專利名稱：HIV-1輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體地涉及了一種Hiv-I輔助蛋白 Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
人類免疫缺陷型病毒 1 型(Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)屬于單股正鏈核糖核酸(RNA)逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviridae) ,Virion infectivity factor(Vif) 是HIV-I的輔助蛋白，含有190-240個氨基酸，其分子量為23KDa，產(chǎn)生于HIV-I病毒復(fù)制晚期。Vif存在于幾乎除了馬貧血病毒之外的所有慢病毒中。一旦缺失或突變，HIV-I病毒侵染“非允許性細(xì)胞”比如淋巴細(xì)胞、原代人T-細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞系HUT78后就不能產(chǎn)生有感染力的病毒。而在“允許性細(xì)胞”中比如SupTl、CEM-SS、293T、Hela2CD4、C0S7中產(chǎn)生的病毒則具有感染性。異核體實驗證明Vif可以克服細(xì)胞中的一種限制因子。2002年， Sheehy等人從非允許細(xì)胞系CEM及與其關(guān)系密切相關(guān)的允許性細(xì)胞系CEM-SS的cDNA文庫中進(jìn)行差減分析(subtractive hybridization screen)，發(fā)現(xiàn)非允許性細(xì)胞中存在一種特異的細(xì)胞因子，即CEM15/AP0BEC3G。并且若將AP0BEC3G過表達(dá)于允許性細(xì)胞中，那么其就會變成非允許性細(xì)胞。Vif蛋白發(fā)揮作用具有種屬特異性，它能將本種屬的AP0BEC3G和 AP0BEC3F多聚泛素化，從而將其降解。并且HIV-I中的Vif蛋白都高度保守，但不同亞型差別較大。如果利用Vif蛋白或是核酸疫苗，可能會有效中和Vif蛋白，并且誘發(fā)較強的細(xì)胞免疫，從而有效抑制HIV病毒的作用。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前較完善的高效異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，操作簡便、細(xì)胞生長速度快、可以進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，而且能對重組蛋白進(jìn)行正確的折疊和翻譯后加工，活性更高。其氧化酶(AOXl)基因啟動子是一種強啟動子，能控制AOXl基因在其中高效表達(dá)。并且PPIC9K含有分泌型信號肽，可以有效的將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外， 相對于釀酒酵母，無過度糖基化，并且利于蛋白純化和收集。目前，Vif蛋白已經(jīng)在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，但至今還未表達(dá)出可溶的Vif蛋白，且尚未見在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的報道。鑒于畢赤酵母表達(dá)的優(yōu)點，構(gòu)建Vif酵母表達(dá)載體，并利用畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，獲取一種穩(wěn)定存在的融合蛋白非常必要。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)尚不能表達(dá)可溶Vif蛋白的缺陷，提出了一種表達(dá)HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的方法，利用巴斯德畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，具有可獲得穩(wěn)定存在的 Vif融合蛋白的有益效果。本發(fā)明利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白具有生產(chǎn)成本低、更接近真核蛋白、并且非常適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)步之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了一種HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法，其特征在于，依次包括以下步驟
(1)構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-Vif-Fc ；(2)轉(zhuǎn)化和篩選表達(dá)Vif-Fc融合蛋白的重組畢赤酵母；
(3)表達(dá)Vif-Fc融合蛋白。本發(fā)明HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法中，所述步驟(1)依次包括以下步驟
a)PCR 擴(kuò)增 HIV-I Vif 基因；
b)將步驟a)得到的PCR產(chǎn)物與含人IgG4Fc片段基因的重組質(zhì)粒pKS_Fc進(jìn)行I 和I雙酶切，并16 ！過夜連接，獲得pKS-Vif-Fc ；
c)將所述pKS-Vif-Fc和pPIC9K進(jìn)行I和Λ^ I雙酶切，并16 °C過夜連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif-Fc。本發(fā)明HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法中，所述步驟a)Vif基因PCR 的引物序列如下
引物 1 5 ‘ -CCGGAATTCATGGAAAACAGATGGCAGGTG-3 ‘； 引物 2 5 ‘ -CGCGGATCCGTGTCCATTCATTGTAT-3 ‘。本發(fā)明HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法中，所述步驟a)中，以PNL432 質(zhì)粒為模板，所述Vif基因全長為579 bp。本發(fā)明Hiv-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法中，所述步驟(2)中的轉(zhuǎn)化是指將所述重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif-Fc酶切線性化、磷酸化處理后，純化、回收；然后和畢赤酵母GS115感受態(tài)共置于冰上冷卻后進(jìn)行電擊；經(jīng)加入預(yù)冷的山梨醇后，涂布于MD平板，經(jīng)孵育，克隆得到His陽性酵母轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明Hiv-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法中，所述步驟(2)中的篩選是指將所述His陽性酵母轉(zhuǎn)化子涂布濃度為0-4. Omg/ml的G418平板，篩選得到高G418抗性的陽性酵母轉(zhuǎn)化子，提取基因組，PCR擴(kuò)增其中的^Vox 1基因，得到2200 bp和1800 bp兩個條帶，即篩選得到甲醇利用快型陽性酵母轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法中所述酶切線性化采用內(nèi)切酶Ml I，所述回收是采用酚/氯仿抽提方法，所述電擊的條件為電壓1500-1700V，電阻 400 Ω，電容 25uF,時間 4-5. 5ms。本發(fā)明HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法中，所述步驟(3)依次包括以下步驟將所述甲醇利用快型陽性酵母轉(zhuǎn)化子，接菌于YPD中，搖菌；再接菌于BMGY中，搖菌過夜至對數(shù)期；然后在4°C下離心，去掉上清后，用BMMY重懸菌體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)；收集上清得到所述Vif-Fc融合蛋白。本發(fā)明HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法中，所述誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)中，每隔M h加甲醇至終濃度至0. 5%。本發(fā)明HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法中，以小鼠抗HIV-I Vif多克隆抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，通過Western Blot鑒定所述Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)。本發(fā)明利用基因工程的方法構(gòu)建了能夠穩(wěn)定存在并利于純化的畢赤酵母表達(dá)菌株，可表達(dá)一種HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白。本發(fā)明方法有利于對Vif蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)、 生物學(xué)功能及免疫的研究。本發(fā)明HIV-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法包括如下步驟
1.重組表達(dá)載體pPIC9K-Vif-Fc的構(gòu)建； (I)HIV-I Vif基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)Vif基因的序列設(shè)計引物如下
引物 1 :5' -CCGGAATTCATGGAAAACAGATGGCAGGTG-3‘(劃線部分為&0R I 酶切位點) 引物2:5' -CGCGGATCCGTGTCCATTCATTGTAT-3‘(劃線部分為及拙H I酶切位點) 以PNL432質(zhì)粒為模板，引物1和引物2為上下游引物，PCR擴(kuò)增579 bp的Vif全長基因。(2)將PCR產(chǎn)物與實驗室保存的含人IgG4 Fc片段基因的重組質(zhì)粒pKS_Fc同時進(jìn)行I和及I雙酶切，并進(jìn)行16 °C過夜連接。(3)經(jīng)酶切鑒定，Vif基因正確插入pKS-Fc相應(yīng)酶切位點中，獲得重組質(zhì)粒 pKS-Vif-Fc。將構(gòu)建成功的pKS-Vif-Fc和pPIC9K同時進(jìn)行I和Λ^ I雙酶切，并進(jìn)行16 °C過夜連接。酶切鑒定正確后，測序正確的重組質(zhì)粒即為pPIC9K-Vif-Fc。2.表達(dá)Vif-Fc融合蛋白的重組畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和篩選；
(1)將經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif-Fc用5 / I酶切線性化，磷酸化處理后，利用酚/氯仿抽提的方法，對線性化的重組質(zhì)粒進(jìn)行回收，測定濃度和純度，OD260/ OD28tl=L 8 1. 9，將 5-20 μδ (體積為 5_10 μ )線性化的 pPIC9K_Vif_9K 和 80 μ 畢赤酵母 GS115感受態(tài)加入電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置5 min后，迅速電擊，立即加入1 ml預(yù)冷的山梨醇， 然后涂布至5塊MD平板，30 ！孵育平板至克隆長出。(2)所得的His陽性轉(zhuǎn)化子涂布不同濃度的G418平板(濃度分別為0，0. 5，1. 0， 2.0，4.0mg/ml)，篩選到高G418抗性的陽性克隆。提取重組酵母基因組，PCR擴(kuò)增iVoxl基因，若能擴(kuò)增得到兩個條帶(2200 bp和1800 bp)者則為甲醇利用快型，若只能擴(kuò)增得到一條帶(1800 bp)者則為甲醇利用慢型。3. Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)和鑒定。將篩選得到的甲醇利用快型陽性轉(zhuǎn)化子，1%接菌于YPD中，觀-30 V，250 rpm搖菌對h，l%接菌于BMGY中，28-30 "C, 250 rpm搖菌過夜至對數(shù)期，即0D600=2_6。然后4 V 1500-3000 rpm離心5 min，去掉上清后，用同體積的BMMY重懸菌體，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每隔M h加甲醇至終濃度至0. 5%以繼續(xù)誘導(dǎo)，檢查培養(yǎng)基的量，防止因蒸發(fā)作用，培養(yǎng)基體積減少。培養(yǎng)三天后收集上清。將所收集的上清利用蛋白濃縮試劑進(jìn)行濃縮，進(jìn)行SDS-PAGE分析。并且以自己制備的小鼠抗HIV-I Vif多克隆抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，Western Blot鑒定Vif-Fc融合蛋白在酵母陽性重組子中的表達(dá)情況。


圖1為本發(fā)明方法中重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Vif_Fc構(gòu)建流程圖。圖2為HIV-I Vif基因PCR擴(kuò)增圖譜，第一泳道為DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為2000 bp, IOOObp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp)，第二泳道為 PCR 產(chǎn)物。圖3為重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif_Fc酶切鑒定圖譜。第一泳道為為DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為2000 bp, IOOObp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp),第二泳道為 ^coR I和漢警H I雙酶切后的pPIC9K-Vif-Fc，第三泳道為未酶切的pPIC9K_Vif_Fc。
圖4為重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif_Fc酶切鑒定圖譜。第一泳道為DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為2000 bp, IOOObp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp)，第二泳道為 ^coR I和Λ^ I雙酶切后的pPIC9K-Vif-Fc，第三泳道為未酶切的pPIC9K_Vif_Fc。圖5為利用HIV-I Vif特異性引物進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定。第一泳道為DL 2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為2000 bp, 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp), 第二泳道為GS115的鑒定結(jié)果，第二泳道為GS115/pPIC9K轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果，第三泳道為 GS115/pPIC9K-Vif-Fc 陽性轉(zhuǎn)化子。圖6為利用AOXl通用引物進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化子的表型鑒定。第一泳道為5000 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上而下依次為4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 500 bp)，第二泳道為GS115的鑒定結(jié)果，第三泳道為GS115/pPIC9K轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果，第四泳道為GS115/pPIC9K-Vif-Fc陽性轉(zhuǎn)化子。圖7為酵母表達(dá)的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。第一泳道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為130 KDa, 100 KDa, 70 KDa, 55 KDa, 40 KDa)，第二泳道為 GS115/pPIC9K 轉(zhuǎn)化子的電泳結(jié)果，第三、四泳道為GS115/pPIC9K-Vif-Fc轉(zhuǎn)化子的分析結(jié)果。圖8為酵母表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot檢測結(jié)果。第一泳道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為94 KDa, 66.2 KDa, 45 KDa, 33 KDa)，第二泳道為 GS115/pPIC9K 轉(zhuǎn)化子的結(jié)果，第三泳道為GS115/pPIC9K-Vif-Fc轉(zhuǎn)化子的分析結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步描述，以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1
本實施例是本發(fā)明方法中重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif-Fc的構(gòu)建，具體過程如下
1.以質(zhì)粒PNL432為模板，以引物1和引物2分別為上下游引物，PCR條件為95。C2 min，94 "C 45 s，55 "C 30 s，72 "C 1 min，30 個循環(huán)后，72 "C 1 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過 1% 瓊脂糖凝膠電泳圖譜，如圖2所示，在500-750bp之間可見一特異性DNA條帶(約579bp)。切膠回收PCR產(chǎn)物并進(jìn)行過柱純化，得到純化的PCR產(chǎn)物。引物 1:5' -CCGGAATTCATGGAAAACAGATGGCAGGTG-3‘(劃線部分為&0R I 酶切位占)
引物2:5' -CGCGGATCCGTGTCCATTCATTGTAT-3‘(劃線部分為及拙H I酶切位點)
2.將回收的PCR產(chǎn)物和含人IgG4Fc片段基因的重組質(zhì)粒pKS-Fc同時進(jìn)行I 和I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行回收后，16 °C連接過夜，經(jīng)過酶切鑒定，確認(rèn)得到重組質(zhì)粒pKS-Vif-Fc。本發(fā)明中，重組質(zhì)粒pKS-Fc是以克隆載體質(zhì)粒pBluescript II KS(+)為骨架，在 BamEI和Afoi I酶切位點間插入人IgG4 Fc片段基因(651bp)。該重組質(zhì)粒pKS_Fc為本實
驗室保存。3.將重組質(zhì)粒pKS-Vif-Fc和pPIC9K同時進(jìn)行I和Λ^ I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行Vif-Fc和線性pPIC9K的回收，然后將Vif-Fc和pPIC9K進(jìn)行16 °〇連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)菌后，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切鑒定，其酶切鑒定圖譜見圖3和圖4。如圖3所示，重組質(zhì)粒經(jīng)I和漢3 H I雙酶切后可見約579bp DNA條帶(第 2泳道)，為HIV-I Vif基因片段。如圖4所示，重組質(zhì)粒經(jīng)I和Λ^ I雙酶切后可見約1269bp DNA條帶(第2泳道)，為HIV-I Vif-Fc融合基因，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-Vif-Fc。重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif_Fc經(jīng)過測序正確，與其已知序列一致。實施例2
本實施例為將實施例1中的重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif-Fc純化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)，具體過程如下
1.重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif-Fc的線性化和純化
(1)將重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif-Fc用Ml I進(jìn)行單酶切線性化，并將其磷酸化處理。(2)將線性化的重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif_Fc用酚氯仿以1:1的體積比抽提兩次， 12000 rpm 離心 10 min。(3)將上層溶液用同體積的氯仿抽提一次，12000 rpm離心10 min。(4)將上層溶液取出，用2. 5倍冷乙醇在-20 °C下放置30-60 min。(5)離心分離回收沉淀，12000 rpm離心5 min。(6)用200 μ 70%冷乙醇洗凈，12000 rpm離心2 min。減壓干燥。(7)用20 μ 以下的TE Buffer溶解沉淀。測定本實施例中所得重組質(zhì)粒的濃度和純度，OD260/OD280=l. 8^1. 9。2.酵母感受態(tài)的制備方法
(1)將GSl15劃板，挑單克隆至YPD溶液中培養(yǎng)Mh ；
(2)1%接菌于100ml YPD溶液中，搖菌至0D600為1. 3-1. 5，；
(3)分裝至2個50ml離心管中，4 "C 1500 rpm離心5 min，每管加50 ml預(yù)冷的滅菌水懸?。?br> (4)4 "C 1500 rpm離心5 min，每管加25 ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；
(5)4"C 1500 rpm離心5 min，每管加2 ml預(yù)冷的1 M山梨醇懸浮細(xì)胞；
(6)40C 1500 rpm離心5 min，每管加盡量少的預(yù)冷的1 M山梨醇懸浮細(xì)胞，80 μ 每
管分裝。3.線性pPIC9K-Vif_Fc轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)
(1)將電轉(zhuǎn)杯預(yù)冷半小時，將5-10μ 溶解的線性DNA (含5-20 Pg)與80 μ 畢赤酵母GS115感受態(tài)同時加入電轉(zhuǎn)杯中；
(2)冰上放置5min，進(jìn)行電擊4 ms，電阻400 Ω，電容25 uF，電壓1700 V ；
(3)立即加入1ml預(yù)冷的1 M山梨醇至杯中，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入滅菌的離心管中；
(4)200 μ 每份涂布MD平板，30 ！孵育平板至克隆長出。實施例3
將實施例2平板上長出的克隆進(jìn)行抗性篩選和表型鑒定及誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定，步驟如
下
1.篩選高G418抗性多拷貝陽性酵母轉(zhuǎn)化子
(1)將MD上長出的單克隆接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個孔加入200 μ YPD培養(yǎng)液，30
°C靜置培養(yǎng)對h。
(2)取5μ1菌液接種至新的每孔195 μ YPD培養(yǎng)液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，30 V
靜置培養(yǎng)對h。重復(fù)一次。(3)取 2 μ 菌液分別接種至含 0、0. 5、1. 0、2. 0、4. 0 mg/ml 的 G418 YPD 平板上，30 ！倒置培養(yǎng)至長出單克隆菌落，得到高G418抗性的陽性酵母轉(zhuǎn)化子。2.酵母基因組鑒定方法
(1)挑上述步驟(3)所得單克隆搖菌16-24h，取1 ml菌液，2500 rpm離心5 min ；用 500 μ PBS，懸浮沉淀，2500 rpm離心3 min ；用100 μ TE緩沖液，溶解沉淀，用沸水煮10 min ；-80 °C冷凍30 min ；再次沸水煮10 min ；
(2)利用特異性引物1和引物2進(jìn)行PCR，擴(kuò)增條件為95V 5 min, 94 V Imin, 55 "C 1 min, 72 "C 1 min，30 個循環(huán)后，72 "C 繼續(xù)延伸 10 min。
引物 5y -CCGGAATTCATGGAAAACAGATGGCAGGTG-3·' 引物 2: 51 -CGCGGATCCGTGTCCATTCATTGTAT-3 1 (3)利用AOX通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 °C 5 min, 94 °C lmin,55 V 1 min, 72 V 3 min，30 個循環(huán)后，72 V 繼續(xù)延伸 10 min。
5' -AoxI 引物5'-GAC TGG TTC CAATTG ACAAGC-3'
…V I , V …·.......
3' -AoxI 引物5'-GCAAAT GGC ATT CTG ACATCC-3'
“'^^V WvWV^V I , V ·■........3.酵母陽性克隆的表達(dá)
(1) 1% 接菌 pPIC9K-Vif-Fc/GS115 于 3 ml YPD 中，28-30 "C 250 rpm 搖菌 24 h。(2)1%接菌于20 ml BMGY中，28-30 "C, 250 rpm搖菌過夜至對數(shù)期，即 0D600=2-6。(3)4 "C 1500-3000 rpm，離心5 min，取上清，用等體積的BMMY重懸菌體，進(jìn)行誘
導(dǎo)表達(dá)。(4)每M h，加甲醇至終濃度0. 5%以繼續(xù)誘導(dǎo)，檢查培養(yǎng)基的量，確保正確加入甲醇，以防蒸發(fā)作用減少培養(yǎng)基的體積。(5)分別在0 h，6 h, 12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h，84 h，96 h，取 1 ml 培養(yǎng)基
至EP管中，用于分析表達(dá)水平及確定收集細(xì)胞的最佳時間，在室溫下，12000 rpm離心2_3
mirio經(jīng)實驗可知，7 即三天后可收獲酵母陽性克隆表達(dá)的Vif-Fc融合蛋白。4.目的蛋白的鑒定
(1)將所取的上清液利用蛋白濃縮試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行初步濃縮，其步驟依次是在蛋白樣品中加入5倍體積的提取緩沖液，混勻后室溫靜3 min, 離心。沉淀中加入3倍體積的純水，混勻后離心，溶液分為兩相，蛋白位于兩相之間。棄上層相，加入純乙醇，振蕩后離心，棄上清，蛋白沉淀位于管底，加入適量雙蒸水重懸蛋白質(zhì)沉淀。(2)在經(jīng)初步濃縮的蛋白質(zhì)樣品中加入上樣緩沖液，煮樣后，離心，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，其結(jié)果如圖7所示，GS115/pPIC9K-Vif-Fc轉(zhuǎn)化子的表達(dá)產(chǎn)物在70kDa_100kDa之間和40kDa-55kDa之間有特異性蛋白條帶(第3和第4泳道)，可能為Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物或糖基化后的產(chǎn)物，而空載體轉(zhuǎn)化菌GS115/pPIC9K未見特異性條帶(第2泳道)；
(3)以自制的小鼠抗HIV-I Vif多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗小鼠抗體為二抗， Western Blot鑒定Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)其結(jié)果如圖8所示，GS115/pPIC9K_Vif-Fc轉(zhuǎn)化子的表達(dá)產(chǎn)物在66. 2kDa-94kDa之間和45kDa_66. 2kDa之間有特異性顯色帶(第3泳道)， 可能為Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物或糖基化后的產(chǎn)物，而空載體轉(zhuǎn)化菌GS115/pPIC9K未見特異性顯色帶(第2泳道)。根據(jù)SDS-PAGE 電泳圖譜和 Western Blot 鑒定結(jié)果，GS115/pPIC9K_Vif_Fc 轉(zhuǎn)化子的表達(dá)產(chǎn)物有兩條特異性蛋白帶，其中位于相對分子量40 KDa-55 KDa的蛋白是HIV-I Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物，而位于相對分子量70 KDa-100 KDa的蛋白可能是Vif-Fc融合蛋白表達(dá)時經(jīng)N-和0-糖基化修飾后的產(chǎn)物。
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權(quán)利要求
1.一種Hiv-I輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法，其特征在于，依次包括以下步驟(1)構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-Vif-Fc；(2)轉(zhuǎn)化和篩選表達(dá)Vif-Fc融合蛋白的重組畢赤酵母；(3)表達(dá)Vif-Fc融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)依次包括以下步驟a)PCR 擴(kuò)增 HIV-I Vif 基因；b)將步驟a)得到的PCR產(chǎn)物與含有人IgG4Fc片段基因的重組質(zhì)粒pKS_Fc進(jìn)行 ^coR I和I雙酶切，并16 ！過夜連接，獲得pKS-Vif-Fc ；c)將所述pKS-Vif-Fc和pPIC9K進(jìn)行I和Λ^ I雙酶切，并16 °C過夜連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif-Fc。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟a)Vif基因PCR的引物序列如下引物 1 5 ‘ -CCGGAATTCATGGAAAACAGATGGCAGGTG-3 ‘；引物 2 5 ‘ -CGCGGATCCGTGTCCATTCATTGTAT-3 ‘。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟a)中，以PNL432質(zhì)粒為模板，所述 Vif基因全長為579 bp。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的轉(zhuǎn)化是指將所述重組質(zhì)粒pPIC9K-Vif-Fc酶切線性化、磷酸化處理后，純化、回收；然后和畢赤酵母GS115感受態(tài)共置于冰上冷卻后進(jìn)行電擊；經(jīng)加入預(yù)冷的山梨醇后，涂布于MD平板，經(jīng)孵育，克隆得到His 陽性酵母轉(zhuǎn)化子。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的篩選是指將所述His陽性酵母轉(zhuǎn)化子涂布濃度為0-4. Omg/ml的G418平板，篩選得到高G418抗性的陽性酵母轉(zhuǎn)化子，提取基因組，PCR擴(kuò)增其中的^Vox 1基因，得到2200 bp和1800 bp兩個條帶，即篩選得到甲醇利用快型陽性酵母轉(zhuǎn)化子。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶切線性化采用內(nèi)切酶I；所述回收是采用酚/氯仿抽提方法；所述電擊的條件為電壓1500-1700V，電阻400 Ω，電容 25uF，時間 4-5. 5ms。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)依次包括以下步驟將所述甲醇利用快型陽性酵母轉(zhuǎn)化子接菌于YPD中，搖菌；再接菌于BMGY中，搖菌過夜至對數(shù)期； 然后在4°C下離心，去掉上清后，用BMMY重懸菌體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)；收集上清得到所述 Vif-Fc融合蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)中，每隔Mh加甲醇至終濃度至0. 5%。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以小鼠抗Hiv-IVif多克隆抗體為一抗，以 HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，通過Western Blot鑒定所述Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，公開了一種HIV-1輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)方法，依次包括以下步驟(1)重組表達(dá)載體pPIC9K-Vif-Fc的構(gòu)建；(2)表達(dá)Vif-Fc融合蛋白的重組畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和篩選；(3)Vif-Fc融合蛋白的表達(dá)。本發(fā)明通過畢赤酵母表達(dá)HIV-1輔助蛋白Vif-Fc融合蛋白，具有易于純化，產(chǎn)物穩(wěn)定的特點，具有重要的應(yīng)用前景和實際意義。
文檔編號C12R1/84GK102206670SQ201110086040
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者杜佳妮, 江文正, 龍鳳英 申請人:華東師范大學(xué)