(xì)胞克隆的數(shù)量。LacZ修復(fù)的頻率表述為L(zhǎng)acZ+灶點(diǎn)數(shù)除以轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)(5X105)，并針對(duì)轉(zhuǎn)染效率校準(zhǔn)。2)結(jié)果使用染色體測(cè)定法,在含有HprCH3靶標(biāo)的CHO細(xì)胞系中測(cè)試異二聚體的活性，所述異二聚體含有兩種原始突變體(HprCH3.3/HprCH3.4)，或者含有兩種G19S衍生突變體之一與相應(yīng)原始突變體的組合(HprCH3.3/HprCh3.4G19S或HprCH3.3G19S/HprCh3.4)。該染色體測(cè)定法詳盡地描述于最近的出版物(Arnoul等，J.Mol.Bio:I..EpubMay10,2007)中。簡(jiǎn)言之，首先產(chǎn)生帶有單拷貝轉(zhuǎn)基因的CHO細(xì)胞。該轉(zhuǎn)基因含有I-Scel切割位點(diǎn)上游的人EF1a啟動(dòng)子(圖20，步驟1)。其次，使用I-Scel大范圍核酸酶在該基因座上引發(fā)DSB誘導(dǎo)的同源重組，并插入具有新大范圍核酸酶切割位點(diǎn)的5.5kb盒(圖20,步驟2)。該盒含有由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的非功能性LacZ開(kāi)放讀碼框以及無(wú)啟動(dòng)子的潮霉素標(biāo)記基因。通過(guò)含有待測(cè)試大范圍核酸酶切割位點(diǎn)(此處為rosal切割位點(diǎn))的50bp插入而使LacZ基因本身失活。該細(xì)胞系隨后可用于使用切割rosal靶標(biāo)的經(jīng)改造I-Crel衍生物來(lái)評(píng)價(jià)DSB誘導(dǎo)的基因靶向效率(LacZ修復(fù))(圖20,步驟3)。將該細(xì)胞系與修復(fù)基質(zhì)和不同量的表達(dá)大范圍核酸酶的載體共轉(zhuǎn)染丄acZ基因的修復(fù)頻率從使用原始改造異二聚體(HprCH3.3/HprCH3.4)時(shí)的最高2.0X10—3，提高至使用HprCH3.3-G19S衍生突變體時(shí)的最高1.15X102和使用HprCH3.4-G19S衍生突變體時(shí)的最高1.2X10—2(圖22)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，G19S突變當(dāng)僅存在于單體之--中時(shí),其自身能夠增強(qiáng)異二聚體的活性。這些結(jié)果證實(shí)了在實(shí)施例5中獲得的結(jié)果，其中單個(gè)G19S替換顯示增強(qiáng)切割rosal靶標(biāo)的完全不同的異二聚體的活性。另外,在對(duì)B2M11靶標(biāo)具有增強(qiáng)活性的若干蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了G19S，盡管其與其他突變組合(見(jiàn)實(shí)施例11和12)。因此，G19S突變發(fā)揮"便攜式"基序的作用，其自身或者與其他突變組合時(shí)能夠增強(qiáng)不同I-Crel衍生物的活性。然而，在用修復(fù)基質(zhì)轉(zhuǎn)化HprCH3.3G19S/HprCH3.4G19S異二聚體時(shí)未檢測(cè)到LacZ+灶點(diǎn)，表明重組頻率低于6.0X106。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了實(shí)施例6中用切割rosal靶標(biāo)的大范圍核酸酶觀察到的結(jié)果其中單個(gè)G19S替換增強(qiáng)了活性，而處于異二聚體每個(gè)單體中各有G19S替換則導(dǎo)致非常強(qiáng)的活性降低。實(shí)施例14:通過(guò)引入單個(gè)G19S替換來(lái)改進(jìn)切割RAG1.10DNA序列的大范圍核酸酶通過(guò)隨機(jī)誘變I-Crel突變體來(lái)進(jìn)行的若干優(yōu)化過(guò)程顯示，若干改進(jìn)的突變體帶有相同的突變G19S，這表示用絲氨酸替換19位的甘氨酸。該突變具有雙重功能，因?yàn)槠洳粌H改進(jìn)異二聚體的活性，而且還消除帶有G19S突變之同二聚體的活性，因此增強(qiáng)來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶的特異性(見(jiàn)實(shí)施例5、6、11、12和13)。因此，向切割MG1.10.2耙標(biāo)的KRSNQS/AYSDR突變體(下文記為M2)和切割RAG1.10.3靶標(biāo)的NNSSRR/YRSQV突變體(下文記為M3)中引入G19S突變。然后如實(shí)施例12和13中所述，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的染色體外和染色體測(cè)定法中針對(duì)MGl.10、MG1.10.2和RAG1.10.3耙標(biāo)測(cè)試這些新的蛋白質(zhì)(圖23)。1)材料和方法a)引入G19S突變使用兩組引物進(jìn)行兩個(gè)重疊PCR反應(yīng)針對(duì)第-片段的Gal10F(5'-gcaacttt.agtgctgacacatacagg-3';SEQIDNO12)和G19SRev(5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3，，SEQIDNO38),以及針對(duì)第二片段的G19SFor(5，-gccggcUtgtggactctgacggtagcatcatc-3，，SEQIDNO*37))和Gall()R(5，-acaaccttgattggagacttgacc-3，，SEQIDNO13)。使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Gietz，R.D.andR.A.Woods;MethodsEnzymol.2002，350，87-96)，使用約25ng的每種PCR片段和通過(guò)NcoI和Eagl消化而線性化的75ng載體DNA(pCLS0542)轉(zhuǎn)化酵母釀酒酵母菌株FYC2-6A(MATa,trplA63，leu2A1，his3A200)。通過(guò)在酵母中體內(nèi)同源重組來(lái)產(chǎn)生含有G19S突變的完整編碼序列。b)突變體測(cè)序?yàn)榱嘶厥胀蛔凅w表達(dá)質(zhì)粒，使用標(biāo)準(zhǔn)方案提取酵母DNA并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。然后通過(guò)MILLEGENSA對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行突變體ORF的測(cè)序。c)將RAG1.10G19S突變體克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中通過(guò)PCR擴(kuò)增每種突變體0RF，所述PCR使用引物CCM2For:(5，-aagcagagctct.ctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc-3'，SEQIDNO*39)禾卩CCMRevBis:(5，—ctgctctagattagtcggccgccggggaggatttctto—3'，SEQIDNO40)。用限制性酶SacI和Xbal消化PCR片段，然后連接進(jìn)也用SacI和Xbal消化的載體pCLS1088(圖21)中。通過(guò)測(cè)序(MILLEGEN)驗(yàn)證得到的克隆。d)將不同的RAG1.l()靶標(biāo)克降講載體中以用于染fi體外測(cè)定如下克隆目的靶標(biāo)寡核苷酸從Proligo定購(gòu)，其對(duì)應(yīng)于側(cè)翼是gateway克隆序列的靶序列。使用Gateway方案(INVITROGEN)，將通過(guò)單鏈寡核苷酸的PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生的雙鏈靶標(biāo)DM克隆進(jìn)CHO報(bào)告載體(pCLS固，圖19)中。e)CH()細(xì)胞中的染戶,體外測(cè)定見(jiàn)實(shí)施例12f)CHO細(xì)朐中的染色體測(cè)!定見(jiàn)實(shí)施例132)結(jié)果使用CHO細(xì)胞中的染色體外測(cè)定，監(jiān)測(cè)帶有G19S突變的M2和M3I_CreI突變體(M2G19S和M3G19S)針對(duì)各自的耙標(biāo)MG1.10.2和MG1.10.3(圖23)的活性。以純同二聚體方式測(cè)試突變體，或者以共轉(zhuǎn)染帶有和不帶有G19S突變的突變體的方式測(cè)試突變體，后者允許檢測(cè)兩種異二聚體M2/M2G19S和M3/M3G19S針對(duì)其各自的MG1.10.2和MG1.10.3耙標(biāo)的活性(圖24A)。然后針對(duì)MG1.10耙標(biāo)測(cè)試不同的異二聚體M2/M3、M2G19S/M3和M2/M3G19S(圖24B)。如從圖23A和23B中可以看出，觀察到了G19S突變的兩個(gè)方面。首先，該突變消除異二聚體(M2G19S和M3G19S)對(duì)其回文靶標(biāo)的活性。其次,在M3突變體中引入G19S突變大幅提高了M3/M3G19S異二聚體對(duì)MG1.10.3耙標(biāo)的切割活性。該效果實(shí)際上無(wú)法在M2突變體中得到證實(shí)，因?yàn)樗谠摐y(cè)定中已經(jīng)以飽和水平切割MG1.10.2靶標(biāo)。這一評(píng)論也適用于RAGl.10耙標(biāo)，它以飽和水平被M2/M3異二聚體以及M2G19S/M3和M2/M3G19S異二聚體切割。然后在CH:()細(xì)胞中的染色體測(cè)定中測(cè)試最后這三種異二聚體。使用的系統(tǒng)描述于實(shí)施例13和圖20中，但是在本實(shí)施例中，在報(bào)告菌株中引入RAGl.IO切割位點(diǎn)而不是rosal，并且使用表達(dá)每種大范圍核酸酶的0.1iig每種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。表XIV概括了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在兩個(gè)單體之一(M2或M3)中引入G19S時(shí)，觀察到基因耙向頻率提高大于兩倍。表XIV:在用于轉(zhuǎn)染帶有單拷貝CMV-LacZ盒之CHO細(xì)胞系的異二聚體性質(zhì)的作用下LacZ的修復(fù)頻率，所述盒中LacZ基因被RAG1.10DNA序列中斷。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>這些結(jié)果證實(shí)了實(shí)施例5、6、11、12和13中所述數(shù)據(jù)，顯示G19S是便攜式基序，其能夠提高若千完全不同的異二聚體I-CreI改造衍生物的活性。另外，它們還證實(shí)該突變消除功能性同二聚體的形成，如在實(shí)施例6和13中用不同的大范圍核酸酶所觀察到的一樣。該作用完全歸因于各個(gè)單體中G19S突變的存在，因?yàn)镸3/M3G19S不光是有功能的，而且甚至比M3ZM3同二聚體活性更強(qiáng)?？傊?，本文所示的多個(gè)實(shí)施例將G19S定義為能夠提高來(lái)自I-Crel的經(jīng)改造大范圍核酸酶之活性和特異性的便攜式基序。實(shí)施例15:通過(guò)引入K7E、E8K和G19S突變來(lái)產(chǎn)生MG1.10專性異二聚體。實(shí)施例6、13和14顯示，G19S突變不僅提高異二聚體活性，而且?guī)缀跬耆鼼19S同二聚體的活性。因此這是用于專性異二聚體設(shè)計(jì)中的--種工具。考慮上文在實(shí)施例14中所述的兩種MG1.10異二聚體(M2和M3)，將K7E突變引入M2G19S和M3G19S變體中，將E8K突變引入M2和M3變體中。然后使用實(shí)施例12中描述的CH0染色體外測(cè)定法，針對(duì)三種RAG1.10耙標(biāo)監(jiān)測(cè)兩種異二聚體M2K7E，G19S/M3E8K和M2E8K/M3K7E，G19S的活性。1)材料和方法a)引入K7E和E8K突變來(lái)自I-Crel的突變體M2和M3已被克隆進(jìn)pCLS1088哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中(圖21)。使用對(duì)M2和M3突變體DNA進(jìn)行的兩個(gè)重疊PCR反應(yīng)引入每種突變。對(duì)K7E突變而言，第一PCR反應(yīng)使用引物CMVFor(5，-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3，；SEQIDNO53)和K7ERev(5，-gtacagcaggaactcttcgttatatttggtattgg-3，，SEQIDNO54)進(jìn)行，第二反應(yīng)使用弓l物K7EFor(5'-aataccaaatataacgaagagttcctgctgtacc-3',S:E:QIDNO55)禾口V5印itopeRev(5'-cgtagaatcgagaccgaggagagg-3'，SEQIDNO56)進(jìn)行。將兩種PCR片段凝膠純化，混合，并使用CMVFor和V5印itopeRev引物進(jìn)行第三裝配PCR。獲得的PCR片段含有帶有K7E突變的I-Crel突變體開(kāi)放讀碼框。然后純化PCR片段，用限制性酶Sacl和Xbal消化，并連接進(jìn)也通過(guò)Sacl:和Xbal:消化的pCLS1088(圖21)中。通過(guò)測(cè)序(MILLEGEN)驗(yàn)證得到的克隆M2K7E或M3K7E。使用除兩禾中弓I物E8KRev(5，_caggtacagcaggaacttt.ttgt.tatatttgg_3，；SEQIDNO:57)禾口E8KFor(5'accaaatataacaaaaagttcctgctgtacctgg-3'，SEQIDNO.58)之夕卜均完全相同的方案進(jìn)行M2和M3突變體中E8K突變的引入。b)引入G19S突變使用對(duì)突變體DNA進(jìn)行的兩個(gè)重疊PCR反應(yīng)引入G19S突變。第一PCR反應(yīng)使用弓l物CMVFor(5，-cgc腿tgggcggtaggcgtg-3，，SEQIDNO53)禾口G19SRev(5，-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3';SEQIDNO59)進(jìn)行，第二反應(yīng)使用弓l物G19SFor(5'-gccggctttgtggactct.gacggtagcatcatc-3'，SEQIDNO60)禾口V5印itopeRev(5'-cgtagaatcgagaccgaggagagg-3'，SEQIDNO56)進(jìn)行。將兩種PCR片段凝膠純化，混合，并使用CMVFor和V5印itopeRev引物進(jìn)行第三裝配PCR。獲得的PCR片段含有帶有G19S突變的I-Crel突變體的開(kāi)放讀碼框。然后純化PCR片段，用限制性酶Sacl和Xbal:消化，并連接進(jìn)也通過(guò)Sacl和Xbal消化的pCLS1088中。通過(guò)測(cè)序(MILLEGEN)驗(yàn)證得到的克隆M2K7E，G19S和M3K7E，G19S。2)結(jié)果使用先前所述的染色體外測(cè)定法(實(shí)施例12)，在CH0細(xì)胞中將兩種異二聚體M2K7E，G19S/M3E8K(Hetl)和M2E8K/M3K7E，G19S(Het2)對(duì)三種RAG1.IO耙標(biāo)的活性與原始M2/M3異二聚體的活性相比。圖25顯示，兩種異二聚體Ifetl和Ifet2表現(xiàn)為專性異二聚體，因?yàn)橥垠w活性已被降至幾乎檢測(cè)不到的水平。另外，H:etl和:Het2對(duì)RAG1.10耙標(biāo)具有與原始M2ZM3異二聚體相同的活性水平。因此,K7EZE8K和G19S突變可用于有力地促進(jìn)形成功能性異二聚體，而不是功能性同二聚體。實(shí)施例16:K7E、E8K和G19S突變?cè)趩捂湻肿釉O(shè)計(jì)中的用途為了進(jìn)一步驗(yàn)證G19S和K7E/E8K改進(jìn)大范圍核酸酶特異性的用途，將這些突變引入能夠切割Cl靶標(biāo)(cgagatgt.cacacagaggtacg;SEQIDNO:61)的單鏈分子中，所述C1靶標(biāo)是存在于人著色性千皮病(XPC)基因中的DNA序列。先前已描述了改造能夠切割C1耙標(biāo)的來(lái)自I-Crel的突變體(Arnould等，J.Mol.Biol.，EDublOMay2007;國(guó)際PCT申i青W()2()()7/()93836andW()2007/093918)。單鏈構(gòu)建體是X2-LI-H33,其中X2是能夠切割回文C4靶標(biāo)的來(lái)自I-CrelY33H、Q38A、S40Q、Q44K、R68Q、R70S和D75N的突變體，H33是切割回文C3靶標(biāo)的I-CrelY33H突變體，Ll是將X2突變體C端與H33突變體N端連接的22個(gè)氨基酸的連接子(-AA(GGGGS)4-;SEQIDNO:68)。將K7E/E8K和G19S突變引入XPC單鏈分子中，產(chǎn)生兩個(gè)新的單鏈分子SCX1和SCX2，分別為X2(K7E)-L1-:H33(E8K，G19S)和X2(E8K)-U-H33(K7E，G19S)。然后使用先前描述的酵母篩選測(cè)定法監(jiān)測(cè)三種單鏈分子針對(duì)三種XPC耙標(biāo)的活性。1)材料和方法a)將K7E、E8K和G19S突變引入XPCX2-Ll-H33單鏈分子中首先將G19S突變引入X2-L1-H33分子中。對(duì)克隆進(jìn)pCLS0542酵母表達(dá)載體中的單鏈分子進(jìn)行兩個(gè)重疊PCR反應(yīng)。第一PCR反應(yīng)使用引物GallOF(5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3';SEQIDNO*12)禾口G19SRev60(5'-gcaatgatggagccatcagaatccacaaatccagc-3，，SEQIDNO*62),第二PCR反應(yīng)使用引物G19SFor6()(5，-gctggatttgtggattctgatggctccatcat.tgc-3';SEQIDNO:63)禾口GallOR(5'_acaaccttgattggagacttgacc_3'，SEQIDNO*13)。使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Giet.zRD禾口WoodsRATransformationofyeastbylithiumacetate/single-strandedcarrierDNA/polyethyleneglycolmethod.MethodsEnzymol.2002;350:87-96)，使用約25ng每種PCR片段和通過(guò)Ncol和Eag]:消化而線性化的75ng載體DNA(pCLS0542)轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株FYC2_6A(MATa,trplA63，leu2Al，his3A200)。通過(guò)酵母中的體內(nèi)同源重組產(chǎn)生含有G19S突變的完整編碼序列。在第二步驟中，通過(guò)進(jìn)行三個(gè)重疊突變將K7E和E8K突變引入X2-L2-1133(G19S)分子中。對(duì)SCX1分子而言，3個(gè)PCR反應(yīng)使用三個(gè)引物組，分別為Ga:l.l()F和K7E:Rev(5'_gtacagcaggaactctt.cgtt.atat.ttggtat.tgg_3'，SEQIDNO*54)，K7EFor(5，_aataccaaatat.aacgaagagttcctgctgt.acc_3'，SEQIDNO55)禾口E8KRevSC(5，-aagatacagcaggaactttttgttagagccacc-3，，SEQIDNO64)，以及E8KForSc(5，-ggtggctctaacaaaaagttcctgctgtatctt-3，，SEQIDNO.65)禾口Ga:[l()R。對(duì)SCX2分子而言，3個(gè)PCR反應(yīng)使用三個(gè)引物組，分別為GallOF和E8KRev(5，_caggtacagcaggaactt.tttgttat.att.tgg_3'，SEQIDNO.57)，E8KFor(5，—accaaatataacaaaaagttcctgctgtacctgg—3，，SEQIDNO58)和K7ERevSC(5，_aagat.acagcaggaact.cttcgttagagccacc_3'SEQIDNO66)，以及K7EForSc(5，-ggtggctctaacgaagagtt.cctgctgt.atct.t-3，，SEQIDNO67)禾口GallOR。對(duì)兩種構(gòu)建體而言，使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(GietzRD禾卩WoodsRATransformationofyeastbylithiumacetate/single-strandedcarrierDNA/polyethyleneglycolmethod.MethodsEnzymol.2002;350:87-96)，使用約25ng每種PCR片段和通過(guò)Ncol和EagI消化來(lái)線性化的75ng載體DNA(pCLS0542)轉(zhuǎn)化酵母釀酒酵母菌株FYC2-6A(MATa，trplA63，leu2A1,his3A200)。通過(guò)酵母中的體內(nèi)同源重組產(chǎn)生SCX1或SCX2構(gòu)建體的完整編碼序列。b)接合共表汰大范g:核BT酶的克降并在酵母中篩詵使用菌落網(wǎng)格(QpixII，GENETIX)進(jìn)行接合。使用低網(wǎng)格密度(約4個(gè)點(diǎn)/cm2)將突變體在覆蓋YPD平板的尼龍濾膜上劃網(wǎng)格。在相同的濾膜上進(jìn)行第二次劃網(wǎng)格的過(guò)程從而印上第二層，所述第二層對(duì)每個(gè)靶標(biāo)而言由具有不同報(bào)告子的酵母菌株組成。將膜置于富含固體瓊脂YPD的培養(yǎng)基上，并在3(TC孵育一夜，以允許接合。接著,將濾膜轉(zhuǎn)移至合成培養(yǎng)基上并在37。C孵育五天，以選擇帶有表達(dá)載體和靶標(biāo)載體的二倍體，所述合成培養(yǎng)基缺乏亮氨酸和色氨酸,添加G418，并含有半乳糖(1%)作為碳源。5天后,將濾膜置于固體瓊脂糖培養(yǎng)基上并在37。C孵育，以監(jiān)測(cè)13-半乳糖苷酶活性,所述固體瓊脂糖培養(yǎng)基在0.5M磷酸鈉緩沖液pH7.0中含有0.02%X-Gal、0.1%SDS、6X二甲基甲酰胺(DMF)、7mM|3_巰基乙醇、1%瓊脂糖。通過(guò)掃描分析結(jié)果，并使用合適的軟件進(jìn)行量化。2)結(jié)果圖26展示了酵母篩選測(cè)定中三種單鏈分子X(jué)2-L1-H33、SCX1和SCX2針對(duì)三種X:PC靶標(biāo)的活性。原始單鏈分子具有針對(duì)Cl和C3靶標(biāo)的強(qiáng)切割活性，但是引入K7E/E8K和G19S突變以產(chǎn)生SCX1和SCX2分子促進(jìn)了針對(duì)Cl靶標(biāo)的活性提高，并完全消除了針對(duì)C3靶標(biāo)的切割活性。因此，在實(shí)施例15專性異二聚體設(shè)計(jì)中描述的突變K7E/E8K和G19S也可以成功地引入單鏈分子中，以改進(jìn)其特異性而不影響其針對(duì)目的:[)NA耙標(biāo)的切割活性。實(shí)施例17::通過(guò)引入單獨(dú)或組合的V105A和I132V突變來(lái)改進(jìn)切割HBB5DNA序列的大范圍核酸酶HBB5DNA序列(5，-ttggtctccttaaacctgtcttga-3，；SEQIDNO:69)屬于編碼血紅蛋白e-鏈的H:BB基因。:HBB5I)NA序列位于HB:B基因內(nèi)含子1的開(kāi)始處。將HBB5I)NA靶標(biāo)分成兩個(gè)半回文24bpDNA耙標(biāo)，稱為HBB5.3(5'-t.tggt.ctcctgtacaggagaccaa-3，；SEQIDNO.70)和HBB5.4(5，-tcaagacagggtaccctgtctt.ga-3，，SEQIDNO71)。通過(guò)在實(shí)施例1和2中詳盡描述的半推理組合方法，我們能獲得能夠切割HBB5.3靶標(biāo)的來(lái)自I-Crel的突變體。稱作H3的該突變體與I-Cre]:野生型序列相比具有以下突變3()S33H38R44K68Y7()S77T。使用與如實(shí)施例4中所示隨機(jī)誘變產(chǎn)生的突變體優(yōu)化相同的方法，獲得了能夠切割HBB5.4耙標(biāo)的兩種來(lái)自I-Crel的突變體。稱作H4a和H4b的兩種突變體與I-Crel野生型序列相比分別具有以下突變19S32T44A70S75E77R80K96R和24V43L44A70S75E77R80K87L96R。隨后突變體H3與Ma或H4b的酵母共表達(dá)導(dǎo)致異二聚體大范圍核酸酶對(duì)H:BB5DNA序列的切割。為了評(píng)價(jià)多重優(yōu)化突變對(duì)活性的影響，在H3突變體上引入單獨(dú)或組合的突變V105A和1132V。然后在針對(duì)HBB5.1耙標(biāo)的酵母重組測(cè)定法中用兩種H4a和H4b配偶體測(cè)52試獲得的突變體。1)材料和方法a)引入V105A突變使用兩組引物對(duì)編碼H3突變體的DM進(jìn)行兩個(gè)重疊PCR反應(yīng)第一片段使用GallOF(5'_gcaact.ttagtgctgacacat.acagg_3',SEQIDNO12))禾口V105ARev(5，_tt.cgat.aatt.ttcagagccaggtttgcctgttt-3，，SEQIDNO72)，第二片段使用V105AFor(5，-aaacaggcaaacctggctctgaaaattatcgaa-3'，SEQIDNO*73)和GallOR(5'-acaaccttgattggagacttgacc-3',SEQIDNO13)。使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Gietz，R.I).和R.A.Woods;MethodsEnzymol.2002，350，87-96)，使用約25ng每種PCR片段和經(jīng)Ncol和EagI消化而線性化的75ng載體DNA(pCLS0542)轉(zhuǎn)化酵母釀酒酵母菌株FYC2-6A(MATa，trpl△63，leu2A1，his3A200)。通過(guò)在酵母中體內(nèi)同源重組來(lái)產(chǎn)生含有V105A突變的完整編碼序列。通過(guò)如實(shí)施例1中所述的測(cè)序來(lái)驗(yàn)證具有陽(yáng)性結(jié)果的克隆。b)引入1132V突變使用兩組引物對(duì)編碼H3突變體的DNA進(jìn)行兩個(gè)重疊PCR反應(yīng)第一片段使用Gal10F(5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3'，SEQIDNO12)和1132VRev(5'-atcgttcagagctgcaacctgatccacccaggt-3';SEQIDNO*74)，第二片'段使用I132VFor(5'acctgggtggatcaggtt.gcagctct.gaacgat-3'，SEQIDNO75)和GallOR(5，_acaacct.tgat.tggagact.tgacc_3，,SEQIDNO13)。使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Gietz，R.D.andR.A.Woods;MethodsEnzymol.2002，350,87-96)，使用約25ng每種PCR片段和經(jīng)Ncol和EagI消化而線性化的75ng載體DNA(pCLS0542)轉(zhuǎn)化酵母釀酒酵母菌株FYC2-6A(MATa，trpl△63,leu2△1,his3△200)。通過(guò)在酵母中體內(nèi)同源重組來(lái)產(chǎn)生含有1132V突變的完整編碼序列。通過(guò)對(duì)下述DNA進(jìn)行這些相同的PCR反應(yīng)獲得雙重突變體H3V1051132V，所述DNA編碼帶有V105突變的H3突變體。c)突變體測(cè)序?yàn)榱嘶厥胀蛔凅w表達(dá)質(zhì)粒，使用標(biāo)準(zhǔn)方案提取酵母DNA并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。然后通過(guò)MILLEGENSA對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行突變體ORF的測(cè)序。2)結(jié)果將三種來(lái)自H3的突變體(H3V1()5A、:H3]:132V和H3V1()5A]:132V)與H:4a或H4b在酵母中共表達(dá)，并使用先前實(shí)施例(見(jiàn)實(shí)施例3)中已經(jīng)描述的酵母重組測(cè)定法監(jiān)測(cè)HBB5靶標(biāo)的切割。表XV中所指數(shù)值與13-半乳糖苷酶活性直接相關(guān)，并因此與異二聚體HBB5大范圍核酸酶的切割活性直接相關(guān)。:異二聚體大范圍核酸酶對(duì)H:BB5耙標(biāo)的酵母切割，其中一個(gè)配偶體帶有單獨(dú)或組合的V105A和I132V突變53<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>在兩種情況下(H4a或H4b),在H3突變體上引入的突變V105A或1132V都提高了針對(duì)H:BB5靶標(biāo)的切割活性。同時(shí)引入兩種突變時(shí)活性被進(jìn)一步提高，顯示它們可彼此獨(dú)立地發(fā)揮作用。權(quán)利要求用于增強(qiáng)來(lái)自I-CreI的大范圍核酸酶的切割活性的方法，其特征是包括對(duì)I-CreI中選自以下的至少一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變19位甘氨酸(G19)、54位苯丙氨酸(F54)、87位苯丙氨酸(F87)、79位絲氨酸(S79)、105位纈氨酸(V105)和132位異亮氨酸(I132)。2.權(quán)利要求l的方法，其中19位甘氨酸被改變?yōu)榻z氨酸(G19S)或丙氨酸(G19A),54位苯丙氨酸被改變?yōu)榱涟彼?F54L)，87位苯丙氨酸被改變?yōu)榱涟彼?F87L)，79位絲氨酸被改變?yōu)楦拾彼?S79G)，105位纈氨酸被改變?yōu)楸彼?V105A)，和/或132位異亮氨酸被改變?yōu)槔i氨酸(1132V)。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中在所述來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶的同一單體中突變選自G19、F54、F87、S79、V105和1132的至少兩個(gè)氨基酸殘基。4.權(quán)利要求3的方法，其中在所述來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶的同一單體中突變V105和1132殘基。5.權(quán)利要求l到4中任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)所述來(lái)自I-Cre]:的大范圍核酸酶的兩個(gè)單體均進(jìn)行突變。6.權(quán)利要求5的方法，其中一單體具有G19S或F87L突變，另一單體同時(shí)具有V105A和1132V突變。7.權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，其中所述來(lái)自:卜Cre:l:的大范圍核酸酶是異二聚體。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述來(lái)自I-Crel的異二聚體大范圍核酸酶由兩個(gè)單體組成，每個(gè)單體包含在I-Crel的26到40位和/或44到77位上的不同突變，所述大范圍核酸酶能夠切割非回文的目的基因組DNA靶序列。9.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中所述來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶在I-Crel的137到143位上包含一個(gè)或多個(gè)替換，所述替換改變了針對(duì)I-Crel位點(diǎn)中±1到2、±6到7和/或±11到12位核苷酸的特異性。10.權(quán)利要求7到9中任一項(xiàng)的方法，其中所述來(lái)自I-Crel的異二聚體大范圍核酸酶的兩個(gè)單體之-一包含G19S突變,所述突變破壞功能性同二聚體的形成。11.權(quán)利要求10的方法，其中另一單體包含不同的突變，所述突變破壞功能性同二聚體的形成或有助于異二聚體的形成。12.權(quán)利要求7到11中任一項(xiàng)的方法，其中所述來(lái)自:卜Cre:l:的異二聚體大范圍核酸酶是專性異二聚體，其中一個(gè)單體包含D137R突變，另一單體包含R51D突變。13.權(quán)利要求7到11中任一項(xiàng)的方法，其中所述來(lái)自I-Crel的異二聚體大范圍核酸酶是專性異二聚體，其中一個(gè)單體包含K7E突變，另一單體包含E8K突變。14.可通過(guò)權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)的方法獲得的來(lái)自I-Cre:[的大范圍核酸酶,所述大范圍核酸酶至少包含選自G19S、G19A、F54L、F87L、S79G、V105A和I132V的突變，排除選自以下的I-Crel變體-1-CrelG19A，K28A，Y33S,Q38R，S40K,R70S,D75N，-]:-Cre]:G19A，K28A，Q38R,S4()K，R7()S，:[)75N，F(xiàn)87L，-I-CreIG19A，K28A，Y33S，Q38R，S40K，D69G，R70S，D75N，-I-CreIY33R，S40Q，Q44A，R70H，D75N，F(xiàn)87L，1132T，V151A，-I-CrelY33R，S40Q，Q44A，R70H，D75N，F(xiàn)87L，F(xiàn)94L，V125A，E157G，K160R，-I-CreIY33H，F(xiàn)54L，N86D，K100R，L104M，V105A，N136S，K159R，-1-CrelS32T，Y33H，Q44K，R68Y，R70S，177R，Q92R,K96R,K107R，1132V，T140A,T143A，-[-CrelS32A，Y33:H，Q44A，:R68Y，:R70S，D75Y，]:77K，]:132V，-I-CrelN2I，S32G，Y33H，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，177K，K96R，V105A，-I-CreIS32A，Y33H，F(xiàn)43L，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，177K，V105A，K159R，-1-CrelG19S，N30Q，Y33G,Q38C，R68N,R70S,S72F，I77R,-]:-Cre]:Y33G，Q38C，R68N,R7()S，]:77:R，F(xiàn)87L，-I-CreIN30Q，Y33G，Q38C，F(xiàn)54L，R68N，R70S，177R，-I-CreIN30Q，Q31L，Y33G，Q38C，R68N，R70S，I77R,P83Q，F(xiàn)87L，和-1-CrelN30Q，Y33G，Q38C,R68N，R70S,I77R,V105A。15.權(quán)利要求14的來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶，其為異二聚體。16.權(quán)利要求15的異二聚體大范圍核酸酶，其可通過(guò)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的方法獲得，所述異二聚體大范圍核酸酶包含具有G19S突變的單體，并且在基17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的異二聚體大范圍核酸酶,其包含具有K7E突變的一個(gè)單體和具有E8K突變的另一單體。18.根據(jù)權(quán)利要求14到17中任一項(xiàng)的來(lái)自I-Crel的大范圍核酸酶，其包含至少一個(gè)具有標(biāo)簽或核定位信號(hào)的單體。19.單鏈大范圍核酸酶，其包含根據(jù)權(quán)利要求14到18中任一項(xiàng)所述來(lái)自I-Cre:l:的大范圍核酸酶的第一和第二單體，二者通過(guò)肽連接子連接。20.多核苷酸片段，其編碼權(quán)利要求14到18中任一項(xiàng)的大范圍核酸酶的一個(gè)單體，或編碼根據(jù)權(quán)利要求19的單鏈大范圍核酸酶。21.重組載體,其包含至少一個(gè)權(quán)利要求2()的多核苷酸片段。22.表達(dá)載體，其包含各編碼權(quán)利要求14到18中任一項(xiàng)所述大范圍核酸酶的兩個(gè)單體之一的兩個(gè)多核苷酸片段，所述片段與允許產(chǎn)生這兩種單體的調(diào)節(jié)序列有效連接。23.表達(dá)載體，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求19所述單鏈大范圍核酸酶的多核苷酸片段，所述片段與允許產(chǎn)生所述單鏈大范圍核酸酶的調(diào)節(jié)序列有效連接。24.權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的載體，其包含靶向DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含與權(quán)利要求8所定義之基因組DNA靶序列周圍的區(qū)域具有同源性的序列。25.權(quán)利要求24的載體，其中所述靶向DNA構(gòu)建體包含a)與權(quán)利要求8所定義之基因組DM耙序列周圍的區(qū)域共有同源性的序列，和b)待引入序列，其側(cè)翼為a)中的序列。26.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中定義的--個(gè)或兩個(gè)多核苷酸片段，或包含根據(jù)權(quán)利要求21到25中任一項(xiàng)的載體。27.包含權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中定義的一個(gè)或兩個(gè)多核苷酸片段的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。28.包含權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中定義的一個(gè)或兩個(gè)多核苷酸片段的轉(zhuǎn)基因植物。29.藥物組合物，其至少包含權(quán)利要求14到19中任一項(xiàng)所述大范圍核酸酶、權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中定義的一個(gè)或兩個(gè)多核苷酸片段或者權(quán)利要求21到25中任一項(xiàng)的載體。30.權(quán)利要求29的組合物，其還包含靶向DNA構(gòu)建體，所述靶向DNA構(gòu)建體包含修復(fù)目的基因組位點(diǎn)的序列，其側(cè)翼是與所述基因組位點(diǎn)具有同源性的序列。31.權(quán)利要求14到19中任一項(xiàng)的大范圍核酸酶、權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中定義的--個(gè)或兩個(gè)多核苷酸片段、權(quán)利要求21到25中任一項(xiàng)的載體、權(quán)利要求26的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求28的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求24的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物用于非治療目的的用途，其用于分子生物學(xué)，用于體內(nèi)或體外基因工程,和用于體內(nèi)或體外基因組工程。32.權(quán)利要求14到19中任一項(xiàng)的大范圍核酸酶、權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中定義的一個(gè)或兩個(gè)多核苷酸片段或者權(quán)利要求21到25中任一項(xiàng)的載體用于制備藥物的用途，所述藥物用于在有需要的個(gè)體中預(yù)防、改善或治療遺傳疾病，所述藥物旨在通過(guò)任何手段對(duì)所述個(gè)體施用。33.權(quán)利要求14到19中任一項(xiàng)的大范圍核酸酶、權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中定義的一個(gè)或兩個(gè)多核苷酸片段或者權(quán)利要求21到25中任-項(xiàng)的載體用于制備藥物的用途，所述藥物用于在有需要的個(gè)體中預(yù)防、改善或治療由具有DNA中間體的傳染原所引起的疾病，所述藥物旨在通過(guò)任何手段對(duì)所述個(gè)體施用。34.權(quán)利要求14到19中任一項(xiàng)的大范圍核酸酶、權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中定義的一個(gè)或兩個(gè)多核苷酸片段或者權(quán)利要求21到25中任一項(xiàng)的載體的體外用途，其用于在生物來(lái)源的產(chǎn)品或旨在用于生物用途的產(chǎn)品中抑制具有DNA中間體之傳染原的增殖、滅活或消除所述傳染原,或用于消毒物體。35.權(quán)利要求33或權(quán)利要求34的用途,其中所述傳染原是病毒。36.權(quán)利要求31到35中任一項(xiàng)的用途,其中所述大范圍核酸酶、多核苷酸、載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物與權(quán)利要求24中定義的靶向DNA構(gòu)建體相關(guān)聯(lián)。37.權(quán)利要求14到19中任一項(xiàng)的大范圍核酸酶、權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中定義的一個(gè)或兩個(gè)多核苷酸片段或者權(quán)利要求21到25中任一項(xiàng)的載體作為骨架用于改造出其他大范圍核酸酶的用途。38.產(chǎn)生來(lái)自I-Crel的異二聚體大范圍核酸酶的方法，所述大范圍核酸酶基本不含有由于所述異二聚體大范圍核酸酶的每種單體結(jié)合所產(chǎn)生的兩種同二聚體中的至少一種,所述方法包括在細(xì)胞中共表達(dá)來(lái)自:卜cre:[的異二聚體大范圍核酸酶的兩種單體，其中兩種單體之一包含G19S突變。全文摘要本發(fā)明提供了增強(qiáng)來(lái)自I-CreI的大范圍核酸酶切割活性的方法，所述方法包括對(duì)選自以下的至少一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變I-CreI的19位甘氨酸、54位苯丙氨酸、87位苯丙氨酸、79位絲氨酸、105位纈氨酸和132位異亮氨酸，本發(fā)明還提供了所述方法用于制造切割目的DNA靶標(biāo)的大范圍核酸酶的應(yīng)用，用于基因組療法(治療遺傳疾病)和基因組工程(產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物和重組細(xì)胞系)的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N9/22GK101784658SQ200880102206公開(kāi)日2010年7月21日申請(qǐng)日期2008年6月6日優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日發(fā)明者克里斯托夫·佩雷斯-米紹,西爾韋斯特·格里佐,阿格內(nèi)斯·古布勒申請(qǐng)人:賽萊克蒂斯公司